Investigación Ciencia & Desarrollo

LA ENZIMA FOSFOFRUCTUQUINASA EN HÍGADO

DE ALPACA

Raúl Paredes Medias)

RESUMEN

Se ha investigado la enzima fosfofrucoquinasa (PKF) en la célula del hígado de alpaca,

midiendo su actividad en un espectrofotómetro en la región ultravioleta a 340 manómetros.
Las curvas obtenidas muestran que esta enzima es alostérica de actividad reguladora de
cooperatividad positiva y negativa. En el citosol del hígado de alpaca estaría regulando
la conservación de la fructosa 6 fosfato (F6P) en fructosa 1;6 difosfato (F-1;6-di P). Al ser
una enzima alostérica es posible que posea, además del centro catalítico, el `otro espacio'
al que se estaría enlazando el efecto o modulador.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas sintetizadas por las
células queactúan como catalizadoras de las reacciones
biológicas. Se caracterizan por su capacidad catalítica
y gran especificidad. Actúan sobre sustancias
denominadas sustratos. La actividad de cierto número
deenzimas requiere la presencia deotros componentes
químicos: los cofactores o coenzimas. Cada enzima
cataliza sólo un tipo de reacción.
El centro activo es la región de la enzima en la
que transcurre la catálisis, uniéndose a él, el sustrato y
los cofactores. Esta unión puedeoriginarmodificaciones
estructurales, tanto en la enzima como en el sustrato.
El modelo de Michaelis-Menten ha tenido un
gran impactosobreel desarrollada laquimicaenzimática
por su simplicidad y amplia aplicabilidad. Sin embargo
laspropiedades cinéticasdemuchas enzimasno pueden
explicarse por el modelo de Michaelis-Menten. Un
importantegrupoestá formado parlas llamadas enzimas
alostéricas que, a menudo, muestran gráficas
sigmoidales de velocidad de reacción v, frente a la
concentración de sustrato [s], en vez de gráficas
hiperbólicas que son las predichas por la ecuación de
Michaelis-Menten.
Las enzimas alostéricas son oligoméricas que
Magister en ingeoieria química
44
actúan como reguladoras del metabolismo. La
modulación en la actividad catalítica es consecuencia
de la unión no covalente de una molécula específica
(ligando) a un centro de la enzima, distinto del centro
catalítico.
La fosfofructoquinasa (PKF) es una enzima
alostérica con peso molecular bastante elevado (380
000). Contienecierto númerodesubunidadesy muestra
una dependencia compleja de su velocidad de reacción
con la concentración de sus sustratos.
La PKF resulta inhibida por concentraciones
elevadas deadenosín trifosfato (ATP), de citrato y de
ácidos grasos de cadena larga. Por otra parte, la PKF
es estimulada por el adenosín difosfato (ADP) o por el
adenosín monofosfato (AMP). Por esto, cuando se
produce en la célula una concentración elevada de
ATP, o cuando se dispone de otros combustibles tales
como los ácidos grasos o el citrato, la 6-
fosfofructoquinasa se inhibe, interrumpiéndose la
glucólisis. Inversamente, si la concentración de ATP
desciende y predominan, por tanto, las de AMP y ADP,
o cuando la concentración de otros combustibles como
el citrato o los ácidos grasos es baja, entonces se
estimula la actividad de la 6-fosfofructoquinasa. Asi, el
comportamiento cinético de la 6-PKF, aunque muy
complejo, se halla extraordinariamente bien adaptado a
la regulación de esta importante etapa de la glucólisis.
En el presentetrabajo, se medirá la actividad de
la enzima fosfofructoquinasa purificada del hígado de
alpaca, variando la concentración del sustrato (fructuosa-
 Ciencia & Desarrollo

