Resumen técnico

Un método mejorado para el ADN de Vitis

vinifera L.
Extracción de Vinos
Leonor Pereira, 1 * Henrique Guedes-Pinto, 2 y Paula Martins-Lopes 3

Resumen: La calidad y el valor del vino dependen en gran medida de la variedad de uva,
que es de primordial importancia en la identificación del vino . El objetivo del presente
trabajo fue mejorar un protocolo de extracción de ADN de vino y, posteriormente, la
identificación de variedades de vid. Este método mejorado es el resultado de varios métodos
de extracción desarrollados previamente y permite de manera efectiva la obtención de
grandes cantidades de ADN de alta calidad que presenta una relación óptima de 260/280. El
ADN de la variedad Grapevine extraído del vino fue amplificable con un cebador de SSR
específico. Este procedimiento fue aplicable para los vinos tintos y blancos comerciales
monovarietales y antiguos. El potencial de este método mejorado depende de su uso para la
rastreabilidad como parte de la protección de los intereses del consumidor y del productor.

Palabras clave: vino, extracción de ADN, identificación de vid, marcador SSR, trazabilidad

La calidad del vino y el valor de mercado dependen de la variedad de la vid, junto con otros factores
como el territorio y el enólogo. El vino se hace generalmente de una o más variedades de las especies
Euro-Pean Vitis vinifera L. Dependiendo de la región de producción de vino, especialmente si es un
vino de Denominación de Origen (DO), solo se permite un número limitado de variedades. La
inclusión de otras variedades solo está permitida en porcentajes legalmente definidos. El hecho de que
diferentes variedades de uva puedan usarse en la producción de vino es en sí mismo un atractivo para
las prácticas fraudulentas. Se han desarrollado técnicas científicas y directrices legislativas para la
trazabilidad de la uva, el mosto y el vino a fin de garantizar el origen del producto y detectar el fraude
y el etiquetado incorrecto.

Los métodos utilizados para la identificación varietal de la vid o la determinación del origen
geográfico de la uva comprenden varias características, como los perfiles de proteínas de mosto
(Moreno -Arribas y otros 1999, Pueyo y otros 1993, González-Lara y otros 1989), antocianinas
(García-Beneytez et al. al. 2003, Revilla y otros 2001), aminoácidos (Vasconcelos y Chaves das Neves
1989), compuestos aromáticos (Muñoz-Organero y Ortiz 1987), y sustancias químicas elementos
(Coetzee y Vanhaecke 2005, Almeida y Vasconcelos 2003, Monaci et al., 2003). Estos métodos
requieren mucho tiempo y están influenciados por diversos parámetros, como la composición del
suelo, las condiciones climáticas, las metodologías de vinificación y el envejecimiento del vino.

El ADN de la vid puede extraerse de cualquier parte de la planta, aunque el material preferido son las
hojas jóvenes (Lodhi et al., 1994). Varios estudios han reportado la capacidad de extraer y genotipar ADN
de diferentes productos de vid, incluyendo jugo de uva (Faria et al., 2000), mosto de uva (Faria et al., 2008,
Baleiras-Couto y Eiras-Dias 2006, Rodríguez-Plaza et al. 2006), vinos experimentales recolectados
inmediatamente después del final de la fermentación (Baleiras-Couto y Eiras-Dias 2006, García-Beneytez
y otros 2002, Siret y otros 2002), y muestras de vino envejecido (Drábek et al., 2008 , Nakamura y otros
2007, Savazzini y Martinelli 2006). Sin embargo, la extracción eficiente de ADN y la amplificación de
mostos y muestras de vino sigue siendo difícil. Estudios previos plantearon la hipótesis de que estas
dificultades podrían deberse a varios procesos implicados en la elaboración del vino, como la decantación,
la clarificación y la filtración, que eliminan por completo el ADN de la vid (García-Beneytez y otros, 2002).
El desarrollo de protocolos de extracción de ADN utilizando vino como muestra para la identificación y / o
diferenciación varietal de vid es una actividad que vale la pena. La detección de V. variedad era vinif- por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando vino El ADN se ve obstaculizado por la cantidad y calidad
insuficientes de ADN molde obtenido después de la extracción, dada la degradación que sufre el ADN de la
planta durante el proceso de fermentación (Savazzini y Martinelli 2006, Faria et al., 2000). Existen otras
restricciones, incluida la interferencia de polisacáridos y polipéptidos en bebidas y la coexistencia de sustancias
pigmentarias como polifenoles, todas las cuales interfieren o incluso inhiben la ADN polimerasa durante la PCR
(García-Beneytez y otros 2002, Siret et al., 2000). ) Sin embargo, varios estudios han intentado superar estas
dificultades (Drábek et al., 2008; Nakamura et al., 2007; Savazzini y Martinelli, 2006). La estrategia seleccionada
para este estudio incluyó la recolección de informes protocolos y elegir el enfoque más adecuado para definir
un protocolo de extracción de ADN del vino que sería adecuado para la amplificación por PCR.

MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de ADN. Hojas de V. vinifera variedades Tinta Roriz y Fernão Pires se obtuvieron de los
viñedos de la Universidad de Trásos-Montes y Alto Douro, Vila Real, Portugal, y se utilizaron como
estándar. Se utilizó un método CTAB establecido (Doyle y Doyle 1987) para la extracción de ADN de la
hoja.

Dos vinos monovarietales producidos a partir de las variedades Tinta Roriz (rojo) y Fernão Pires (blanco)
se recolectaron al final del proceso de fermentación. Tres vinos tintos comerciales combinados (2006 Torre
de Ferro, 2005 Vinha do Côro Reserva y 2004 Estremadouro Reserva) y tres vinos blancos combinados
comerciales (2007 Porta da Ravessa, 2006 Caves Santa Marta y 2005 Monte Novo) se compraron en un
local mercado de cal. Las etiquetas de estos vinos identificaron que las variedades Fernão Pires y Tinta
Roriz, entre otras (Tinta Barroca, Tinta Amarela, Touriga Franca, Roupeiro, Arinto, Malvasia Fina,
Gouveio e Cerceal), se utilizaron en su producción, aunque no hubo información dado sobre el porcentaje
de cada variedad.

Las muestras de vino se precipitaron en tubos de centrifugación de plástico (35 ml), utilizando 10 ml de
muestra y 0,7 vol de 2-propanol (Merck, Darmstadt, Alemania) y se mantuvieron a -20 ° C durante 2
semanas, después de lo cual el crudo El ADN se recogió como un precipitado por 30 minutos de
centrifugación a 4000g a temperatura ambiente (Hettich Universal Zentrifugen D-7200, Tuttlingen,
Alemania). El sedimento se disolvió en 750μl de tampón de extracción precalentado [20 mm
etilendiaminotetraacético ácido (EDTA), 10 mM tris- (hidroximetil) aminometh-ane- hidrocloruro (Tris-
HCl) pH 8,0, 1,4 M cloruro de sodio (NaCl) y 2 % (p / v) de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB;
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), incluido justo antes del uso, 1% (v / v) de 2-mercaptoetanol (Sigma-
Aldrich), 2% (p / v) ) polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich) y proteinasa K (20 mg / ml; Sigma-
Aldrich)] mediante agitación vorticial breve. Las muestras se incubaron a 65 ° C durante 60 min. Se añadió
un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1) (v / v) a la muestra, seguido de centrifugación
a 13,000 g durante 15 minutos a 4 ° C (Biofuge Fresco Heraeus, Kendro Laboratory Products, Hanau,
Alemania). La capa superior se transfirió a otro tubo y las muestras se trataron con RNasa (10 mg / ml,
MBI Fermentas, Burlington, Canadá) a 37ºC durante 30 minutos. El ADN se precipitó con 0,6 volúmenes
de 2-propanol frío y se incubó a -20 ° C durante la noche. Después de la precipitación, el ADN se recogió
por centrifugación a 10.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. El ADN se disolvió en 300 μl de TE (Tris-HCl
10 mm, EDTA 1 mm, pH 8,0). Se añadió un volumen igual de fenol neutro (Sigma-Aldrich) y se
homogeneizó. La capa superior se transfirió a otro tubo de centrífuga después de la centrifugación a
13,000 g durante 15 minutos a 4 ° C. El ADN se precipitó con 0,6 volúmenes de 2-propanol frío y se incubó
a -20 ° C durante la noche. Después de la precipitación, el ADN se recogió por centrifugación a
10.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. El sobrenadante fue descartado y el sedimento de ADN se lavó con
tampón (76% de etanol, 10 mm acetato de amonio) durante 5 min. El sedimento de ADN se secó a
temperatura ambiente, se eluyó en 50 μl de TE y se mantuvo a -20 ° C hasta su uso.

