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RESUMEN
1
Investigadora. Unidad de Biotecnología Vegetal UNALMED-CIB Corporación para Investigaciones Biológicas, CIB. Medellín,
Colombia. <avalderrama@cib.org.co>
2
Profesor Asociado. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias. A. A. 3840. Medellín, Colombia.
<rafaelarango@epm.net.co>
3
Profesora Asociada. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. A. A. 3840.
Medellín, Colombia. <lafanado@unalmed.edu.co>
ABSTRACT
Agrobacterium tumefaciens has the ability to transfer DNA between different kingdoms. This
finding has had a great impact in several fields of plant biology, agriculture and biotechnology. This
review describe the mechanisms by which Agrobacterium transfer DNA to the plant, emphasizing
7 fundamental steps in the A. tumefaciens-plant interaction, to provide an opportunity for
professionals in the biological sciences to familiarize themselves with the topic. Basic knowledge
about the DNA transfer mechanism has allowed the development of various vectors for the
introduction of foreign genes, among which two classes that are currently used are described: co-
integrative and binary vectors. Furthermore, detail some important factors that mediate
transformation and some of the principal applications of the transformation of plants and fungi by
means of Agrobacterium.
más contiene los genes vir que son nece- importancia económica como el arroz
sarios para la transferencia e incorporación (Cheng et al., 1998), el banano (May et
del fragmento de ADN en el genoma de la al., 1995), el maíz (Ishida et al., 1996), el
planta. La especie A. rhizogenes produce trigo (Cheng et al., 1997) y la caña de
el crecimiento vigoroso de las raíces infec- azúcar (Arencibia et al., 1998) entre otros.
tadas mediante un mecanismo semejante
al de A. tumefaciens. En este caso el En este artículo se describen los procesos
plásmido que contiene el ADN-T es llama- por los cuales Agrobacterium realiza la
do Ri (plásmido inductor de raíces). transferencia de ADN a plantas, el desarro-
llo de vectores desarmados útiles para la
Un hallazgo crucial que permitió el diseño transformación de plantas y las condicio-
de vectores para la transformación genética nes experimentales que afectan su integra-
de plantas mediante el uso de especies de ción. Así mismo, se dará una descripción
Agrobacterium es el hecho que sólo las de las principales utilidades y aplicaciones
secuencias borde del ADN-T son requeri- del uso de la transformación genética de
das para que la transferencia se lleve a cabo plantas mediante Agrobacterium.
(Garfinkel et al., 1981; Zambryski et al.,
1983). Algunos o todos los genes Mecanismo de transferencia de ADN-T
bacterianos del ADN-T pueden ser removi- mediado por Agrobacterium. El meca-
dos originando vectores desarmados, los nismo de transferencia del ADN-T a la cé-
cuales pueden transformar células vegeta- lula vegetal esta determinado por la
les sin los síntomas generales de la infec- interacción molecular entre la bacteria y la
ción bacteriana. planta, especialmente por el intercambio
de señales de tipo proteico. Aunque el pro-
La inserción de nuevos genes y sus elemen- ceso de transferencia del ADN-T de A.
tos reguladores en el ADN-T ha permitido tumefaciens ha sido ampliamente estudia-
la transformación genética de plantas sus- do, aún no han sido descifrados completa-
ceptibles con genes de importancia mente los mecanismos moleculares por los
agronómica. Esto a su vez ha servido para cuales éste es transferido a la planta. Se
el estudio de la función y expresión de han obtenido mutantes de Arabidopsis
genes, y para el desarrollo de plantas con thaliana que son resistentes a la transfor-
nuevas características (Gelvin, 2003). El mación con Agrobacterium (mutantes rat)
principio de transferencia de ADN con A. con los cuales se espera entender el papel
tumefaciens y A. rhizogenes ha sido útil de los genes y proteínas de la planta que
para la transformación de especies de plan- median el proceso de transformación (Zhu
tas dicotiledóneas; sin embargo, ciertas et al., 2003). Tzfira y Citovsky (2000) des-
condiciones experimentales deben ser es- criben siete eventos fundamentales para la
tablecidas para que el sistema de transfor- interacción A. tumefaciens-planta:(i) reco-
mación funcione bien en nuevas especies nocimiento y adherencia; (ii) identificación
vegetales. Las monocotiledóneas no son ge- de señales de la planta; (iii) activación de
neralmente susceptibles a A. tumefaciens; genes vir; (iv) generación del ADN-T; (v)
aunque se ha logrado la transferencia de exportación del ADN-T hacia la planta; (vi) im-
genes a especies monocotiledóneas de portación del ADN-T dentro del núcleo de la
planta; (vii) integración del ADN-T dentro La proteína sensora ChvG hace parte del
del genoma del hospedero. complejo cromosomal ChvG/ChvI que es
importante para la virulencia de A.
