Professional Documents
Culture Documents
•La PCR è una metodica sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere
grosse quantità di materiale genetico a partire da piccole quantità
•La PCR insieme alla possibilità di sintetizzare comodamente qualsiasi tipo di
oligo permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero
bersagli molto rari in un genoma complesso
•Una zona specifica di DNA viene bersagliata con due oligo (3’ rivolti l’uno verso
l’altro) che amplificano, tramite la reazione polimerasica, la zona stessa
copiandola in un enorme numero di volte e rendendola visibile e manipolabile per
l’analisi.
•L’amplificazione automatizzata della procedura, la possibilità di utilizzare alte
temperature di esercizio e la possibilità di definire esattamente la sequenza da
amplificare conferisce alla PCR grande sensibilità, specificità e versatilità
•L’amplificazione della sequenza bersaglio è in teoria uguale a 2n, cioè se vengono
effettuati 32 cicli di PCR la sequenza bersaglio si sarà amplificata
232volte(1073741824!!!)
"Beginning with a
single molecule of
the genetic
material DNA,
the PCR can
generate 100
billion similar
molecules in an
afternoon. The
reaction is easy
to execute. It
requires no more
than a test tube,
a few simple
reagents, and a
source of heat.”
K.Mullis
Taq-polimerasi: a 100° è parzialmente denaturata, ma reversibilmente
Thermus aquaticus
Conventional PCR
Ethidium-
Gel
detection
Cosa serve per allestire una
reazione di PCR?
• DNA stampo con la regione da amplificare
• Due primers complementari al filamento senso
ed antisenso del DNA da amplificare
• Taq Polymerasi
• Deossinucleosidi trifosfato.
• Soluzione tampone per garantire un ottimo di
attività e stabilità della DNA polimerasi
• Ioni Mg2+
Primer forward
3’-AAACTAGCCATGAAATTCGATTAAGCCCAAGTTTAAGCCCCAGGCTTAAGGCTA-
5’
5’CGGTACTTTAA3’
Primer reverse
3’CCAGGCTTAAG5’
5’- T TTGATCGGTACTTTAAGCTAATTCGGGTTCAAATTCGGGGTCCGAATTCCGAT-
3’
Step iniziale: 94-96oC per 1-9min se la DNA polimerasi richiede un hot-Start
oC
•
Amplificazione del gene ed ibridazione con sonde
specifiche per allele mutato e normale o
sequenziamento
Diagnosi di malattie infettive
Da:
Sangue/siero
Saliva
Sudore
Feci
Urine
Espettorato
Tamponi oro-faringei
Biopsie
25
20
15
10
0
0 10 20 30 40
Cycle
Soluzioni
• Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale
Il prodotto di PCR è proporzionale al templato
iniziale
Incremento di
fluorescenza
Cicli di PCR
Analisi tramite software
Chimiche fluorescenti
per PCR Real-Time