Un método comercial de extracción de ADN, DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), cinco
métodos académicos (Drábek et al., 2008, Nakamura et al., 2007, Baleiras-Couto y Eiras-Dias 2006,
Rodríguez-Plaza et al., 2006 , Savazzini y Martinelli 2006), y el protocolo descrito en este estudio se utilizó
para probar cada una de las muestras comerciales de vino. Estos métodos se compararon en términos del
volumen inicial de la muestra de vino, la concentración promedio de ADN y el rendimiento total de ADN.
 Cuantificación y calidad del ADN. La concentración de ácido nucleico y la calidad del extracto se
determinaron usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilm-ington,
DE). Todas las mediciones se repitieron tres veces, presentando el valor promedio.

Análisis de microsatélites de uva. Análisis de ADN extraído de hojas de uva, vino monovarietal y vino
comercial se realizaron utilizando loci de microsatélites VrZAG79 (Sefc et al., 1999). El cebador directo se marcó
en el extremo 5 'con un fluorocromo (5 -carboxi-fluoresceína; 5-FAM) compatible con el sistema de análisis
Beckman (Beckman Coulter, Fullerton, CA), sintetizado por Sigma-Genosys (Woodlands, TX).

Condiciones de PCR. ¿Las reacciones de PCR se realizaron en un 20 l que contenía 10 x tampón de

PCR que contiene NH 4 SO 2, MgCl 2,5 mM 2, vol 10? M cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 0,5
U de Taq polimerasa (MBI Fermentas), 0,3 M de cada cebador VrZAG79, y 40 ng ADN extraído de hojas
y vinos monovarietales y comerciales. PCR se realizó en un T Gradient 96 cycler (Whatman-Biometra,
Göttingen, Ger-many). Las condiciones de PCR para el ADN de las hojas fueron las siguientes:
desnaturalización inicial a 95 ° C / 5 min, seguida de 35 ciclos con un perfil de temperatura de 95 ° C / 20
s, 61 ° C / 30 s, y 72 ° C / 30 s, y un paso de extensión final a 72 ° C / 5 min. Para el análisis de ADN de
vinos monovarietales y comerciales, se aplicaron 45 ciclos.