Reconocimiento y adherencia. El aisla- tumefaciens. Se ha demostrado que ChvG
miento de mutantes de A. tumefaciens in- interviene en la regulación de genes
capaces de adherirse a células vegetales inducibles en presencia de pH ácidos como
ha permitido identificar algunos genes aopB, katA, virB y virE. Ya que ChvG regu-
cromosomales necesarios para esta la genes inducibles a cierto pH se presume
interacción como lo son chvA, chvB, pscA que ChvG es un sensor que puede detectar
y att. De otro lado, las moléculas de la plan- directa o indirectamente la acidez
ta reconocidas por Agrobacterium han sido extracelular (Li et al., 2002).
poco caracterizadas pero se cree que pue-
den actuar moléculas parecidas a la Activación de genes vir. Los genes vir cons-
vitronectina de células animales (Wagner y tituyen un operón con 8 genes principales
Matthysee, 1992). La producción de espe- (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG y virH)
cies de A. thaliana mutantes para la unión regulados por una secuencia promotora
con A. tumefaciens podrá ayudar a identi- que contiene 12 pares de bases conserva-
ficar proteínas y carbohidratos que estén das a la que se une específicamente la pro-
involucrados en esta unión (Naam et al., teína VirG fosforilada. La fosforilación de
1999). la proteína VirG es requerida para la activa-
ción de los genes vir (Jin et al., 1990b).
Identificación de señales producidas por
la planta. Se han identificado dos sensores Generación del ADN-T. La producción del
proteicos, VirA y VirG, que reaccionan ADN-T se da por la acción de las proteínas
específicamente con la presencia de VirD2 y VirD1, que actúan como
exudados de plantas heridas y que además endonucleasas, uniéndose al plásmido Ti
promueven la activación transcripcional de en los bordes del ADN-T relajándolo y ha-
los genes vir (Winans et al., 1994). La pro- ciendo cortes en la cadena del ADN-T sin
teína de membrana VirA interactúa de for- sentido (Filichkin y Gelvin, 1993; Scheiffele;
ma directa o indirecta con compuestos Pansegrau y Lanka, 1995; Wang et al.,
fenólicos producidos por las plantas como 1987). Después de hacer el corte, la pro-
lignina, precursores de flavonoides y teína VirD2 se une covalentemente al ex-
acetosiringona (Stachel et al., 1985). La tremo 5’ del ADN-T hasta su transferencia
proteína citoplasmática VirG es fosforilada a la planta (Howard et al., 1989). El ADN-
por VirA y permite la transducción de se- T es cubierto por proteínas de unión al ADN
ñales que activan los genes vir (Jin et al., de cadena sencilla (SSB) que permiten su
1990a). Compuestos como la glucosa y transporte. Las proteínas VirE2 también se
galactosa también inducen los genes vir por unen al ADN-T y posiblemente cubren la
la unión a receptores codificados cadena formando junto con VirD2 un com-
cromosomalmente como ChvE que plejo de transferencia (Howard y Citovsky,
interactúa con VirA y transmite la señal 1990; Zupan y Zambryski, 1997). Estudios
(Shimoda et al., 1993). más recientes sugieren que el complejo pro-
teínas Vir:ADN-T se forma dentro del cito- célula (Baron et al., 1997; Christie, 1997);
plasma de la célula hospedera; donde el VirB3 y VirB4 promueven el ensamblaje del
ADN-T viaja al citoplasma vegetal asocia- pili de virulencia (Zupan; Ward y Zambryski,
do con VirD2 de forma independiente y la 1998); VirB6 media la formación de los
proteína chaperona VirE1 exporta al cito- complejos VirB7 y VirB9 requeridos para la
plasma la proteína VirE2. Una vez ha lle- biogénesis del pili T y del canal de secre-
gado al citoplasma de la célula hospedera ción (Jakubowski; Krishnamoorthy y
el complejo VirE1- VirE2 se disocia y se Christie, 2003); VirB10 se ubica
forma otro complejo entre VirE2 y el ADN- transmembranalmente y su función es des-
T (Deng et al., 1999; Sundberg y Ream, conocida, y finalmente VirD4 es requerida
1999; Zhou y Christie, 1999). para la formación del pili de virulencia
(Fullner; Lara y Nester, 1996).
