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Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Iztapalapa

División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Estructura y función celular l

Práctica 4. Aislamiento de ADN

Equipo 4.

Grupo BC52.

Alumno/a: Cortes Hernández Claudia Alejandra


Profesor/a: Souza Arroyo Verónica
Introducción:
El ADN (ácido desoxirribonucleico), contiene la información genética de la mayor
parte de los organismos vivos (una excepción son algunos virus, denominados
retrovirus, que utilizan el ARN o ácido ribonucleico para guardar su información
genética).
El ADN está compuesto de nucleótidos (unidades monoméricas de los ácidos
nucleicos), que a su vez están formados por bases nitrogenadas (adenina (A),
citosina (C), guanina (G) y timina (T), una molécula de azúcar de cinco átomos de
carbono (desoxirribosa) que se une a una molécula de fosfato. Desde el punto de
vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido.
Lo que distingue a un nucleótido de otro es la base nitrogenada, por ello la
secuencia del ADN se especifica nombrando la secuencia de sus bases. El ADN
se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en las que las dos hebras
están unidas por puentes de hidrógeno. Una doble cadena de ADN mide de 22 a
26 angstroms (2,2 a 2,6 nanómetros) de ancho. Aunque cada unidad individual
que se preite es muy pequeña, los polímeros de ADN pueden ser moléculas
enormes que contienen millones de nucleótidos. Por ejemplo, el cromosoma
humano más largo, el cromosoma número 1, tiene aproximadamente 220 millones
de pares de bases. Las dos cadenas de ADN se enroscan sobre sí mismas
formando una especie de escalera de caracol, denominada doble hélice.
El modelo de estructura en doble hélice fue propuesto en 1953 por James Watson
y Francis Crick. La importancia de este modelo radica en su consistencia con las
propiedades físicas y químicas del ADN. La conformación adopta el ADN
depende de su secuencia, la cantidad y dirección de superenrollamiento que
presenta, la presencia de modificaciones químicas en las bases y las condiciones
de la solución,tales como la concentración de iones de metales y poliaminas.
El estado físico de de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de
absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600A. El menor grado de absorción se
produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la
desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla, si degradamos este ADN
de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.
El ADN se puede obtener de cualquier célula que posea núcleo. Una gota de
sangre, un trozo de hoja o un cabello aunque no tenga raíz. La extracción se
realiza mediante la aplicación de diversas técnicas, en función de la calidad y
cantidad de este. Se requiere de romper la membrana plasmática para liberar el
contenido de ADN de la célula.

Objetivos:
● Utilizar las propiedades químicas de la molécula de ADN para aislarlo de las
células.
● Determinar el espectro de absorción de esta macromolécula.
Material
● 1 Vaso de precipitados de 100 mL
● 2 Tubos para centrífuga de 50 mL
● Micropipetas y puntas de diferente volumen
● Celdas para espectrofotómetro
● 1 Varilla de vidrio
● 2 Tubos de ensayo
● 1 Embudo de vidrio
● 1 Mortero
● 2 pipeta de 10 mL
● 1 pipeta Pasteur
Reactivos
● Tris
● Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
● Cloruro de Sodio (NaCl)
● Cloroformo-alcohol isoamílico, Etanol
● Dodecil sulfato de Sodio (SDS)
● Citrato de Sodio
Soluciones
● Tris/EDTA/NaCl(50mM:20m:0.3g)
● Solución saturada de NaCl
● Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
● Solución salina de citratos (Citrato de Sodio 0.15M, NaCl 0.15M)
● SDS al 100%
Material Biológico
● 1 guayaba grande
● Gasas
Equipo
● Centrífuga
● Espectrofotómetro

