Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Bioquímica General
4QV1 Sección 4

Caracterización espectrofotométrica del DNA y separación de bases

nitrogenadas e hidrolizados de DNA y RNA por cromatografía en placa
fina
Objetivos 300 -0.001 0.084 -0.164 -0.188 0.056
Mediante las absorbancia obtenidas <1 de 260nm
 Separar las bases nitrogenadas del DNA y el en este caso se presentaron 3 diluciones 1:50,
RNA por cromatografía en capa fina a partir 1:150, 1:200 se calculó la concentración en
de hidrolizados de los mismos, mg/mL con la siguiente formula.
identificándolas por la propiedad que tienen
de absorber luz UV. 𝑥(0.05) 𝑚𝑔
=
 Identificar el espectro de absorción del DNA 1 𝑚𝐿
a partir de un método espectrofotométrico y 0.802(0.05)
= 0.0401𝑚𝑔/𝑚𝐿
obtener su pureza. 1

0.665(0.05)
1
= 0.03325𝑚𝑔/𝑚𝐿
Resultados y discusión
0.701(0.05)
= 0.03505𝑚𝑔/𝑚𝐿
Tabla I. Absorbancias obtenidas a diferentes 1

longitudes de onda de diferentes diluciones de Esta concentración se encuentra en una dilución

una solución de DNA marcando las absorbancias 1:100,1:150,1:200 por lo tanto la concentración
de 260nm (para DNA) y 280nm (para proteinas) del extracto original es de 4.01, 4.9875,
7.01mg/mL
Longitud de Absorbancia
onda (nm) Blanco 1:50 1:100 1:150 1:200
200 0.040 -0.030 -0.010 0.110 0.419
205 0.139 0.130 0.235 0.249 0.139
210 -0.301 -0.076 0.179 0.005 -0.225
215 0.071 0.628 0.418 0.375 0.568
220 0.001 1.215 0.225 0.219 0.499
225 0.007 1.051 0.059 0.071 0.423
230 0.001 0.799 -0.009 0.005 0.356
235 -0.001 0.785 0.028 0.033 0.351
240 -0.002 1.000 0.177 0.155 0.415
245 -0.001 1.326 0.379 0.314 0.498
250 -0.001 1.662 0.567 0.469 0.578
255 0.001 1.809 0.719 0.592 0.663
260 -0.003 2.019 0.802 0.665 0.701
265 -0.001 2.083 0.845 0.685 0.706
270 0 2.057 0.807 0.660 0.676 Figura 1. Nomograma con el cálculo de DNA y
275 -0.001 1.793 0.657 0.522 0.564
proteínas con las absorbancias obtenidas a 280 y
280 0.001 1.469 0.472 0.363 0.420
260nm
285 -0.001 1.104 0.273 0.189 0.273
290 -0.001 0.679 0.074 0.016 0.122
295 0 0.330 -0.071 -0.109 0.014
Para la prueba espectrofotométrica se realizaron no son confiables por lo ya descrito
diferentes diluciones a partir de las cuales anteriormente.
elegimos aquella cuyo espectro tuviera una
mayor absorbancia a 260nm que es el rango
máximo de absorción de luz del DNA. También
observamos la absorción a 280nm pues éste es
el rango de absorción de las proteínas y un pico
en ésta longitud de onda es un indicador de
contaminación de origen proteico. Así que en
base a esto determinamos la pureza del DNA.

Se obtuvo como resultado del nomograma

concentraciones diferentes sin embargo
encontramos que al intersectar los valores de la
dilución 1:150 el valor de proteínas salía cercano
a 0, lo cual es imposible ya que este contenía
proteínas, por lo cual los valores de esta dilución
se podrían descartar posteriormente las
diluciones 1:100 resulto una concentración de
proteínas de 0.012 mg/mL y de ácidos nucleicos Figura 2. Cromatograma de soluciones de las
de 0.032 mg/mL, mientras que 1:200 nos dio una diferentes bases púricas y pirimidícas, con
concentración de 0.08mg/mL y 0.030 mg/mL soluciones de DNA y RNA.
respectivamente, mientras que la concentración
del extracto fue de 2.005 y 7.01mg/mL DNA Tabla II. Rf de las soluciones de las diferentes
respectivamente. bases púricas y pirimidícas, y basado en el
Podemos observar en la Tabla I, los valores de cromatograma identificar cuales están presentes
las diluciones son muy dispersos y estos no en el DNA y en el RNA.
concuerdan ya que esperaríamos que conforme
Rf DNA RNA
vamos aumentando la dilución, la absorbancia
Citosina 0.266 ✓ ✓
vaya disminuyendo. Esto se puede deber a que
Guanina 0.4 ✓ ✓
cada equipo realizo una dilución diferente por lo
Adenina 0.533 ✓ ✓
cual cada persona tiene errores de analista
Uracilo 0.653 ✓
diferente lo cual aumenta la probabilidad de
Timina 0.733 ✓
error, además que las pipetas y tubos usados no
En la cromatografía en placa fina se hicieron
fueron lavados previamente provocando que se
aplicaciones de las bases nitrogenadas que
agregaran impurezas e interfiriendo en los
componen los ácidos nucleicos; adenina, timina,
valores de absorbancia.
guanina y citosina para DNA y para RNA
Se tomaron los datos de la dilución 1:100 ya que únicamente se reemplaza la timina por uracilo.
al compararlo con los resultados del nomograma Además de las aplicaciones de bases
fue el que más parecido tuvo, el valor obtenido nitrogenadas también se realizaron dos de DNA y
del nomograma del extracto crudo fue de 3 y el RNA.
valor obtenido con las diluciones fue de 4.01.
El fin de llevar a cabo dicho proceso con éstas
Pureza sustancias en específico es demostrar en base a
la mancha revelada con luz UV qué componentes
𝐴𝑏𝑠 260𝑛𝑚 tienen cada uno de los ácidos nucleicos. La
= 𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎
𝐴𝑏𝑠 280𝑛𝑚 diferencia de corrimientos se debe a su
0.802 0.701 estructura y afinidad con el eluyente empleado.
0.472
= 1.699 0.420
= 1.669
Basándonos en los resultados obtenidos (la
Con el resultado obtenido podemos concluir que Figura 2 y la Tabla II) podemos confirmar que las
el extracto de DNA es puro ya que el resultado bases púricas Adenina y Guanina, y la base
de la división fue >1.5, sin embargo estos datos
pirimidíca Timina, están presentes en ambos
ácidos nucleicos. La diferencia entre estos
ácidos nucleico se observa claramente que el
DNA presenta Citosina pero no Uracilo y al
contrario el RNA presenta Uracilo pero no
Citosina.

Conclusiones

 El extracto de DNA tenía una pureza de

alrededor de 1.7
 EL extracto contenía alrededor de 3mg/mL
según el nomograma y 4.01mg/mL según el
primer método.
 El DNA está compuesto por Adenina, Timina
Guanina y Citosina
 El RNA está compuesto por Adenina, uracilo,
guanina y citosina
 El espectro de absorción del DNA se
encuentra con un máximo a 260nm

Bibliografía

 G. Gómez, “Bioquímica, la ciencia de la

vida”, Editorial de la Universidad Estatal a
Distancia, Costa Rica (2004).
 L. Pacheco, “Bioquímica Médica”, Editorial
LIMUSA, México (2004).