Determinación del tamaño alélico Separación del amplificado Los productos se llevaron a cabo
mediante electroforesis capilar en un secuenciador automático Beckman Coulter con la ayuda de estándares
de tamaño interno (CEQ DNA Size Standard Kit-400; Beckman Coulter) utilizando el paquete de software
CEQ 8000 fragment analysis system (Beckman Coulter).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Extracción de ADN. Un método consistente de extracción de ADN de vino es la base de cualquier
evaluación basada en marcadores de la composición varietal del vino. Para superar las dificultades
encontradas en todo el proceso de extracción, es esencial desarrollar o mejorar un protocolo de extracción
de ADN del vino. Como este es un protocolo mejorado, es necesario justificar algunas
opciones. Inicialmente, las muestras de vino (comercial) se precipitaron en varias escalas de tiempo: 24 y
48 horas y una y dos semanas. El presente protocolo se aplicó a todos los tiempos de precipitación y los
resultados mostraron que para los vinos blancos comerciales hubo una disminución pronunciada en el
rendimiento (31%), mientras que para los vinos tintos comerciales la disminución fue solo del 7% cuando
se compararon 25 horas y dos semanas (Tabla 1). Si en muestras de vino tinto no es significativo se
encontraron diferencias en términos de los rendimientos totales de ADN, con respecto a la escala de tiempo
utilizada para la precipitación, en lo que respecta a la amplificación por PCR, se encontraron diferencias claras
entre las muestras de vino blanco y rojo; todas las muestras de vino blanco fueron amplificables por PCR,
mientras que las muestras de vino tinto fueron solo amplificables cuando se precipitaron durante dos
semanas. Por lo tanto, las precipitaciones durante dos semanas se prefirieron a todas las demás escalas de tiempo.

La constitución y la concentración de los componentes del buffer de extracción variaron ampliamente entre
los protocolos revisados. Solo se eligió un detergente catiónico (CTAB), por su capacidad de disolver las
membranas y aumentar la precipitación de ADN con altas concentraciones de NaCl; CTAB también reduce
la contaminación de polisacáridos de muestra. El rendimiento de ADNasa se inhibió mediante la adición
de Tris -HCl y EDTA. Se eligió 2-mercaptoetanol para promover la desnaturalización de proteínas y
eliminar polifenoles. Se usó PVP debido a su efecto antioxidante y su capacidad para eliminar
polisacáridos. Las concentraciones utilizadas en el presente protocolo se adaptaron a las características de
la muestra. El protocolo implica la adición de cloroformo: alcohol isoamílico e incluye fenol y pro-teinasa
K para facilitar la separación de las proteínas de la cromatina.

El presente protocolo se comparó con otros seis métodos de extracción de ADN (Tabla 2). El kit Qiagen
DNeasy Plant no era adecuado para la matriz del vino, y aunque se muestran los resultados, no se ingresan
en la siguiente presentación de resultados. El protocolo descrito en este estudio presentó el mayor
rendimiento y las concentraciones de ADN, aunque se hagan con la muestra de volumen más pequeña. El
presente protocolo necesita solo una muestra de vino de 10 ml para la extracción de ADN, una gran ventaja
en comparación con otros métodos que requieren un volumen de muestra que varía de 30 a 400 ml (Drábek
et al., 2008, Nakamura et al., 2007, Baleiras-Couto y Eiras-Dias 2006, Savazzini y Martinelli 2006).
Se proporciona información adicional con respecto a las proporciones 260/280 y 260/230. Una vez más, el
presente protocolo presenta los valores óptimos para la calidad del ADN (Tabla 2), lo que puede explicar
por qué las muestras son amplificables, ya que ninguna de las otras muestras tenía valores bajos para
260/280 y las relaciones 260/230 fueron amplificables por PCR.

En términos de tiempo total de extracción, este método describe completamente los pasos requeridos. En
todos los protocolos disponibles en la literatura, algunas especificaciones no se dan (por ejemplo,
incubación, precipitación, centrifugado y tiempos de lavado), y por esa razón el tiempo de extracción es
variable y no puede determinarse de manera precisa. Por lo tanto, la comparación entre métodos no es
posible.

Cuantificación y pureza de plantillas de ADN. Las mediciones realizadas con el espectrofotómetro

NanoDrop revelaron altas concentraciones de ADN genómico y la pureza de todas las muestras extraídas
de hojas de vid y vinos mixtos monovarietales y comerciales (Tabla 3). Por lo tanto, este estudio demuestra
que el ADN de V. vinifera permanece disponible en muestras de vino incluso después de la fermentación y
otros procesos de vinificación, dado que las muestras de vino se recolectaron en el final del proceso de
fermentación o de dos a seis años después del embotellado, contrariamente a informes anteriores (Drábek
et al., 2008, Nakamura et al., 2007, Baleiras-Couto y Eiras -Dias 2006, Savazzini y Martinelli 2006, Garcia-
Beneytez y otros, 2002 Siret et al. 2002).

