UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

FACULTAD DE LA SALUD HUMANA

CARRERA DE MEDICINA HUMANA

INFORME DE PRÁCTICAS DEL ESTUDIANTE CON SUPERVICIÓN

DOCENTE

 Alvares Rosa M.

 Bermeo Kevin E.

 Berrezueta Neyser.

 Cohello Sandra.

 Cañar Jessica.

Nombres y  Espinosa German. Módulo/Ciclo: Primer Ciclo

Apellidos:  Loarte Rodrigo. Paralelo: “B”

 Guaillas Antony.

 Mayo Jhoana.

 Palacios Belén.

 Guamán Briggette.

 Marquez Santiago.

* Biología Molecular y
Asignatura: Nro. De Práctica: Nº 1
Genética

Ing. Natalia Morales

Docente: Nro. De Grupo: Grupo 1
Palacio PhD.

* Extracción de ADN, cuantificación e

Título de la Práctica:
interpretación.
 Hora:
Fecha: *19/02/2018 Calificación:
15:00-17:00 H

Objetivos:

- Desarrollar destrezas en la manipulación de las diferentes micropipetas, y los equipos del

laboratorio de Biología Molecular.

- Describir las fases que se precisan para la obtención de los ácidos nucleicos, a partir de

cualquier tipo de célula eucariota.

- Usar los equipos y explicar los procesos que permiten la cuantificación de los ácidos

nucleicos.

Fundamento teórico de la práctica a ejecutar:

* Extracción de ADN.

Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual está

representada como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es

lo que conforma su genoma.

Entre los procedimientos en biología molecular, el más básico es la extracción y purificación

de ácidos nucleicos, para ello se requieren métodos seguros para la separación de estos

componentes de las células, para lograrlo, se utilizan diversos métodos de extracción

dependiendo del tipo de tejido o muestra a emplear.

El primer paso en cualquier protocolo de extracción es el rompimiento del material inicial, ya

sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal, a esta fase se la denomina fase de lisis celular,

pues durante este proceso las interacciones entre las moléculas que conforman la pared de la

membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se

liberen. El método utilizado para romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin

de causar el menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica,

pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la
degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con detergentes de las

membranas celulares.

Fase de digestión: Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una

desproteinización, durante esta fase ocurre la digestión de las proteínas, la proteinasa K

desempeña un papel importante en este proceso pues degrada una proteína llamada histona,

que envuelve al ADN, para liberarlo por completo, esta digestión de proteínas también se puede

llevar a cabo con un solvente orgánico, seguido de una precipitación con isopropanol o etanol

y posterior solubilización con agua o tampón, esto varía dependiendo del proceso de extracción,

lo primordial en esta fase es separar por acción enzimática, las proteínas del ADN.

Fase de eliminación del ARN:

Una vez concluida la digestión con las proteasas, se realiza una digestión con una RNasa para

eliminar en su totalidad la presencia de ARN, la RNasa se utiliza en una concentración de

100mg/ml a una temperatura de 50 ºC (aunque la mayoría de los manuales indican una

incubación con RNasa a 37 ºC).

Fase de lavado o eliminación de impurezas:

Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros contaminantes celulares, esto se realiza

mediante un lavado progresivo con agua libre de nucleasas, proceso necesario para la obtención

de un material genético cada vez más limpio.

Precipitación del ADN: Permite la obtención del ácido nucleico listo para ser almacenado o

diluido a la concentración deseada para su utilización. Este paso se realiza mediante el agregado

de 1 volumen de isopropanol o 2 a 3 volúmenes de etanol. El ADN purificado por medio de

este proceso, está listo para ser utilizado en diferentes aplicaciones, las cuales involucran:

amplificaciones PCR (Reacción en cadena de `Polimerasa)

En un método alternativo de extracción (purificación) de ADN se usan membranas o matrices

a las cuales el ADN se unirá en condiciones específicas, es decir, las células se lisan en una
solución que facilita la unión selectiva del ADN a la matriz, el lisado se aplica a la matriz, y

los contaminantes se eliminan del ADN mediante lavado, por último, la matriz se enjuaga del

ADN con un amortiguador eluyente.