6-fosfato). Se realizará dos mediciones a pH diferentes Para la medición de la actividad se procedió

y a partir de los datos se harán los análisis delasiguiente manera:
correspondientes. 1)En una celda de 3,0 ml de capacidad se colocaron los
siguientes reactivos:
2 MATERIAL Y MÉTODOS.
Primera Medición Segunda Medición
Se trabajó con enzima extraída y purificada del Medio de ensayo 2,8 ml 2,8ml
hígado de alpaca.
Enzima 0,08 ml 0,015 ml
Setdilizaron:unacentrilugadora, untermostato, Sustrato 0,003 ml 0,003 ml
espectofotómetro Gilford 240, cronómetro y además, Agua bidestilada 010117 ml 0,182 ml
materiales de laboratorio.
Se usaron: una solución protectora (ATP-FDP- 2)Sepreincubó a30°C en baño Maríaporcinco minutos.
DTT). ATP a,5 mM, AMP 2,0 mM, NACH, TPL, G3PD,
aldolasa, F6P, {NH4) SO4 50%, KCN 1 mM, solución 3)La reacción se inicia con F6P (sustrato) poniendo 3
Poner, NaOH y agualpidestilada. lambdas, correspondientes a 0,003 ml.
La enzima fosfofnictoquinasa purificada se 4)La actividad de la PKF se determinó midiendo el
obtuvo del hígado de alpaca por centrifugación y se cambio de absorbancia a 340 nm (en la región
mantuvosuspendida en sulfatode amonio. Dos mililitros ultravioleta) en el espectrofotómetro Gilford 240.
centrifugaron por 30 minutos, separándose el
sobrenadantedel precipitado, el cual se suspende en 4 3. RESULTADOS
mi de una solución protectora que contiene ATP-FDP-
DTT. CUADRO No. 01 : ABSORBANC1A.9
El medio de ensayo para la reacción se preparó
con los siguientes componentes: pH 6,8 pH 8,0
F - 6P A/min F-6-P A/min
(8) (8)61 (S) (mM)
Medio de ensayo Para una determinación
0,0125 0,0005 0,025 0,0145
0,0250 0,0010 0,050 0,0250
ATP : 1,5 mM 2,86mg
unapizca 0,0500 0,0030 0,100 - 0,0330
AMP : 2,0 mM
NADH : 0,17 mM 0,375mg 0,1000 0,0090 0,200 0,0370
KCN : 1 mM 0,195 mg 0,2000 0,0180 0,300 0,0370
Sol. Potter 1,5m1 0,3000 0,0250 0,400 0,0420
TPI G3PD 0,01m1 0,4000 0,0280 0,500 0,0420
Aidolasa 0,01m1 0,5000 0,0320 0,600 0,0420
Agua bidestilada 2,8ml

CALCULOS
Se lleva á pH 6,8
ACTIVtDAD DE LA PEK (En u ml)
Medio de ensayo Para 25 ensayos La unidad de enzima (u) es la cantidad de
transformación de un mol de sustrato por minuto en
ATP : 1,5 mM 75 mg condiciones normalizadas.
AMP : 2,0 mM una pizca
NADH : 0,17 mM 9,5 mg La actividad de la fosfofructoquinasa se ha
KCN : 1 mM 5,0 mg calculado empleando la siguiente relación:
Sol. Poner (1 45ml
TPI G3PD 0,15 ml
Aldolasa 0,05 ml ~in
Agua bidestilada 70m1 A (u)
2,07 x alícuota de enzima
Se lleva a pH 6,8 donde: Las alícuotas de enzima son para 0,015 ml a pH
6,8 y para 0,030 ml a pH 8,0.
(t)La solución Poner se lleva a pH 8,0 con NaOH y se
completa a 45 mi con agua bidestilada.
45
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CUADRO N: 02; ACTIVIDAD DE LA PEK