Exportación del ADN-T. Agrobacterium
utiliza un mecanismo similar a la conjuga- El mecanismo de translocación de las pro-
ción para la transferencia de su ADN-T teínas VirB/D4 no es conocido en detalle,
oncogénico. Esta transferencia es mediada pero se sabe que tienen una señal de
por el sistema de secreción tipo IV (T4SS). translocación en el extremo c-terminal cuya
Este transportador es crítico para los pro- característica principal es poseer una carga
cesos de patogénesis ya que exporta facto- neta positiva con una secuencia consenso
res de virulencia importantes a través de la R-X(7)-R-X-R-X-R-X-X(n) (Vergunst et al.,
membrana de la bacteria (Burns, 2003; Yeo 2005).
y Waskman 2004). El sistema tipo IV ex-
porta diferentes tipos de proteínas entre las Importación nuclear del complejo – T. La
cuales se pueden definir tres componen- importación al núcleo del complejo VirD2-
tes: el operón VirB/VirD4 que es requerido complejoT se da en conjunto con el trans-
para la transferencia del ADN a la planta porte de las proteínas VirE2, VirF y VirE3
hospedera, el sistema Trb que codifica para (Schrammeijer et al., 2003). Las proteínas
la transferencia por conjugación del VirD2 y VirE2 son las que median directa-
plásmido Ti entre células de Agrobacterium, mente el proceso de importe nuclear del
y el sistema AvhB que media la transferen- complejo-T (Citovsky; Warnick y Zambryski,
cia del T-ADN en ausencia de las proteínas 1994; Herrera-Estrella; Van Montagu y
VirB y el sistema Trb (Chen et al., 2002). Wang, 1990; Tinland et al., 1992). En la
célula vegetal, VirD2 y VirE2 pueden
El T4SS de Agrobacterium tumefaciens está interactuar con proteínas chaperonas que
compuesto por 11 proteínas codificadas por permiten el importe nuclear del complejo-
el operon VirB y al menos una proteína del T y su integración. Las proteínas chaperonas
operon VirD (VirD4). Esta última proteína RocA, Roc4 y CypA al parecer mantienen
actúa como acoplante entre T4SS y el T- la conformación de VirD2 durante el im-
DNA/VirD2 (Cascales y Christie, 2004). porte nuclear del complejo-T y su integra-
VirB1 permite disolver la membrana de ción (Deng et al., 1998). El importe nu-
peptidoglicano de la pared bacteriana y clear del complejo T es asistido por proteí-
puede participar en el contacto célula a nas celulares del hospedero como VIP1 que
interactúa específicamente con VirE2. Ele- El hecho de que los genes vir, para que
vados niveles de VIP1 en el hospedero lo sean funcionales, no necesitan estar en el
hacen más susceptible a la transformación mismo plásmido que el ADN-T y de que el
con Agrobacterium (Tzfira; Vaidya y plásmido Ti tiene un tamaño de 200
Citovsky, 2002). También se ha encontra- kilobases, a forzado el desarrollo de estra-
do que VirE3 puede simular la función de tegias para reducir el tamaño de estos
VIP1, actuando como un adaptador entre vectores. Hasta el momento se han desa-
VirE2 y la Karioferina a celular asistiendo el rrollado 2 tipos de estrategias: las que uti-
importe nuclear del complejo TDNA-VirE2. lizan vectores co-integrados y las que utili-
Debido a que VIP1 no es una proteína abun- zan vectores binarios.