A menudo estas matrices se apilan en diminutas columnas dentro de tubos de centrífuga, para

que los pasos de unión, lavado y elución puedan realizarse de modo eficiente mediante la

aplicación de una fuerza centrífuga.

Cuantificación e interpretación del ADN

Una vez obtenido el ácido nucleico (ADN o ARN) se procede a evaluar su cantidad como su

calidad, para esto utilizamos una serie de técnicas, siendo la más utilizada la

Espectrofotometría., que generalmente, realiza la medición de la cantidad de irradiación de luz

ultravioleta absorbida por las bases nitrogenadas. La espectrofotometría es usada para

identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de un material

o sustancia.

Para cuantificar la cantidad de material obtenido después de una extracción de ácidos nucleicos,

se debe tomar una lectura a longitudes de onda de 260 nm y 280nm. La lectura a 260nm

permitirá calcular la concentración de ácidos nucleicos en la muestra.

La concentración del ADN se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de luz ultravioleta

(UV) a una longitud de onda de 260nm (nanómetros), debido a que las bases púricas y

pirimidínicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a esa longitud de onda. Es

importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento de sus bases (puentes de hidrógeno),

el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario.

La determinación de la pureza del ADN se establece mediante la relación de las lecturas de las

absorbancias a 260nm y 280 nm, es así como la unidad (u) de densidad óptica (DO) a 260 nm

equivale a:

- 50 μg/ml de ADN de doble cadena

 - 40 μg/ml de ADN y/o ARN de cadena simple

- 20 μg/ml de oligonucleótidos.

La proporción de la lectura entre 260 y 280 nm (OD 260/OD280) proporciona una estimación

de la pureza del ácido nucleico. Es así como preparaciones puras de ADN tienen OD

260/OD280 de 1.8. Cuando se trata de ARN el valor OD 260/OD280 es muy cercano a 2.0. Si

hay contaminación con proteínas u otras soluciones empleadas durante la extracción, el valor

de la proporción es menor a 1.8 y no es posible cuantificar de manera precisa el DNA.

Las preparaciones puras de ADN y/o ARN tienen una relación de DO de 260/280 nm de 1,8 a

2,0.

Equipos: Instrumentos:

* Sistema de purificación de * Micropipetas

ADN genómico * Puntas de micropipetas

Wizard SV ® * Tubos de micro centrífuga o Eppendorf de 2 ml

* Agitador tipo vórtex * Tubos de micro centrifuga o Eppendorf (Tubo de mix) de 1,5

* Centrífuga de Eppendorf ml

de 13200 rpm. * Conjunto de Mini columnas (Tubo Eppendorf y mini

* Espectrofotómetro columna)

NanoDrop 2000. * Tubos de microcentrífuga para elución

Materiales e insumos: Sustancias y reactivos:

* Guantes de nitrilo * 400 μl (microlitros) de muestra de ganglios

* Vasos de precipitación * 200 μl de Nuclei Lysis Solution

* Agua a temperatura de 65 * 50 μl de EDTA, 0.5M (pH 8.0)

ºC * 20 μl de Proteinase K

* Rotuladores * 5 μl de solución de RNase A

* Reloj o cronómetro
 * 650 μl de solución de lavado de columna (CWA) por cada

lavado (4 lavados)

* 250 μl de agua libre de nucleasas

* Agua ultra desionizada estéril

Técnicas y procedimientos para ejecutar la práctica:

- Técnica empleada: Observación.

- Procedimiento: Extracción de ADN cuantificación e interpretación.

Desarrollo de la práctica.

- Extracción de ADN

- Una vez obtenida la muestra de ADN (ganglios), se procede a la medición con las

micropipetas de la cantidad a trabajar, cuya cantidad optima debe ser de 200 μl

(microlitros)

- En un tubo de micro centrífuga o Eppendorf de 1,5 ml se mezclan los reactivos

encargados de la digestión o desintegración de membranas, proteínas y ARN, esta

mezcla contiene:

* 200 μl de Nuclei Lysis Solution

* 50 μl de EDTA, 0.5M (pH 8.0)

* 20 μl de Proteinase K

* 5 μl de solución de RNase A

- Se colocan con la micropipeta en un tubo de micro centrífuga o Eppendorf de 1,5 ml

(tubo de mix) los 200 μl de muestra de ganglios, adicional se añaden los 275 μl del mix

de los reactivos, volumen total en tubo 475 μl.

