Práá cticás de Biologíáá Moleculár – Semestre 2016-II

PRÁCTICA N° 5

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

Haciendo uso de técnicas microanalíticas, se puede determinar la concentración de

proteínas en un extracto biológico crudo y con mayor facilidad en una muestra
purificada.

En este aspecto el desarrollo de la espectrofotometría ha permitido calcular la

concentración proteica usando como fundamento la detección de aminoácidos
aromáticos, la presencia del grupo amida característico del enlace peptídico y la
determinación del grupo prostético a una longitud de onda determinada en el caso de
proteínas que lo posean. Así mismo, la asociación del ion cobre o de colorantes como
el azul brillante de Coomasie a las proteínas ha dado lugar a determinaciones que
están en el rango de 1 a 1000 μg.

Es bueno señalar que durante la purificación de proteínas, el monitoreo de la

absorbancia UV a 280 nm es el método más sencillo y de uso generalizado, pues entre
otras ventajas este método permite recuperar la proteína intacta ya que no se le
adiciona ningún reactivo. En cambio los otros métodos como el de Lowry, Biuret y la
técnica de Bradford deben realizarse en presencia de agentes colorantes y que
producen asociaciones irreversibles con la proteína analizada.

Sin embargo, el empleo alternativo de cualquiera de estas técnicas requiere en primer

lugar establecer el protocolo de trabajo considerando las características de la proteína
materia del análisis.

OBJETIVOS

- Conocer los fundamentos de las técnicas de Lowry, Biuret, Bradford y el método

de absorbancia UV para la cuantificación de proteínas.
- Realizar los ensayos experimentales destinados a la aplicación de estos
métodos.
- Establecer comparativamente la sensibilidad de las técnicas en estudio.

MATERIALES

- Espectrofotometro Shimadsu (UV y visible)

- Spectronic 20
- Baño de temperatura
- Reactivo de Biuret
- Reactivo de Bradford
- Solución alcalina
- Reactivo de Folin Ciocalteus (1/6)
- Solución de ovoalbúmina a concentraciones 2, 1 y 0,2 mg/ml
- Tubos 13 x 100 mm (20 por mesa de trabajo)
- Pipetas 1.2 y 5 ml
- Gradilla, plumón marcador de vidrio, papel toalla
PARTE EXPERIMENTAL

I. Método de Lowry

Reactivos (ml) B 1 2 3
Agua destilada 0,5 0,4 0,3 0,2
Ovoalbúmina 0,2 mg/ml --- 0,1 0,2 0,3
Solución alcalina 2 2 2 2
Temperatura Ambiente 15 minutos

Reactivo Folin Ciocalteus 0,5 0,5 0,5 0,5

Temperatura Ambiente 30 minutos

Lectura de Absorbancia a 660 nm

II. Método de Bradford

Reactivos (ml) B 1 2 3
Ovoalbúmina 0,2 mg/ml --- 0,1 0,2 0,3
Reactivo Bradford 1 1 1 1
Temperatura Ambiente 45 minutos

Agua destilada 2 1,9 1,8 1,7

Lectura de Absorbancia a 595 nm

III. Método de Biuret

Reactivos (ml) B 1 2 3
Agua destilada 1 0,6 0,2 ---
Ovoalbúmina 2 mg/ml --- 0,4 0,8 1
Reactivo Biuret 2 2 2 2
Temperatura Ambiente 20 minutos

Lectura de Absorbancia a 550 nm

IV. Método de Absorción UV

Reactivos (ml) B 1 2 3
Agua destilada 3 2,8 2,6 2,2
Ovoalbúmina 1 mg/ml --- 0,2 0,4 0,8
Lectura de Absorbancia a 280 nm

Calcular la concentración de proteína en cada uno de los métodos y el Fc para

cada método y determine el grado de sensibilidad de ellos.
PROBLEMAS

1. De un extracto proteico se toma 0,4 ml para realizar una cuantificación por el

método de Biuret, obteniéndose una absorbancia a 550 nm de 0,285.
Sabiendo que el Factor de calibración es de 0,079. Calcule la concentración de
proteína de dicho extracto.

2. Se toman 350 μl de una solución de proteína a fin de cuantificarla por el método

de Lowry cuyo Factor de calibración es de 5 y se obtiene una transmitancia a
660 nm de 48%. Sabiendo que el extracto inicial contiene 12 ml. Determine la
cantidad total de proteína.

3. Una alícuota de 100 μl es tomada de un extracto proteico para cuantificarla por

un determinado método y se obtiene una transmitancia de 25%. Determine la
concentración de la proteína, sabiendo que su Factor de calibración es de 2.
4. Durante el dosaje de proteína usando 100 μl se obtuvo 35% de transmitancia.
Sabiendo que el FC del método usado es igual a 2 y que el volumen del extracto
es de 24 ml. Determine la concentración de la proteína total del extracto.