dante y representa un factor limitante para
la transformación, Agrobacterium puede Vectores co-integrados. Estos vectores
haber desarrollado un sistema para com- son construidos por la recombinación en-
plementar, al menos parcialmente, la fun- tre un plásmido Ti desarmado que contie-
ción de VIP1(Lacroix et al., 2005). ne el borde izquierdo y un pequeño vector
que contiene el gen de interés flanqueado
Integración del ADN-T. La integración del por el borde derecho y una región
ADN-T dentro del cromosoma de la planta homóloga al borde izquierdo. La
esta mediada por la proteína VirD2 que recombinación se lleva a cabo por un even-
contiene dominios con actividad para la to de entrecruzamiento de regiones
recombinación y ligación (Argos et homólogas de los dos plásmidos. Un ejem-
al.,1986; Tinland et al., 1995). El estudio plo de este sistema es el plásmido de
de mutantes de A. thaliana resistentes a la Agrobacterium co-integrado R772: pTiB6
transformación con A. tumefasciens sugie- (Hille et al., 1983). Algunos vectores co-
re la participación de histonas H2A en la integrados han sido modificados para te-
integración del ADN-T (Mysore; Nam y ner una recombinación sitio específica
Gelvin, 2000). como el sistema cre/lox (Vergunst; Jansen
y Hooykaas,1998). En este sistema la cepa
Desarrollo de vectores desarmados. El de Agrobacterium contiene un plásmido
conocimiento básico sobre el mecanismo que codifica para una recombinasa, una
de transferencia del ADN-T ha permitido el secuencia para el control de su expresión,
desarrollo de vectores para la introducción genes vir y un sitio de recombinación. Este
de genes foráneos en plantas cultivadas. plásmido se recombina con otro plásmido,
Ya que los genes que codifican para la sín- que contiene el gen de interés flanqueado
tesis de opinas y auxinas no son necesarios por el borde derecho, generando un
para la transferencia del ADN-T, permite que plásmido co-integrado sitio específico.
esta región pueda ser reemplazada por
genes de interés sin afectar el proceso de Vectores binarios. Estos son los vectores
transferencia. Los vectores a los que se les más usados para la transformación de plan-
ha removido la región interna del ADN-T tas y se encuentran en una gran variedad.
son conocidos bajo el término de “desar- En este sistema Agrobacterium tiene dos
mados”. vectores: uno que contiene la región del T-
ADN con el gen de interés y otro vector Este sistema permitió la transformación y
que contiene la región vir. Los vectores expresión de seis genes en A. thaliana
binarios Ti tienen sitios de replicación para (Goderis et al., 2002). En la actualidad es-
Escherichia coli y A. tumefaciens, permi- tán disponibles una amplia variedad de
tiendo el desarrollo de técnicas de mani- vectores Ti que los investigadores pueden
pulación in vitro en E. coli (Hellens y escoger de acuerdo a sus necesidades y
Mullineaux, 2000). Dentro de los vectores capacidad tecnológica.
simples binarios se encuentran pBIN 19,
pC22, pGA482, pPCV001, pGreen y Factores que median la transformación.
pCAMBIA entre otros. Su principal diferen- Existen diferentes factores que intervienen
cia radica en el tamaño, el número de si- en la transformación de plantas mediada
tios de restricción del ADN-T, la presencia por Agrobacterium determinando el éxito
de genes reporteros, los orígenes de o fracaso en la transferencia del gen de in-
replicación y el antibiótico de selección en terés y su posterior integración y expresión.
