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QUÍMICA BIOLÓGICA AVANZADA PARA INVESTIGADORES DEL ÁREA BIOMÉDICA

Módulo 3 – clase 16
Tabla de contenidos
Tabla de contenidos
ADN recombinante...............................................................................................................................1
Enzimas de restricción..........................................................................................................................2
Incorporación de un fragmento de ADN en un vector.....................................................................4

ADN recombinante
Llamamos ADN recombinante al ADN que está formado por ADN de diferentes orígenes, pudiendo
ser de la misma o diferente especie. En general el ADN recombinante es predominantemente de una
especie y lleva en su genoma uno o más genes de otra especie. A este gen de otra especie que se
halla dentro del genoma de un individuo se lo llama transgén y al individuo que contiene ese
transgén se lo llama organismo transgénico. Como se deduce en base al conocimiento adquirido, un
organismo transgénico, al tener un gen de otra especie, podrá sintetizar al menos una proteína que
no pueden hacer otros organismos de la misma especie y esto le dará alguna diferencia en su
fenotipo. No siempre la presencia de un transgén otorga un beneficio. El transgen puede haber sido
introducido con fin de producir una proteína a más bajo costo o con más sencillez, como ocurre con
bacterias transgénicas que expresan en su genoma un gen de insulina y por ende producen esta
hormona, que luego el hombre purifica y utiliza para el tratamiento de la diabetes. Otro caso de
organismos transgénicos es el caso de vacas que expresan el gen de la hormona de crecimiento y de
la parathormona, produciendo estas hormonas en la leche y de allí el hombre las purifica con cierta
sencillez para poder tratar enfermedades en que estas hormonas son una parte de la solución. Estas
proteínas generadas por un gen humano introducido en un individuo de otra especie y que luego se
utiliza en aplicaciones de salud se las conoce como proteínas recombinantes humana. A pesar de
haber sido producidas en un organismo muy diferente al humano, su estructura primaria es igual a
la proteína que se halla en el humano y por ende no tiene posibilidades de rechazo como puede
ocurrir con otras proteínas utilizadas en tratamiento, pero que son de origen diferente, tal es el caso
de la insulina bovina y porcina. La generación de organismos transgénicos en los cultivos también
es un adelanto importante, generándose cultivos resistentes a ciertas situaciones adversas o bien que
pueden crecer en presencia de herbicidas que eliminan la maleza.
De manera simplificada vemos la Figura 4. El organismo 1 tiene un gen 1 que le permite sintetizar
una proteína 1 que le dará cierta función. Dicha función no puede ser realizada por el organismo 2
ya que no tiene dicho gen, ni ninguno que le permita sintetizar una proteína que cumpla de manera
alternativa la función. Si obtenemos el gen 1 del organismo 2 y se lo colocamos en el ADN del
organismo 2 y logramos que este gen se exprese, entonces el organismo 2 será un transgénico y
podrá sintetizar la proteína y cumplir la función que antes no podía hacer. Utilizamos el término
transfección para hacer referencia al proceso de incorporación de material genético dentro del
genoma de otra célula.
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organismo 1 organismo 2

proteína 1

gen 1

ADN1 ADN2

transfección
transgén
organismo 2 transgénico

proteína 1

gen 1

ADN2
Figura 1. Transfección de un gen del organismo 1 al organismo 2. El transgén posibilita al
organismo 2 sintetizar la proteína 1 que originariamente no podía.

Si bien esta recombinación genética puede ocurrir naturalmente, el hombre ha hecho de esta
práctica una herramienta con un desarrollo tecnológico y aplicaciones inimaginables. Se llama
ingeniería genética a la parte de la ciencia que se dedica a esta rama y está a cargo en general de
profesionales de campos de la ciencia muy variado. Para lograr extraer genes de un especie e
introducirlos en otros se utilizan principalmente enzimas que en la naturaleza tienen particularmente
el rol de cortar y reparar el ADN. Las enzimas de restricción son las herramientas centrales en este
proceso de recombinación genética.

Enzimas de restricción
Son enzimas de origen bacteriano que estos microorganismos tiene naturalmente para defenderse de
virus que pueden atacarlas. Estas enzimas producen el corte de la hebra de ADN en segmentos
específicos conocidos como dianas de restricción. Estas enzimas además tienen la capacidad de
metilar el ADN y este es el recurso para que la enzima de restricción no corte el propio ADN, ya que
estará metilado en las posición de corte. Una vez obtenido el ADN de un organismo, se corta con
determinadas enzimas de restricción para obtener el gen en cuestión (gen1), por otra parte se corta con
la misma enzima de restricción otro ADN conocido como vector que servirá para introducir el gen1
dentro del organismo 2. Luego este vector, portando el gen1 se introduce dentro del organismo 2 y si se
tiene éxito que dicho gen se introduzca dentro del ADN del organismo 2, tendremos un organismo
transgénico que ahora tiene en su genoma el gen1 que no tenía originariamente, y como consecuencia
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produce la proteína 1. Es clave en este proceso disponer de las enzimas de restricción y los vectores.
Entre estos últimos se hallan los plásmidos que son ADN circular que se utilizan para introducir el
ADN en otros organismos. No son los únicos vectores, también se pueden utilizar cósmidos y virus
que cumplen funciones similares.

