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Autores: Daniel Pimenta Furtado, Igor Barcelos; Karoline Soares Rodrigues; Rafael Yuri
Medeiros Barbosa, Yuri Souza Beleli.
v max [ S ]
v o= (1)
( K M + [ S ])
em que KM é a constante de Michaelis-Menten, Equação 2:
( K −1 + K 2 )
KM= (2)
K1
e vmax é a sua velocidade máxima que depende da constante de velocidade k2, Equação 3:
1 1 KM 1
= + . (4)
v v max v max S
Geralmente as enzimas são ativas numa faixa restrita de pH e na maioria dos casos há
um pH ótimo definido.
O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado utilizando-se altas concentrações
de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os valores de pH; e o efeito do pH
sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à
medida que o pH varia. Como as enzimas são proteínas contém muitos grupos ionizáveis,
elas existem em diferentes estados de ionização, por isso, a atividade catalítica é restrita a
uma pequena faixa de pH.
A atividade da enzima deve ser então medida no pH ótimo. A estabilidade de uma
enzima ao pH depende de muitos fatores como: temperatura, força iônica, natureza química
do tampão, concentração de vários preservativos (por exemplo, glicerol, compostos
sulfídricos), concentração de íons metálicos contaminantes, concentração de substratos ou
cofatores da enzima e concentração da enzima.
Para representar o efeito do pH sobre a cinética enzimática, pode ser usado o simples
modelo, do estado de ionização de sítio ativo (BAILEY e OLLIS, 1986), descrito abaixo:
E ↔ E - ↔ E -2
Onde:
E- = forma ativa da enzima;
E, E-2= formas inativa da enzima.
[ H + ][ E - ]
K 1= (5)
[E]
[ H + ][ E -2 ]
K 2= (6)
[ E -]
Onde:
K1 e K2 = constantes de equilíbrio
1
y-=
[ H +] K2 (8)
1+ + +
K1 H
1
pH ótimo = ( pK 1+ pK 2 ) (9)
2
k [ E0]
v max=
1+
[ H +] + K2 (10)
K1 [ H +]
−Ea
K =k 0 e RT (11)
Sendo:
K = constante da velocidade;
T = temperatura absoluta.
2. MATERIAIS UTILIZADOS
Água destilada;
Solução de NaOH (80 g.L-1);
DNS [ácido 3,5 dinitrosalicílico (C7H4N2O7);
Sal de Rochelle [tartarato duplo de K e Na (KNaC4H4O6.4H2O) ;
Solução tampão de acetato de sódio;
Solução tampão de citrato-fosfato no pH 4,5;
Invertase (46 unidades de atividade / mg de sólido);
Glicose;
Sacarose;
Reator de vidro encamisado;
Banho termostatizado;
Tubos de Follin-Wu;
Suporte para os tubos de Follin-Wu;
Bico de Bunsen;
Bacias de alumínio;
Balões volumétricos de 1L;
Pipetas volumétricas de 1 e 2 mL;
Cronômetro;
Espectrofotômetro.
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1. Preparou-se diferentes soluções de sacarose nas concentrações: 10, 20, 30, 50, 70 e 90
g.L-1 com tampão acético com pH igual a 4,5.
2. Posteriormente colocou-se 40 mL de solução de sacarose e 1 ml de água destilada no
reator à temperatura de 30°C e retirou-se uma amostra de 0,5 mL da solução “branco”
e colocou-se em tubo de Follin-Wu com 1mL de DNS.
3. Descartou-se a solução e limpou-se o reator.
4. Novamente, colocou-se 40 mL da amostra (solução de sacarose) no reator e, ao atingir
a temperatura de 30°C, acrescentou-se 1 mL de solução de invertase.
5. Retirou-se 0,5 mL de solução do reator e transferiu-se para tubo de Follin-Wu, no qual
já existiam 1 mL de DNS, em intervalos de tempo de 3 min.
6. Colocou-se os tubos de Follin-Wu em água em ebulição por 5 min. e resfriou-se em
agia fria e completou-se com água destilada até 12,5 mL.
7. Homogeneizou-se a amostra e realizou-se a leitura do BRANCO em
espectrofotômetro.
8. Repetiu-se o mesmo procedimento para as amostras de diferentes concentrações no
reator com a sacarose.
3.3. Influência do pH
Utilizou-se uma solução de sacarose (50 g.L -1) com tampão de citrato-fosfato igual ao
pH de 3.
Os demais procedimentos foram feitos seguindo os mesmos passos de 2 a 7 da
determinação dos parâmetros cinéticos.
Repetiu-se o mesmo procedimento para as amostras com pH iguais a 4; 4,5; 5; 6 e 7.