Tabla 1 Precipitación del vino en 2 propanol durante 2 semanas, 1 semana, 48 horas y 24 horas en vinos comerciales
blancos y tintos. Los resultados se refieren a la concentración y el rendimiento de ADN genómico, teniendo en cuenta
los valores promedio.

Muestra ADN (ng / μL) rendimiento

2 semanas
vino blanco 229 11,450
vino tinto 481 24,050
1 semana
vino blanco 200 10,000
vino tinto 483 24,150
48 horas
vino blanco 189 9,450
vino tinto 480 24,100
24 horas
vino blanco 157 7,850
vino tinto 447 22,350

Tabla 2 Comparación de siete métodos diferentes de extracción de ADN, evaluación de la cantidad inicial de vino,
Promedio de concentración de ADN, relaciones 260/280 y 260/230, y rendimiento total de ADN.

Volumen inicial [ADN] g (ng / Relación Relación Rendimiento

Método (mL) μL) 260/280 260/230 (ng)
Baleiras-Couto y Eiras-Dias
2006 400 25.7 1.34 0.36 2,570
Rodríguez-Plaza et al. 2006 15 13.2 1.23 0.29 264
Drábek et al. 2008 40 11.5 1.19 0.18 575
Nakamura et al. 2007 30 148.4 1.37 0.32 4,452
Savazzini y Martinelli 2006 45 98.3 1.43 0.38 4.915
Qiagen DNeasy Mini Kit de
Plantas 2 1.6 0.98 0.34 80
Protocolo actual 10 268.2 1.74 1.79 13,410

Tabla 3 Cuantificación y extracción de ácido nucleico evaluación de la pureza de muestras de hojas de vid y
muestras de vinos monovarietales y comerciales.
El fenol se utiliza con frecuencia en los métodos de extracción de ADN y aumenta el riesgo de
contaminación. Sin embargo, este reactivo tiene una absorbancia máxima de 270 a 275 nm, que es cercana
a la del ADN, y la contaminación con fenol a veces imita tanto mayores rendimientos como pureza debido
a un cambio ascendente en el valor a 260, dando resultados engañosos. Otros contaminantes como
polisacáridos, proteínas, solventes y sales también están presentes y se absorben a 280, 270 y 230
nm. Teniendo en cuenta las propiedades de toxicidad y contaminación del fenol, se eliminó del protocolo
de extracción de ADN en un primer enfoque, pero los resultados revelaron un rendimiento y una calidad
del ADN pobre. Por lo tanto, la extracción con fenol demostró ser crucial para una buena extracción de
ADN de muestras de vino.

Los espectros UV realizados con el espectrofotómetro NanoDrop en dos muestras de ADN genómico
extraído del vino, uno que presenta contaminación con fenol y otro utilizando el método descrito aquí sin
contaminación, demostraron que el protocolo mejorado superó el problema de contaminación con fenol
(Figura 1). El espectro UV también mostró que otras contaminaciones generalmente presentes cuando el
ADN se extrae de estas matrices se eliminaron eficientemente de la plantilla de ADN, respaldada por la
pureza del ADN de muestras de vino monovarietal y comercial, que presentaron valores entre 1.71 y 1.81
para vinos tintos y entre 1,72 y 1,79 para los vinos blancos (Tabla 3).

Tabla 4 Genotipo de microsatélites usando locus nuclear VrZAG79, expresado como tamaño de alelo y rango de
tamaño, en pares de bases obtenidos con ADN de hojas de uva, vinos monovarietales y vinos comerciales.