Método:
l. Obtención del ADN.
1. Colocar 30 mL de etanol en un vaso de precipitados de 100 mL. Meter el vaso
con el alcohol en un refrigerador para que esté frío cuando sea requerido.
2. Colocar 15 gr de guayaba en un mortero.
3. Adicionar 5.0 mL de la solución Tris/EDTA/NaCl (50mM:20mM:0.3g)
4. Triturar durante 5 min.
5. Agregar 10 mL de una solución saturada de NaCl y mL de SDS al 10%
6. Continuar macerando durante 5 min mas.
7. Filtrar el macerado a través de varias capas de grasa previamente colocadas
en un embudo de vidrio, NO exprimir las grasas con el fin de obtener mayor
volumen.
8. Recuperar el filtrado en un tubo de centrífuga de 50 mL
9. Adicionar 15 mL de la mezcla cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
10. Tapar el tubo y agitar vigorosamente por 1 min.
11. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 min.
12. Sacar el vaso con el etanol frío.
13. Con una pipeta Pasteur recuperar cuidadosamente el sobrenadante, evitando
tocar el precipitado.
14. Verter el sobrenadante lentamente al vaso de precipitados que contiene los 30
mL de etanol frío.
15. Se observara la formación de hebras de etanol.

ll. Medición del Espectro de absorción del ADN.

1. Con una varilla de vidrio recuperar estas hebras (ADN


2. Dejar escurrir el etanol y colocar la varilla de vidrio en la cual se enrollo el ADN
en un tubo de ensayo.
3. Adicionar al tubo, escurriendo por la varilla 2 mL de la solución salina de citratos
4. Preparar 1 mL de una dilución 1:10 con la solución salina de citratos.
5. Encender el espectrofotómetro y ajustar la longitud de onda a 200 nm.
6. Colocar en una celda para espectrofotómetro 1 mL de la solución salina de
citratos. Esta solución será utilizada como blanco, es decir con este tubo ajustar
el espectrofotómetro a una absorbancia de cero.
7. Hacer lecturas de absorbancia a intervalos de 10 nm hasta llegar a una longitud
de onda 350 nm.
8. Es importante recordar que cada vez que se cambie la longitud de onda se
necesita ajustar a cero de absorbancia con el blanco.

Resultados:
Se observó la formación de hebras en el Las hebras fueron colocadas en
etanol al finalizar el proceso de obtención. un tubo de ensayo con solución de
citratos, se agitó suavemente
hasta
que las hebras no fueran visibles.

Medición del Espectro de absorción del ADN.


Se puede observar que entre 280 y 290 en longitud de onda, fue el pico máximo
de absorción del ADN.

Discusión:
“Los agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la acción
de enzimas nucleasas; (Las nucleasas son enzimas hidrolasa del tipo esterasa que
degradan ácidos nucleicos) ellos capturan los iones magnesio y no permiten que actúen
como cofactores de las nucleasas”.
Creemos que además la lisis, o ruptura de las células, es el primer paso para la
extracción del ADN. Esto se logra mediante el uso de una solución buffer que contenga
solución Tris y EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético). El EDTA se une a cationes
divalentes tales como el calcio y el magnesio. Dado que estos iones ayudan a mantener
la integridad de la membrana celular, la eliminación de estos con EDTA desestabiliza la
membrana.
“La solución Tris, o tri (hidroximetil) aminometano, es una solución buffer biológica
común que se utiliza en todo el proceso de extracción de ADN ya que este es sensible al
pH de cualquier tipo de fuente durante dicho proceso. La solución Tris se utiliza durante
la lisis celular, la eliminación y la precipitación de componentes celulares no deseados
para mantener un pH estable”
“Las altas concentraciones de NaCl se emplean para prevenir la contaminación de la
muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN, pudiendo inhibir la actividad
de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restricción; la base
para la separación de los polisacáridos de los ácidos nucleicos, es su solubilidad
diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los polisacáridos
precipitan bajo la acción de fuerzas centrífugas”.
Además de eso en una solución de cloruro de sodio, la mesa de sal, por ejemplo, la
molécula de cloruro de sodio se separa en iones de sodio y iones de cloro. El ADN, por
otro lado, tiene altas cargas negativas. La carga altamente negativa de la molécula de
ADN es neutralizada por los iones de sodio positivos en la solución. Esta neutralización
de cargas negativas de ADN permite que se precipite en alcohol. Sin la sal, el ADN
permanece cargado negativamente y estará en la parte acuosa de la solución.
“El SDS (Dodecil sulfato de Sodio), que solubiliza proteínas, tejidos y membranas,
evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los desechos o
restos celulares”. El autor recomienda utilizar también: La ARNasa (destruye el ARN) y
las proteasas (destruye las proteínas).
“El cloroformo y el alcohol isoamílico diluye a los compuestos covalentes,
principalmente lípidos”
Otras prácticas de aislamiento del ADN, dicen que para aislar el ADN hay que hacer
que se precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en
alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Además de
permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los
cuales son dejados en la solución acuosa. Nosotros utilizamos etanol.
Una vez obtenido el material genético, es importante determinar el rendimiento mediante
espectrofotometría. La ley de Beer-Lambert indica que la concentración de una
molécula en solución depende de la cantidad de luz absorbida de las moléculas
disueltas. Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y
permite estimar su concentración mediante espectrofotometría. Para estimar la pureza
del ADN se considera la proporción de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Una
proporción de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor
indican la presencia de proteínas.