- Se mezcla en el agitador de vórtex, el tubo de Eppendorf (tubo de mix) con el contenido

durante 20 segundos, y se procede a dejar que se realice el lisado de la muestra durante

20 minutos sobre agua a temperatura de 65 ºC.

- Transcurridos los 20 minutos el contenido ahora llamado “lisado” se transfiere del tubo

de micro centrífuga de 1,5 ml a un conjunto de mini columnas.

 - Se coloca el conjunto de mini columnas que contiene el lisado de la muestra en la

máquina de micro centrifuga, y se centrifuga a 13000 rpm durante 3 minutos para unir

el ADN genómico a la mini columna.

- Finalizada la centrifugación de la muestra se retira el líquido del tubo del conjunto de

mini columnas, (Importante se lo reemplaza únicamente al tubo, y se conserva la mini

columna), una vez que se lo ha reemplazado se agregan 650 μl de solución de lavado

de columna (CWA), y se centrifuga nuevamente a 13000 rpm durante 1 minuto.

- Una vez finalizado la centrifugación se retira nuevamente el líquido, y se procede al

lavado con 650 μl de solución de lavado de columna (CWA), y se centrifuga

nuevamente a 13000 rpm durante 1 minuto, este proceso se repite 4 veces en total.

- Después del último lavado, se vacía el tubo de recogida, y con el tubo vacío se procede

a centrifugar nuevamente a 13000 rpm durante 2 minutos para secar el matriz de unión.

- Se retira la mini columna y se la coloca en un tubo de micro centrífuga para elución,

se añaden 250 μl de agua libre de nucleasas, y se la deja incubar durante 2 minutos a

temperatura ambiente.

- Transcurrido los 2 minutos, se coloca el tubo de micro centrífuga para elución en la

microcentrífuga, y se procede a centrifugar a 13000 rpm durante 1 minutos.

- Finalizado este paso, se retira la minicolumna y se conserva el tubo de elución puesto

que en él se conserva el ADN.

Cuantificación e interpretación del ADN

- Previo a la cuantificación de la concentración y calidad del ADN, es importante

calibrar a cero el espectrofotómetro, seguido de esto se usa agua ultra desionizada

estéril, como blanco, esto es con el fin de que, al momento de colocar el ADN, el

espectrofotómetro mida y registre correctamente el valor de la densidad óptica (DO) a

260 y 280 nm.

- Una vez colocado el ADN, se espera a que el espectrofotómetro, mida y registre los

valores, que luego serán analizados e interpretados con el apoyo docente.

Recursos didácticos aplicados:

- Revisión bibliográfica del libro de “Biología celular y molecular” de Karp Gerald 6ª

edición, y del libro “Prácticas de biología molecular” de Concepción, J y Puerta, B.

- Revisión del protocolo de extracción y purificación de ADN de la casa comercial

Promega.

- Aprendizaje del manejo y calibrado correcto de las micropipetas.

- Reconocimiento de los componentes y reactivos que conforman el kit o sistema de

purificación de ADN genómico Wizard SV ®

- Aprendizaje del manejo del agitador tipo vórtex, del equipo de Centrífuga de

Eppendorf y del equipo de espectrofotometría NanoDrop 2000.

Resultados del aprendizaje:

Se realizaron un total de dos extracciones de ADN siguiendo el proceso anteriormente indicado,

obteniéndose los siguientes resultados:

ADN genómico total extraído:

* Muestra 1: Concentración de ADN= 32,4 ng/ μl (nanogramo/micro litro)

* Muestra 2: Concentración de ADN= 18,5 ng/ μl (nanogramo/micro litro)

ADN cuantificado:

* Muestra 1: A una densidad óptica de 260/280 nm= 1,73

* Muestra 2: A una densidad óptica de 260/280 nm= 1,70

Preguntas de control:

1.- ¿Para qué sirven las diferentes micropipetas?