ADN 260/280 260/230

Muestra (ng / μL) proporción proporción
Hoja
Tinta Roriz 716 1.93 2.10
Fernão Pires 981 1.94 2.12
Vino monovarietal
Tinta Roriz 465 1.71 1.94
Fernão Pires 343 1.79 1.98
Vino comercial rojo
Torre de Ferro, 2006 452 1.81 1.79
Vinha do Côro Reserva, 2005 330 1.71 1.81
Estremadouro Reserva, 2004 260 1.73 1.77
Vino blanco comercial
Porta da Ravessa, 2007 206 1.74 1.66
Cuevas Santa Marta, 2006 197 1.72 1.97
Monte Novo, 2005 164 1.73 1.82

Amplificación del ADN genómico del vino. Reacción de PCR puede ser inhibido por varios
factores. En las muestras de vino, la presencia de compuestos fenólicos y polisacáridos es la principal causa
de impasse de la PCR (García-Beneytez y otros 2002, Siret et al., 2000, 2002). Otras dificultades
relacionadas con la falla de PCR son las pequeñas cantidades de ADN y su estado de degradación (Drábek
et al., 2008, Savazzini y Martinelli 2006). Se han adoptado varias estrategias para superar estos problemas,
como mejorar los métodos de extracción de ADN y el uso de marcadores de microsatélites de cloroplastos
en el vino (Baleiras-Couto y Eiras-Dias 2006) y PCR en tiempo real (Drábek et al., 2008, Savazzini y
Martinelli 2006). En este protocolo, tanto la concentración como la pureza fueron altas. La combinación de
precipitación con 2 propanol, tratamiento enzimático, extracción con fenol y cloroformo y varios lavados
fue positiva y favorable para la reactivación de la PCR, eliminando todos los posibles contaminantes
encontrados en las muestras de vino blanco y rojo.

Con el fin de confirmar la presencia de ADN de V. vinífera, se seleccionó una combinación de cebadores
adecuados para la reacción de PCR. La primera condición para la selección de cebadores fue que no
amplificaría el ADN de los microorganismos responsables de la fermentación alcohólica y maloláctica,
como levaduras y ácido láctico y / o bacterias de ácido acético, y sería específico para la identificación
varietal de la vid. Aunque se aceptaron seis cebadores nucleares SSR como marcadores universales para el
genotipado de vid (proyecto de investigación GENRES 081, www.genres.de/vitis/vitis.htm), se eligió solo
un cebador (VrZAG79), dado que el objetivo principal de este estudio fue demostrar que el método de
extracción de ADN mejorado era eficiente y que el ADN extraído era adecuado para la amplificación por
PCR de segmentos específicos de ADN de V. vinífera.
Todas las muestras se amplificaron con éxito (Figura 2). Los tamaños de alelos de microsatélites VrZAG79
se obtuvieron en un secuenciador automático y se expresan en pares de bases (Tabla 4). Los tamaños
microscópicos alélicos encontrados en el vino monovarietal las muestras (roja y blanca) corresponden a las
detectadas en las muestras de hojas. Para los vinos combinados comerciales, se encontró un rango de
tamaño en lugar de un tamaño alélico específico, que es aceptable para los vinos comerciales, dado que
varias variedades de vid fueron utilizadas en su producción. Además, se presentan los pro-archivos
VrZAG79 proporcionados por el secuenciador automático para muestras de vino mezcladas monovarietales
y comercialmente mezcladas rojas (Figura 3) y blancas (Figura 4). Además de los alelos esperados (Tinta
Roriz en vinos tintos y Fernão Pires en vinos blancos), los vinos mezclados comerciales presentaron otros
picos, posiblemente pertenecientes a otras variedades presentes en estas mezclas. No fue posible asociar la
intensidad de los picos (alelos) con la proporción relativa de cada variedad en el vino, ya que son
desconocidos. Varios autores informaron la amplificación por PCR de muestras de vino experimental
recolectadas inmediatamente después de la fermentación (García-Beneytez y otros 2002, Siret y otros
2002), de vinos estabilizados 8 meses después de la fermentación y listos para embotellar (Baleiras-Couto
y Eiras- Dias 2006) y de vinos monovarietales de 24 meses (Savazzini y Mar-tinelli 2006). Sin embargo,
se encontraron dificultades en todos los informes al amplificar el ADN genómico debido a la baja cantidad
e integridad del ADN. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre la amplificación por PCR
utilizando ADN extraído de vino embotellado de 6 años.