CUADRO W 09: VELOCIDAD DE REACCIO N (phi 8,0)
( En U = u moles / min / ml )

pH6 8 pH8,0 (S) X 10 v.,0-3

inm (u mol ¡ mm) --i-ST v
Aminx102 Activ.(U) Aminx102 Activ.(U)
2,50 7,0048 40,00 14,276
0,05 0,016 1,45 0,233 5,00 12,0772 20,00 8,280
0,10 0,032 2,50 0,402 10,00 15,9420 10,00 6,273
0,30 0,096 3,30 0,531 20,00 17,8743 5,00 5,595
0,90 0,298 3,70 0,596 30,00 17,8743 3,30 5,595
1,80 0,579 3,70 0,596 40,00 20,2898 2,50 4,9285
ZSO 0,805 4,20 0,676 50,00 20,2898 2,00 4,9285
2,80 0,902 4,20 0,676 60,00 20,2898 1,60 4,9285
3,20 1,030 4,20 0,676

VELOCIDADES DE REACCIÓN

Las velocidades de reacción se han calculado

empleando la relación siguiente: •
16
A/min
v- 1
2,07

8
Cuadro No. 03
4
(S)x10 eF10 1 1
(u In°1/11 --x10
) los (S) GaTc-v (S) v
I
125 0,2415 -1,90 -1,80 8500 414,7 o 10 20 30 40 50 (S)x10 -2
2,50 0,4831 -1,60 -1,49 40,00 206,9
5,00 1,4493 -1,30 - 0,98 Flg. No. 01: CURVAS ALOSTERICAS DE LA PFK
213,00 68,9
10,00 4,3478 -1,00 -0,41 10,00 23,0 CURVA A: apH 6,8
20,00 8,6956 -0,69 0,11 CURVA B: apH 8,0
5,00 11,5
30,00 12,0772 -0,52 0,55 3,33 8,3
40,00 135.955 -0,39 0,84 2,50 7,4 log
v.-.
-¿:v
50,00 15,4593 -0,30 0.00 2,00 6,0

0,5
donde: Vmax. = 15 4589 x 0 moles/min
o
12 -109 (S)

4 1-ttpit%4
-0,5

-0,904

stimesti pi( -1.5 -0,5

-O 964
in=m50 =1,81
-2,0
Nig
upo de e:~ la (In Fig. No. 02: coeficiente de HUI -1,31
( a pH 6,8)
46
 Ciencia & Desarrollo

1 20
x 10
1191tROIICA UNIBG I

15

10
10

5
5

0 10 20 30 1 5 10 1
1 ki 1°
-18,4 kmB ' •
kM
KmB = 0, 88 a pH 6,8
Fig. N3 03: Valor de KrnA= 5,43 x 102 mM
( a 0413,0) Flg. No. 04

4. DISCUSIÓN estaría regulando en el citosol dala célula del hígado

Al graficar las velocidades de reacción vda la de alpaca, la transformación de la fructosa-e-fosfato
enzima fosfotructoquinasa del hígado de alpaca, en en fructosa 1;6 difosfato (F-1;6-di P) en una
función de la concentración de la fructosa-6-fosfato reacciónanaeróbica (sin oxigeno) de la glucólisis:
(F6P) empleada corno sustrato, no se han obtenido las
clásicas curvas hiperbólicas de Michaehs-Menten, sino
más bien curvas típicas de enzimas alostéricas (fig. N° PFK
01), es decir que esta enzima no muestra la relación F-6-P + ATP —> f 6-di P + ADP
cinéticade Michaelis-Menten entrelaconcentración del Ht Kt
sustrato, la velocidad máxima y la constante Km.

La curva A, sigmoidal, obtenida a pH 6,8 es Una reacción típica de las quinasas

típica de una enzima alostérica de cooperatividad
positiva, mientras que la curva B, obtenida a pH 8,0,
corresponde a una enzima alostérica de cooperatividad
negativa.
El coeficiente de Hill obtenido es de 1,81 (fig.
N°02), un valor por enzima de la unidad; parlo tanto, la
enzima fosfofructoquinasa del hígado de alpaca es una
enzima reguladora de cooperatividad positiva cuando
actúa en un medio cuyo pH es 6,8, de manera que
dependientes de ATF, requiere de magnesio o potasio
para la actividad y no cataliza la reacción inversa.
A partir de la F-16-di P hay sólo dos caminos
metabólicos subsiguientes: una vía es la ruptura de la
F-1;6-di P por acción de la aldolasa para continuar con
la glucólisis hasta la conversión en Glicerol fosfato; la
otra vía es la conversión de nuevo a F-6-P.
47