Conclusión:
Para poder obtener las hebras de ADN, tuvimos que tener los respectivos cuidados y
concentraciones exactas de cada una de las soluciones, al realizar esta práctica
obtuvimos conocimiento de lo que son las soluciones buffer y la importancia que tienen
en los procesos de aislamiento del ADN, así como la importancia de mantener un
proceso con un determinado pH, por que al cambio de este podría alterarse todo y no se
podría obtener el resultado deseado.
Pudimos analizar cada una de las funciones de cada solución y entender el
comportamiento de las células ante la presencia de estas, en este caso más en el
aspecto químico. Otros autores de distintas prácticas recomiendan utilizar otro tipo de
alcohol así como otro tipo de soluciones buffer. Después de leer sobre el tema, el
procedimiento que realizamos con las respectivas soluciones es el más utilizado en la
extracción del ADN para prácticas de laboratorio.
También comprendimos la importancia de la espectrofotometría y el análisis de la
capacidad absorción de la luz del ADN para determinar la pureza de este, así como
aprendimos el manejo y los cuidados que se tienen que tener al utilizarlo.

Cuestionario:
a) ¿Cual fue longitud de onda donde el ADN alcanzó su punto máximo, extraído de
células de guayaba?
Entre 280 y 290 nm.
b) Describir la estructura de los nucleótidos que forman el ADN.
Las unidades monoméricas de los ácidos nucleicos se denominan nucleótidos.
Cada nucleótido está formado por un azúcar de cinco átomos de carbono al cual se une
un grupo fosfato y una base nitrogenada. El azúcar es D-ribosa (para el RNA) o D-
desoxirribosa (para el DNA). El fosfato se une por un enlace fosfoéster al carbono 5 del
azúcar y la base se une al carbono 1. La base puede ser una purina o una pirimidina.
Las purinas del DNA son la adenina (A) y la guanina (G) y las pirimidinas son
la citosina (C) y la timina (T)
Estructura de un nucleótido. En el RNA, un nucleótido está formado por el azúcar D-
ribosa, al cual se unen una base nitrogenada aromática a través del carbono 1 y un
grupo fosfato unido a través del carbono 5, por medio de un enlace fosfoéster. (Los
átomos de carbono del azúcar de un nucleótido se numeran de 1 a 5 para distinguirlos
de los de la base, que se numeran sin el apóstrofe.) En el DNA, el grupo hidroxilo del
carbono 2 se reemplaza por un átomo de hidrógeno, siendo el azúcar la D-desoxirribosa.
Las bases en el DNA son las purinas adenina (A) y guanina (G) y las pirimidinas timina
(T) y citosina (C). En el RNA la timina es sustituida por la pirimidina uracilo (U).
Bibliografía:
● Rogers S.O., Bendish A.J., EXTRACCION OF DNA FROM PLANT TISSUES.
Plant Molecular Biology Manual. A6:1-10.Kluwer Academic Publishers, Belgium,
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● Becker WN, Kleinsmith LJ, Hardin J. “El mundo de la Célula” 6ª ed. Editorial
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● Anzaldúa Arce S. Tolosa Sánchez J. Manual de prácticas de histología veterinaria
3ª edición. Universidad Nacional Autónoma de México, 2003.
● Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los
microorganismos. 10ª Ed. Prentice Hall Iberia. España.