organismo 1 organismo 2

gen 1

enzima de
restricción

vector

enzima de
restricción proteína 1

gen 1

Figura 1. Las enzimas de restricción aislan el gen del ADN de una especie y también cortan otro
ADN conocido como vector de clonación. Con otras enzimas se introduce el gen en el vector y
luego éste en otra célula.
Las enzimas de restricción pueden producir extremos cohesivos o romos. Los extremos son cohesivos
cuando las dos hebras de ADN quedan de diferente largo, mientras que son romos cuando quedan del
mismo largo, Figura 2. Las enzimas de restricción cortan habitualmente en zonas palindrómicas, es
decir que se leen de la misma manera sobre una hebra como en la complementaria. En la Figura 2, la
enzima de restricción cortó en la secuencia TTAA de la hebra superior. La secuencia de bases de la
hebra inferior es TTAA, siempre leyendo la secuencia en sentido 5'->3'. En el caso inferior, aunque el
extremo es romo, la secuencia de bases de la hebra superior es GGGCCC y en la inferior GGGCCC.
Las enzimas de restricción son purificadas a partir de bacterias y los nombres habitualmente tienen tres
letras que identifican el microorganismo, una tercer letra que identifica la cepa del microorganismo y
luego un número romano que indica el orden en que fueron aisladas. Por ejemplo EcoRI indica que fue
aislada del microorganismo Escherichia coli, cepa RY13 y fue la primera identificada, de allí que
termine en I.
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3' TAC GCG CGC CGC TTC GAA TTC AAA CCC GGG TGC CCT 5'
5' ATG CGC GCG GCG AAG CTT AAG TTT GGG CCC ACG GGA 3'

enzima de restricción

3' TAC GCG CGC CGC TTC G AA TTC AAA CCC GGG TGC CCT 5'
5' ATG CGC GCG GCG AAG CTT AA G TTT GGG CCC ACG GGA 3'

extremo cohesivo

3' TAC GCG CGC CGC TTC GAA TTC AAA CCC GGG TGC CCT 5'
5' ATG CGC GCG GCG AAG CTT AAG TTT GGG CCC ACG GGA 3'

enzima de restricción

3' TAC GCG CGC CGC TTC GAA TTC AAA CCC GGG TGC CCT 5'
5' ATG CGC GCG GCG AAG CTT AAG TTT GGG CCC ACG GGA 3'

extremo romo
Figura 2. Generación de extremos cohesivos y romos por enzimas de restricción.

Incorporación de un fragmento de ADN en un vector

Supongamos un fragmento de ADN como vemos en la Figura 3. Este fragmento tiene dos dianas de
restricción identificadas por las secuencia TTAA, donde puede cortar una enzima de restricción. Por
lo tanto al actuar la enzima quedará un segmento con dos extremos cohesivos, que se halla resaltada
en rojo. Por otra parte un vector contiene también la dianda de restricción, de manera que al actuar
la misma enzima generará dos fragmentos con los mismos extremos cohesivos. Con los recaudos
químicos y biológicos propios de las metodología de ADN recombinante se puede lograr que el
fragmento se inserte entre los dos extremos cohesivos del vector. De esta manera el fragmento de
ADN queda ahora dentro de un vector que tiene la posibilidad de ser introducido dentro de una
célula.
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TAC CGC CGC TTC GAA TTC AAA CCC GAA TTC CCT
ADN ATG GCG GCG AAG CTT AAG TTT GGG CTT AAG GGA

enzima de restricción

AA TTC AAA CCC G

' G TTT GGG CTT AA
vector
TAC GCG CGC CGC TTC GAA TTC AAA CCC GGG TGC CCT
ATG CGC GCG GCG AAG CTT AAG TTT GGG CCC ACG GGA
enzima de restricción

TAC GCG CGC CGC TTC G AA TTC AAA CCC GGG TGC CCT
ATG CGC GCG GCG AAG CTT AA G TTT GGG CCC ACG GGA

vector con inserto

TAC GCG CGC CGC TTC G AA TTC AAA CCC G AA TTC AAA CCC GGG TGC CCT
ATG CGC GCG GCG AAG CTT
' AA G TTT GGG CTT AA G TTT GGG CCC ACG GGA
Figura 3. fragmentos producidos por una enzima de restricción sobre un ADN y un vector vector.
Abajo se muestra el vector con el fragmento de ADN inserto.

Los vectores de clonación tienen dos sitios de importancia:

1- elemento de selección
2- diana de restricción.
El elemento de selección es un gen que produce habitualmente un compuesto que hace resistente a una
célula a un antibiótico. De esta manera si una bacteria es sensible a un antibiótico, cuando se le
introduce el gen deseado, también se le introducirá el gen que le da resistencia al antibiótico. Por ende
si las bacterias se cultivan en un medio con el antibiótico en cuestión, solo vivirán las que han recibido
el vector con el gen que le da resistencia y el gen que nos interesa. Así, tenemos un organismo
transgénico que al dividirse multiplicará el gen en cuestión. A esto se lo llama clonado de genes.
En la Figura 4 vemos un ejemplo de clonación de genes y producción de proteínas recombinantes
humanas, en este caso insulina humana. El desarrollo siguiente está esquematizado y simplificado para
comprender el tema y adaptarse al nivel de este curso. Disponemos de ADN humano donde se halla el
gen con la información para la síntesis de la insulina, hormona encargada de regular diversas funciones
en el hombre y otras especies. Esta proteína es vital administrarla a seres humanos que padecen algún
defecto que impide sintetizar la proteína en forma normal. Así, con el uso de tecnología de ADN
recombinante, se aisla el gen y se introduce en un vector. Este vector se introduce en una bacteria que
no expresa dicho gen y, si el proceso es exitoso, la bacteria será ahora resistente al antibiótico y por otra
parte producirá la insulina humana. Colocando a estas bacterias en un medio de cultivo con el
antibiótico, la bacteria se dividirá por mitosis y además duplicará y transcribirá su ADN, generando
insulina, la cual podrá ser purificada y preparada para su administración a humanos con dicha proteína
deficiente.
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ADN humano

gen insulina bacteria

bacteria

insulina humana
Figura 4