ATP ADP
F 1;8-di P
- 5. CONCLUSIONES
Aldolasa
n:Iceraldehicloa-P sibihidroxiacetonaP
NADH +
Pi NAD-
Glicerol - P
Cuando sea necesario incrementarla actividad
de la fosfotructoquinasa del hígado de alpaca a un pH
68, será suficiente aumentar la concentración del
sustrato, con lo cual se lograría que la unión de la
primera molécula db sustrato con esta enzima,
intensifique la unión de las moléculas subsiguientes en
los otros centros aetivos a los que se fija á sustrato, en
vista de que los registros naestran una saturación y,
como consecuencia, las actividades ya no se
incrementan (Cuadro N°02).
Teniendo presentequelaconsiantedeMichae-
lis-Menten, Km es la medida de 'a runa o afinidad del
complejoenzima-sustrato (ES), se han calculado corno:
Km, e- 0,88 a pH 6,8 (Flg. N° 04) y Km, e 0,0543 a pH
8,0-(Fig. N°03), significa que a pH 6,81a anzima tiene
una débil ligazón al sustrato, mientras que a pH 8,0
tendrá una fuerte lio!!,!..ura, hecho que es coherente,
pues un centro acata- :atalaja° no es e! sitio donde se
une la enzima, sino t el otro sitio, teniendo presente
que a pl-I 6,8 la enzin en investigación es netamente
alostérica de coopera • dad positiva. Por otra parte, al
ser la enzimafosfofro: aquinasaalostérica puede estar
siendo alterada por n fléculas reguladoras, ligadas a
7. BIBLJOGFUkFIA.
Bohinski, Robert C. 1978, Bioquímica. Ed. Fondo
Educativo Interamericano S. A. Impreso en
E.U.A. p. 362-373.
48.
Ciencia & Desarrollo
centrosdiferenteseloscentroecatalíticos dependiendo
del tiempo de incubad/511,-1a temperatura y la
concentración del sustrato.
Se tia comprobado que la enzima
fosfofructoquinasa del hígado dé alpaca, es una enzima
alostérica de actividad reguladora de cooperatividad •
positiva y, corno tal, estimuladora, cuando actúa a pH
6,8, y de cooPeratividad negativa a pH 8,0.
En el citosól de la célula de hígado de alpaca, la
fostofructopuinasa estaría regulando lá conversión de
la 'fructosa &fosfato (F6P) en fructosa 1:6 difosfato (E-
ter-di P). • '
.
• La ioa-fofructoquinasa del hígado de alpaca, al
ser una enzima alostérica, es posible que posea, además
del centro catártico, el °otro espacio" al que se estaría
enlazando de modo reversible y no covalente, el efecto
o moduladcr.
Para incrementar la actividad de la enzima,
seránecesarioaumentar la concentración de sustrato a
fin delograr la unión de la primera molécula de sustrato
con la enzima.. Con ello se estaría intensificando la
unión de las moléculas subsiguientes en los otros
centros activos. •
El 2,1 óptimo para la axil)n reguladora de la
fosfofructoquinasadel higadodealpacaestaríaalrededot
de 6,8
6. RECOMENDACIONES
La aldea Lama peces, de lafamiliaCamellidae,
es considerada dentro de los rumiantes. - más
propiamente "pseuderumiantee" - una especie de
camélido altoandino que muy poco ha merecido ser
investigada en el nivel celular y, más exactamente, en
el rl-el molecular. Si se denea mejorar la calidad de su
lana y same, así como su p acreación, es recomendable
realizar más investigaciones a partir de la unidad celular
de sus diversos órganos.
Letninger, Albert L. 1978, Bioquímica. Ed.
Omega S.A., Barcelona, 435 p.