4° Jornada de Ciências Farmacêuticas da UEZO

26 de maio de 2015

Testes mutagênicos e carcinogênicos e

sua respectiva importância em
vigilância sanitária

Helena Pereira da Silva Zamith

Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS/FIOCRUZ)

Departamento de Farmacologia e Toxicologia
helena.zamith@incqs.fiocruz.br
 Avaliação de Risco

 1. Identificação do dano ou perigo

 2. Avaliação da relação dose-resposta
 3. Avaliação da exposição
 4. Caracterização do risco
 Avaliação de risco
 Avaliação de risco à saúde humana direcionada ao estudo dos
seguintes potenciais de efeitos tóxicos às populações humanas
considerando-se as vias de exposição oral, inalatória e dérmica

 EFEITOS
 • toxicidade aguda
 • irritação
 • corrosividade
 • sensibilidade
 • toxicidade em doses repetidas
 • mutagenicidade
 • carcinogenicidade
 • toxicidade para a reprodução
 Avaliação de risco para saúde
humana
 População humana
 • trabalhadores;
 • consumidores;
 • pessoas expostas indiretamente através
da exposição ambiental
 DIRETRIZES

MEDICAMENTOS
The International Conference on Harmonization of Technical Requirements
for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH).

ICH Harmonised Tripartite Guideline: Genotoxicity Studies

Projeto envolvendo autoridades regulatórias da Europa, Japão e Estados Unidos da
América e especialistas da indústria farmacêutica.
http://www.ich.org/cache/compo/276-254-1.html
 Diretrizes
SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS

European Commission Technical Guidance Document (TGD) on Risk

Assessment . Part I in support of Comission Directive 93/67/EEC on
Risk Assessment for new notified substances

Commission Regulation (EC) No. 1488/94 on Risk Assessment for

existing substances

http:// ecb.jrc.it/?A=ECB&B=/tgdoc
 Ensaios de genotoxicidade

 Na avaliação de risco das substâncias é

necessário tratar do potencial efeito de
“mutagenicidade“.
 “Testes de genotoxicidade“ são usados para
investigar efeitos nocivos no material genético
__________________________________________
“European Commission Technical Guidance Document (TGD) on Risk
Assessment“
Legislação Federal de Agrotóxicos e Afins
Secretaria de Defesa Agropecuária- Departamento de Defesa e
Inspeção Vegetal, 1998

Capítulo III: Do Registro, Seção I: Do Registro do Produto

Artigo 8°: IV- relatório técnico III
e) dados relativos ao potencial mutagênico, embriofetotóxico e
carcinogênico em animais.

Seção III: Das Proibições:

Art. 22: São proibidos os registros de agrotóxicos, seus
componentes e afins:
IV- os considerados carcinogênicos que apresentarem evidências
suficientes nesse sentido, a partir de observações na espécie humana ou de
estudos com, pelo menos, duas espécies de animais de experimentação.
Legislação Federal de Agrotóxicos e Afins
Secretaria de Defesa Agropecuária- Departamento de Defesa e
Inspeção Vegetal, 1998

Art. 22: São proibidos os registros de agrotóxicos, seus componentes e

afins:
V- os considerados mutagênicos, capazes de induzir mutações
observadas em, no mínimo, dois testes, um deles para detectar mutações gênicas,
realizado inclusive com o uso de ativação metabólica, e o outro para detectar
mutações cromossômicas.
§2° - Os testes, provas e estudos sobre mutagênese, carcinogênese e
teratogênese devem ser efetuados com critérios aceitos por instituições
científicas ou de saúde pública, nacionais ou reconhecidas internacionalmente,
devendo os resultados ser avaliados, caso a caso, por uma Comissão Técnica do
Ministério da Saúde, que inclua especialistas da comunidade científica nacional
 Definições de mutagenicidade e de
genotoxicidade

 Mutagenicidade refere-se à indução de alterações

permanentes transmissíveis quantitativas ou estruturais do
material genético de células ou organismos.
(mutações gênicas; mutações cromossômicas; mutações genômicas)
 detectada com os testes de mutagenicidade

Genotoxicidade é um termo mais amplo e refere-se aos

efeitos potencialmente nocivos ao material genético que não
estão necessariamente associados com a mutagenicidade.
 detectada com os testes de genotoxicidade
(i. e. mutagenicidade- e testes indicadores)
_________________________________________________
 Testes de Genotoxicidade

