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2016
Producción en
biorreactor
Recuperación y Purificación
2
Dra. Silvia Andrea Camperi
Filtración
Ultrafiltración Técnicas
cromatográficas
Centrifugación
Precipitación
Producción en Recuperación
Purificación
biorreactor (aislamiento, enriquecimiento)
3
La selección de un método separativo depende de:
4
Planear una estrategia
¿Qué conozco de la proteína?
5
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido
No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular
Homogenato
Separación Sólido-Líquido
Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
6
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido
Centrifugación y filtración
No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular
Homogenato
Separación Sólido-Líquido
Centrifugación y filtración
Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
7
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido
No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular
Homogenato
Separación Sólido-Líquido
Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
8
Ruptura celular
Métodos químicos
Métodos biológicos
Métodos mecánicos
9
Ruptura celular
• Métodos Químicos
• Ácidos
• Base
• Solventes
• Detergentes
• Métodos Biológicos
• Lisis Enzimática
• Auto lisis
• Tratamientos Físicos
• Congelamiento-descongelamiento
• Shock Osmótico
• Calentamiento y secado
• Métodos mecánicos
• Homogenización a alta presión
• Molino húmedo
• Sonicación
• Extrusión por presión
• Prensa Francesa
Ruptura celular
Homogeneizador de alta presión
Contra
presión Anillo de
válvula impacto
Desechos
celulares
ln (Rm/Rm-R) = k . N . Pa
2000 atm
11
Homogeneizador de alta presión
Válvulas de ruptura
Cuchillas
ln (Proteína Liberada )
Planos
No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular
Homogenato
Separación Sólido-Líquido
Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
15
Dra. Silvia Andrea Camperi
Precipitación
Negativa
– Precipitan los contaminantes
– La proteína de interés queda en solución
Positiva
– Precipita la proteína de interés (se concentra)
– Los contaminantes quedan en solución
16
Cultivo celular
Separación Sólido-Líquido
No Sí
Células Extracelular Sobrenadante
Ruptura celular
Homogenato
Separación Sólido-Líquido
Soluble
No Sí
Precipitación
Sobrenadante
Desechos celulares y/o
Lavado y Solubilización de CI
Purificación
17
Purificación
Cromatografía de exclusión molecular (SEC) Método no adsortivo
Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Métodos adsortivos
Cromatografía de afinidad (AC)
Método de fraccionamiento de
proteínas basado en el tamaño
molecular de las mismas
Método no adsortivo
Diluye la muestra
Volumen de siembra < volumen de la columna (10-30%)
Elución no modificable por la composición del buffer
19
Mecanismo
20
Cromatografía Dra. Silvia A.
Camperi
Partículas esféricas de
matriz de exclusión
molecular se empacan
dentro de columnas
Mecanismo
22
Ferritina
Aldolasa
Catalasa
Ovalbumina
Anhidrasa carbónica
Ribonucleasa A
Aprotinina
mL
Columna SuperdexTM 200 10/300.