Figura 1 Espectro UV realizado por el espectrofotómetro

NanoDrop ND-1000 que muestra ( A ) contaminación con
fenol y ( B ) la ausencia de fenol y / u otras contaminaciones
en muestras de ADN de vino.

Figura 2 Perfil de amplificación obtenido con el cebador nuclear

VrZAG79. Carriles a, b, c: vinos blancos comerciales; d: vino blanco
monovarietal; e: variedad Fernão Pires (hoja), f: control
negativo. Carriles A, B, C: vinos tintos comerciales; D: vino tinto
monovarietal; E: Tinta Roriz (hoja); F: control negativo; M: marcador
molecular GeneRuler 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas).
Figura 3 Gráficos de los rastros de señal de tinte
proporcionados por el Fragmento CEQ 8000 Software de
análisis para la amplificación de microsatélites de ADN en loci
VrZAG79 para vino tinto monovarietal ( A ) y comercial ( B )
utilizando la variedad Tinta Roriz.

Figura 4 Gráficos de los rastros de señal de tinte

proporcionados por el Fragmento CEQ
8000 Software de análisis para la amplificación de
microsatélites de ADN en loci VrZAG79 para vino
blanco monovarietal ( A ) y comercial ( B ) usando
la variedad Fernão Pires.
CONCLUSIONES

Este estudio informa sobre un método de extracción de ADN de V. vinifera eficiente a partir de
muestras de vino adecuadas para la amplificación.

Los principales pasos para un protocolo exitoso de extracción de ADN del vino fueron la precipitación de
2-propanol, el tratamiento con enzimas, la extracción con fenol y cloroformo y varios lavados. Aunque
estos pasos se realizaron igualmente en muestras de vino tinto y blanco, deben seguirse estrictamente para
las muestras de vino tinto. Con las muestras de vino blanco, el tiempo de precipitación puede reducirse
significativamente sin afectar la eficiencia de la PCR.

Con respecto a los datos previamente publicados en la literatura, el método descrito aquí presenta varias
ventajas: tipo de muestra: permite una extracción eficiente y la consecuente amplificación del ADN
genómico extraído de los vinos después de varios años de embotellado; volumen inicial de muestra: permite
la extracción de ADN de vid de un volumen de muestra de vino de solo 10 ml, lo que es ventajoso en
comparación con los volúmenes presentados en la literatura actual; Cantidad y pureza del ADN: la
cuantificación del ADN genómico extraído de muestras de vino reveló una alta concentración y nivel de
pureza, al mostrar que el ADN de V. vinifera permanece después de todo el proceso de
vinificación; Inhibición de la reacción de PCR: elimina todos los contaminantes posibles, proporcionando
un perfil de amplificación inequívoco; y amplificación de ADN: todas las muestras de ADN fueron
amplificables con un marcador específico, lo que demuestra que el ADN corresponde a una variedad de vid
y excluye la hipótesis de pertenecer a un microorganismo.

La calidad, el valor y el precio del vino dependen de varios factores, pero una de las principales
características es la variedad de vid. Por lo tanto, es importante que los consumidores confíen en el
etiquetado del vino. Un sistema de trazabilidad eficiente es imperativo. En el mercado del vino, la
correspondencia entre el producto final y las variedades de vid puede establecerse a través de la tecnología
de marcadores moleculares, que requiere un método de extracción de ADN confiable y reproducible. Este
protocolo puede proporcionar la base para una metodología de rastreabilidad exitosa para garantizar el
origen del producto y detectar el fraude y el etiquetado incorrecto. La extracción de ADN es el paso más
relevante para un análisis posterior, como la detección de V. vinifera en el vino.