* Existen diversos tipos de micropipetas, las más utilizadas son las micropipetas manuales y

automáticas y las de volumen fijo y las de volumen variable.

* Las micropipetas son instrumentos de laboratorio que sirven para succionar y transferir

pequeños volúmenes de líquidos y permitir su manejo en las distintas técnicas analíticas, los

volúmenes captables por estos instrumentos varían según el modelo y el número de volumen

que manejan: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo de 20,

200 y 1000 μl (microlitros), respectivamente.

2.- ¿Qué sucede a nivel celular en cada una de las fases de extracción?

Fases de la extracción de ADN:

Fase de lisis celular o eliminación de membranas: durante este proceso las interacciones

entre las moléculas que conforman la pared de la membrana celular y nuclear se modifican o

destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen.

Fase de digestión o eliminación de proteínas: durante esta fase ocurre la digestión de las

proteínas, la proteinasa K desempeña un papel importante en este proceso pues degrada una

proteína llamada histona, que envuelve al ADN, para liberarlo por completo, lo primordial en

esta fase es separar por acción enzimática, las proteínas del ADN.

Fase de eliminación del ARN: con acción de las RNasa se eliminan a nivel celular en su

totalidad la presencia de ARN.

Precipitación del ADN: A nivel molecular el ADN, por acción de la microcentrífuga, se

precipita al fondo del tubo esto es gracias a su distinto peso o concentración.

3.- ¿Cuál es la función de cada uno de los reactivos empleados?

* Nuclei Lysis Solution: Es una solución de lisis cuya función es romper las interacciones

entre las moléculas que conforman la pared de la membrana celular y nuclear por lo cual se

modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen

* EDTA, 0.5M (pH 8.0): La función del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en la

extracción de ADN, es la de mantener un pH estable y en cierta forma proteger al ADN de la

acción de las ADNasas y de los otros reactivos que puedan en cierta forma degradarlo.
* Proteinase K: Su función es la de desproteinización, es decir la digestión de las proteínas, la

Proteinase K desempeña un papel importante en este proceso pues degrada una proteína

llamada histona, que envuelve al ADN, para liberarlo por completo.

* Solución de RNase A: Es una endoribonucleasa, cuya función es la de eliminar o degradar

específicamente el ARN, durante el procedimiento para el aislamiento del ADN.

* Solución de lavado de columna (CWA): la función de esta solución es la de remoción de

contaminantes que pueden estar presentes en el ADN durante el proceso de extracción.

* Agua libre de nucleasas: Esta agua está sin la presencia de nucleasas o enzimas que rompen

los enlaces de fosfodiéster entre las subunidades de los ácidos nucleicos, su función esta

aplicada al lavado del ADN previo a su cuantificación.

* Agua ultra desionizada estéril: Su función es la de servir para la limpieza del

espectrofotómetro y para ser utilizarla como blanco de referencia

4.- ¿Qué tipo de células pueden ser empleadas con este método?

Con este método se pueden extraer ADN de cualquier tipo de célula ya sea procariota o

eucariota, el procedimiento es el mismo, la única variación son sus reactivos y componentes.

5.- ¿Cuál es la utilidad de determinar la cantidad de ADN en la muestra?

Cuantificar la cantidad de ADN, es importante en primera instancia para un óptimo trabajo,

una poca cantidad dificulta el trabajo en procesos que incluyan material genómico, como

electroforesis y PCR diagnósticos.

Bibliografía: Firma del estudiante: Firma del docente:

* Karp, G., Patton, J., Blengio Pinto,

J., & Pérez Tamayo Ruiz, A. (2014).

Biología celular y molecular. México:

Editorial Mc Graw Hill

Interamericana.

* Puerta Bula, C., & Uruena Pinzón,

C. (2005). Prácticas de biología

molecular. Bogotá́ : Editorial

Pontificia Universidad Javeriana.

*Salasar A, Sandoval A,Armendariz J,

Molecular Biology Fundaments and

aplications on medicine cience,

Mexico, Mcgraw-hill. Cap 11.