3.4. Influência da temperatura
Utilizou-se uma solução de sacarose (50 g.L -1) com tampão de citrato-fosfato igual ao
pH de 4,5.
Ajustou-se o banho termostatizado para que o reator atingisse uma temperatura de
20°C. Os demais procedimentos foram feitos seguindo os mesmos passos de 2 a 7 da
determinação dos parâmetros cinéticos.
Repetiu-se o mesmo procedimento ajustando o banho termostatizado com
temperaturas de: 25, 30, 40, 50, 60 e 70°C.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3,5
f(x) = 3,8643 x
3 R² = 0,9994
2,5
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
1,5
0,5
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Absorbância (λ = 540 nm)λ = 540 nm)
Então, com a regressão linear dos dados obteve-se uma relação entre a concentração
de glicose (C) e absorbância (A), equação 13. Os resultados encontrados foram
satisfatórios, pois após a regressão linear dos dados encontrou-se um R² de 0,9994.
C=3,8643 A (13)
0,7
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
1,2
1 f(x) = 0,0702 x
R² = 0,9996
0,8
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
1,8
1,6
f(x) = 0,1088 x
1,4 R² = 0,9993
1,2
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
2,5
2
f(x) = 0,1371 x
R² = 0,9994
1,5
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
1 1 K 1
= + M. (4)
v v max v max S
25
15
1/v
10
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
1/S
4.3. Influência do pH
A Figura 15 apresenta os valores das velocidades de reação para os pH 3, 4,5, 6 e 7, em que
as velocidades enzimáticas foram obtidas pelo comando INCLINAÇÃO do software
Microsoft Excel. Foram realizados experimentos com pH 4 e 5, porém, por não
apresentarem resultados satisfatórios, esses pontos foram excluídos na etapa de tratamento
dos dados.
De acordo com os dados experimentais, o pHótimo é 4,64. O pHótimo também foi obtido
utilizando a equação 10, que com os valores das velocidades de reação foi possível obter K 1
e K2 por meio de uma regressão não linear. A equação 9 apresenta a relação entre K 1 e K2 e
o pHótimo.
k [ E0 ]
v=
1+
[ H +] + K2 (10)
K1 [ H +]
1
pH ótimo = ( pK 1+ pK 2 ) (9)
2
A figura 16 traz a equação 10, com os parâmetros obtidos na regressão, plotada com
os dados experimentais.
0,7
0,6 f(x) = 0,0420 x
0,5 R² = 0,9947
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
2,5
2 f(x) = 0,1391 x
R² = 0,9995
1,5
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
1,5
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
f(x) = 0,1841 x
2,5
R² = 0,9988
2
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
1,5
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
2
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
1,5
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
0,8
0,5
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
Fi
gura 22 – Variação da concentração de glicose com o tempo para o sistema a 64 ºC.
0,4
f(x) = 0,0274 x
0,35 R² = 0,9506
0,3
0,25
Glicose (λ = 540 nm)g/L)
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
tempo (λ = 540 nm)min)
K =k 0 e RT (11)
Ea 1
ln K =ln k 0 − (12)
R T
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
v [g/(λ = 540 nm)L min)]
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
290 300 310 320 330 340 350
T (λ = 540 nm)K)
Os resultados foram divididos em duas regiões. Na primeira região (20, 40, 50 °C)
os resultados têm valores crescentes de velocidade de reação e na segunda região (60, 64,
68 °C) os resultados possuem valores decrescentes de velocidade de reação. A primeira
região a reação acontece de acordo com a energia de ativação (Ea) e a segunda região a
reação ocorre com a enzima em fase de desnaturação, reagindo pela energia de ativação
(Ei). Dos coeficientes lineares e angulares das figuras, obtidos da aplicação da equação
(12), presentes nas figuras 25 e 26, obtém-se os parâmetros buscados.
0
-0,00042 -0,00041 -0,00040 -0,00039 -0,00038 -0,00037
-0,5
-1
-1,5
f(x) = 37650,8093 x + 12,3281
ln(λ = 540 nm)v)
R² = 0,9637
-2
-2,5
-3
-3,5
-1/RT
F
igura 25 – Aplicação da equação de Arrhenius linearizada para obtenção dos parâmetros cinéticos da região
crescente.
0
-0,000362 -0,000360 -0,000358 -0,000356 -0,000354 -0,000352
-0,5
-1
-2
-2,5
-3
-3,5
-4
-1/RT
Figura 26 – Aplicação da equação de Arrhenius linearizada para obtenção dos parâmetros cinéticos da região
decrescente.
REFERÊNCIAS