bacterias y plantas (Hellens y Mullineaux, Estos factores varían de acuerdo a la espe-
2000). cie vegetal pero se deben tener en cuenta
los siguientes aspectos: edad de la planta,
Se han realizado modificaciones de estos tipo de tejido a transformar, cepa de
vectores mediante la introducción en el Agrobacterium seleccionada para transfor-
cromosoma de Agrobacterium ya sea la mar, tiempo y condiciones de inoculación
región del ADN-T o la región vir. Cuando del tejido con Agrobacterium, densidad y
la región T está integrada en el cromosoma, período de precultivo de la bacteria y pre-
la region vir es parte el plásmido Ti y vice- sencia de necrosis en el tejido de la planta
versa. Estos vectores binarios modificados causada por Agrobacterium (Grevelding
han permitido la transformación de plan- et al., 1993; Salas et al., 2001; Chakrabarty
tas de las familias Amaryllidaceae (como et al., 2002, Ko et al., 2003).
cebolla y ajo) y Liliaceae (como espárra-
gos) (http://www.cambiaip. org). Con el objetivo de inducir la expresión de
los genes vir y facilitar la transformación se
Otras modificaciones también han permi- han utilizado diferentes inductores de la
tido obtener cepas hipervirulentas de transformación como son los compuestos
Agrobacterium capaces de mediar la trans- glucosa, acetosiringona y azacitidina; los
formación de cereales. Las cepas resultados en el porcentaje de plantas trans-
hipervirulentas contienen en el vector formadas varían de acuerdo a la especie
binario un cassette extra de genes vir B, C vegetal evaluada y a la concentración utili-
y G (Khanna y Daggard, 2003). La cons- zada (Chakrabarty et al., 2002; Boase;
trucción de vectores binarios con sitios de Butler y Borst, 1998). Recientemente se ha
reconocimiento de endonucleasas permite descrito que la exposición de líneas celula-
el ensamblaje de cassettes flanqueados por res de Nicotiana tabacum, A. thaliana y
estas secuencias, para la construcción de Ageratum conyzoides a sustancias
vectores de transformación de plantas que inhibidoras de la síntesis de purinas y
contienen múltiples cassettes de expresión. pirimidinas como la azaserina y acivicina
eleva hasta 180 veces la frecuencia de trans- aunque la inducción óptima de los genes
formación en comparación con aquellas vir es a 25 °C la transferencia del ADN-T
líneas que no habían sido tratadas con es- fue óptima a una temperatura de 19 °C
tos compuestos. Los mecanismos (Fullner; Lara y Nester, 1996). Estos traba-
moleculares involucrados en esta respues- jos resaltan la importancia de la tempera-
ta son desconocidos. (Roberts et al., 2003). tura de co-cultivo durante la transforma-
ción. La temperatura óptima para el co-
La transferencia del ADN-T en algunos
cultivo depende del tipo de planta y
explantes ha sido fuertemente disminuida
explante, y se resalta que es mejor el uso
por la producción por parte de la planta de
de temperaturas cercanas o inferiores a 25
especies reactivas de oxígeno las cuales
probablemente activan procesos de muer- °C. Además, temperaturas por encima de
te celular programada o necrosis tisular 25 °C causan un mayor necrosamiento del
generando una barrera de células muertas tejido y una reducción en la tasa de trans-
alrededor del tejido infectado. Aunque es- formación (Salas et al., 2001; Chakrabarty
tos compuestos promueven el et al., 2002).
necrosamiento del tejido, se han introdu-
cido diferentes inhibidores de enzimas que En general las condiciones de luz durante
participan en este proceso para aumentar el co-cultivo varían considerablemente si
los porcentajes de plantas transformadas. se compararan diferentes protocolos de
Algunos tratamientos anti-necróticos apli- transformación de plantas y este factor no
cados durante el proceso de transforma- ha sido evaluado ampliamente. Zambre
ción incluyen la adición de agentes et al. (2003) utilizaron callos de Phaseolus
reductores, inhibición por calor de enzimas acutifolius y segmentos de raíz de A.