*
Separación de grupos
Desalificación
Cambio de buffer
Matrices con alto grado de entrecruzamiento
Fraccionamiento
Matrices poco entrecruzadas e
Método no adsortivo
Diluye la muestra
Volumen de siembra < volumen de la columna (10-30%)
Elución no modificable por la composición del buffer
26
Cromatografía de exclusión molecular (SEC) Método no adsortivo
Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Métodos adsortivos
Cromatografía de afinidad (AC)
Método adsortivo
Concentra la muestra
Volumen de siembra puede ser > volumen de la columna
Elución modificable por la composición del buffer
Tabla 1 27
Cromatografía de intercambio iónico (IEC)
Método de
fraccionamiento de
proteínas basado en las
cargas superficiales de
las mismas
28
Carga positiva
Lisina pK = 8,5-9
Arginina pK = 9,5-10
Histidina pK = 6,5
Carga negativa
Ácido aspártico pK = 4
Ácido glutámico pK = 4
29
Curva de titulación y punto isoeléctrico de una proteína
Carga neta
Punto
isoeléctrico pI
Intercambiadores de aniones
(tienen carga positiva)
Intercambiadores de cationes
(tienen carga negativa)
Condiciones para la adsorción
pH tal que la proteína tenga carga neta contraria al intercambiador
Baja fuerza iónica
Tabla 1 3
2
Gel de isoelectroenfoque: para determinar pI
Se crea un gradiente de Cada proteína migrará
pH mediante anfolitos hasta alcanzar su pI
PH=9
- PH=9
PH=3 PH=3
Cátodo -
+
Ánodo
Curva de titulación y punto isoeléctrico de una proteína
Punto
isoeléctrico pI
Curva de titulación electroforética
PH=9
90º PH=3 PH=9
PH=3
Problema 2
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
C
A B
36
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador de cationes (SP-CM) (-)
pH muy ácido
(Ej pH=4)
ABC +
Catión C
Carga neta
A B
Anión
37
Intercambiador de aniones (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador de cationes (SP-CM) (-)
Catión C
Carga neta
A B
Anión
pH moderadamente ácido
(Ej pH=6,5)
A- BC +
38
Intercambiador de aniones (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador de cationes (SP-CM) (-)
Catión C
Carga neta
A B
Anión
pH moderadamente básico
(Ej pH=7,5)
AB - C+
39
Intercambiador de aniones (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador catiónico (SP-CM) (-)
pH muy básico
(Ej pH=9,5)
ABC -
Catión C
Carga neta
A B
Anión
40
Intercambiador aniónico (Q-DEAE) (+)
ProteínasAA pI
Proteína =pI=6de 6, B =pIProteína
7 , C =pIBdepI
8.3=7 Proteína C pI =8,5
Intercambiador catiónico (SP-CM) (-)
Catión C
A
Carga neta
B
Anión
pH moderadamente
pH moderadamente
básico
ácido
(Ej pH=7,5)
(Ej pH=6,5)
AB - C+
A- BC +
Problema 3
41
Intercambiador aniónico (Q-DEAE) (+)
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
Método de
fraccionamiento de
proteínas basado en la
hidrofobicidad de las
mismas
42
Grupos R alifáticos no polares
Grupos R aromáticos
43
Mecanismo
Precipitación por salting out
Interacción
Alta fuerza iónica proteína-ligando
Sal
46
Condiciones para la adsorción
Alta fuerza iónica de sal anticaotrópica
Tabla 1 Problema 4 4
7
Cromatografía de afinidad (AC)
Técnica cromatográfica con mayor selectividad
Problema 5
PERFORMANCE
Factor de purificación (FP)= AE luego de la purificación
AE antes de la purificación
49
Problema 7
50
Traer resueltos Problema 5-6
Día 2
28/10/2016 51
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
52
Rendimiento total vs número de etapas del proceso
53
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
54
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
Elegir etapas de purificación basadas en diferentes
propiedades fisicoquímicas
55
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
Elegir etapas de purificación basadas en diferentes
propiedades fisicoquímicas
Elegir métodos y condiciones que exploten las mayores
diferencias entre las propiedades fisicoquímicas del
producto y las impurezas
56
57
Diseño y optimización de métodos
cromatográficos de purificación de proteínas
Disminuir al mínimo el número de etapas de la secuencia
A igualdad de resolución elegir las etapas de menor costo
AC >SEC >IEC =HIC
Elegir etapas de purificación basadas en diferentes
propiedades fisicoquímicas
Elegir métodos y condiciones que exploten las mayores
diferencias entre las propiedades fisicoquímicas del
producto y las impurezas
Usar con criterio la capacidad adsortiva de las columnas
matrices cromatográficas
Eliminar primero los contaminantes que están en mayor
proporción
58
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional
59
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional
60
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional
61
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional
62
Ubicación de los métodos cromatográficos elegidos
en una secuencia racional
NO HAY QUE
PURIFICAR MÁS DE
LO NECESARIO
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Proteína Peso Hidrofobicidad pI Concentración
molecular
[(NH4)2SO4] de elución (mg/ml)
(kDa)
A 90 1,5 5 0,9
B 100 2,0 6 2,3
C 45 1,5 7 5,1
D 25 0,5 5 0,1
X 95 1,5 5 0,2
Problema 8
Adición de salesHICSEC
SECIEC Calcula AE final en cada proceso
IECSEC ¿Cuál esquema considera más conveniente? 65
Problema 9
66