que participan en el proceso oxidativo, re- thaliana en co-cultivo con Agrobacterium
ducción del pH y la adición de inhibidores con diferentes condiciones de luz como
de enzimas. Los compuestos más amplia- oscuridad continua, fotoperíodo 16h luz/
mente utilizados son: inhibidores de etileno 8h oscuridad y luz continua. En este estu-
(AgNO3), inhibidores de oxidasas y
dio se concluyó que la actividad del gen
peroxidasas (Quelantes de cobre y hierro,
GUS esta altamente correlacionada con el
compuestos tiólicos como L-cisteína,
período de luz, siendo mayor la actividad
tiosulfato de sodio y glutation, DTT) (Olhoft
et al., 2001; Olhoft y Somers 2001; cuando se utilizó luz continua para los dos
Chakrabarty et al., 2002). tipos de explantes.
nemátodos en caña de azúcar (Cai et al., información sin duda ayudará enormemen-
2003). De igual forma puede tener aplica- te a seguir dilucidando los mecanismos
ción para procesos de fitoremediación con moleculares de la transferencia de genes
la producción de raíces capaces de remo- realizado por este género de bacterias a las
ver uranio de soluciones acuosas (Eapen plantas.
et al., 2003).
Desde el punto de vista más práctico, con
Transformación genética medida otras el descubrimiento reciente de que, al me-
bacterias. Hasta hace muy poco nos en algunos modelos, los inhibidores
Agrobacterium era el único genero cono- de síntesis de purinas mejoran considera-
cido con la capacidad para transferir genes blemente los porcentajes de transforma-
en las plantas. Sin embargo muy reciente- ción, se ha abierto un camino para mejo-
mente se ha demostrado que otras espe- rar considerablemente la eficiencia de los
cies de bacterias incluyendo, Rhizobium sp. métodos disponibles y posiblemente se lo-
NGR234, Sinorhizobium mieloti y gre incrementar el número de especies (no
Mesorhizobium loti pueden volverse com- necesariamente plantas) susceptibles a ser
petentes para integrar genes en las plantas transformadas por Agrobacterium.
si se les introduce un plasmido Ti desarma-
do y un vector binario. (Broothaerts, et al, Han pasado 20 años desde que se logra-
2005) Es posible que en el futuro, otras ron producir las primeras plantas
bacterias se conviertan en una alternativa transgénicas y es realmente impresionante
para la transferencia de genes en las plan- la gran variedad de aplicaciones y usos que
tas. se la ha dado a esta tecnología. Aplicacio-
nes tan exóticas de las plantas transgénicas
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS como por ejemplo su utilización para la
descontaminación de campos contamina-
Aunque los mecanismos de transferencia
dos con diversos xenobióticos (Eapen et
del ADN-T se han estudiado intensamente
al., 2003; Gisbert et al., 2003; French et
durante estas 2 últimas décadas, todavía
al., 1999) o para la producción de diver-
hay algunos aspectos que es necesario acla-
sos metabolitos (Ayadi y Tremouillaux-
rar, especialmente los mecanismos de in-
Guiller, 2003; Moyano et al., 2003; Sevon
tegración del ADN-T en el genoma de la
y Oksman-Caldentey., 2002) no deja de sor-
planta receptora y la interacción de las pro-
prender gratamente. Se espera que en el
teínas bacterianas transportadas a la célula
futuro la humanidad aprenda a utilizar y
vegetal con aquellas encargadas de reali-
zar los procesos de recombinación, repa- convivir armónicamente con una tecnolo-
ración y replicación del ADN celular. De gía que bien utilizada puede traer innume-
otra parte, el genoma de la cepa de rables beneficios.
Agrobacterium tumefancies C58, antece-
sora de las cepas que se usan actualmente BIBLIOGRAFÍA
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