I: Testes de Mutagenicidade:
 Teste de Mutação Reversa Bacteriano (“Teste de Ames“)
 Teste de Aberração Cromossômica em Mamífero In Vitro
 Teste de Micronúcleo In Vitro
 Teste de Mutação Gênica em Células de Mamífero In Vitro
 Teste de Aberrações Cromossômicas em Medula Óssea
de Mamífero
 Teste de Micronúcleo em Eritrócitos de Mamífero

II: Testes Indicadores:

 Teste de Síntese de DNA Não Programada In Vivo (UDS)
 Ensaio Cometa In Vivo
__________________________________________
Testes de Genotoxicidade

3 componentes:

 Células alvo
 Endpoint genético
 Ativação metabólica
 Testes de genotoxicidade

 originalmente realizados para detectar mutágenos em

células germinais
 no momento atual realizado
 no screening quanto aos possíveis efeitos carcinogênicos
 crescentemente sendo usado
 para esclarecer o significado
de estudos de carcinogenicidade duvidosos
  para esclarecer se os efeitos carcinogênicos
estão associados à genotoxicidade
__________________________________________________
 Testes de genotoxicidade

 uma combinação de testes de genotoxicidade é aplicada

 várias estratégias de testes existem: usualmente
subdividas em “testes básicos“ e “testes de seguimento “
 testes básicos: testes de mutagenicidade são
principalmente usados
 testes de seguimento: testes indicadores são
frequentemente usados
(esclarecimento do significado de resultados positivos)

__________________________________________
Estratégia dos testes de genotoxicidade
 flexível e abordagem em etapas
 possibilita a identificação do perigo
(i e. o potencial mutagênico de uma substância)
 dados são usados para a caracterização do risco;
incluindo classificação e rotulagem
 deve reduzir ao mínimo o uso de animais
 deve reduzir ao mínimo os custos
(tanto quanto seja consistente com o rigor científico!)
______________________________________
 Estratégia dos testes de genotoxicidade –
considerações gerais:
 informação sobre mutações gênicas, aberrações
cromossômicas estruturais (clastogenicidade) e
aberrações cromossômicas numéricas (aneugenicidade) é
requerida
 Informação sobre as propriedades físico-químicas da
substância-teste devem ser levadas em conta
 potencial efeito de uma substância sobre o pH,
solubilidade e estabilidade em veículos teste devem ser
considerados
 as propriedades toxicocinéticas devem ser consideradas
antes de realizar testes em animais
 protocolos rigorosos devem ser usados para aumentar ao
máximo o potencial para detecção do efeito mutagênico,
para assegurar que um resultado negativo seja aceito
com confiança (OECD guidelines; GLP)
_______________________________________
 Estratégia dos testes de genotoxicidade:
Nivel de teste básico

 em geral, dois testes in vitro são exigidos

 um teste de mutação gênica em bactéria
 um teste in vitro em células de mamífero capaz
de detectar aberrações cromossômicas
 o nível básico para biocidas adicionalmente inclui
um ensaio in vitro de mutação gênica em células
de mamífero
____________________________________
 Estratégia dos testes de genotoxicidade:
Necessidade de prosseguimento de testes
Ensaio em células somáticas
 resultados positivos de testes in vitro
 níveis potencialmente altos ou insuficientemente
controlados de exposição humana
 química da substância ou outros dados de toxicidade

Ensaio em células germinais

 resultados positivos in vivo constituem o gatilho para
consideração da investigação da genotoxicidade em
células germinais
______________________________________
 Estratégia dos testes de genotoxicidade
II. Prosseguimento de teste:
 Seguindo um resultado positivo no teste in vitro de
mutagenicidade em células de mamífero, adequadamente
conduzido é exigido ensaio em células somáticas in vivo
para averiguar se este potencial pode ser expresso in vivo.
 Antes da realização de qualquer ensaio in vivo é
necessário, uma revisão dos resultados dos testes in vitro e
de toda informação disponível sobre o perfil toxicocinético
da substância teste.
 Garantia de que o tecido alvo será adequadamente exposto
à substância teste e/ou a seus metabólitos
 No caso de biocidas, se um dos três testes in vitro for
positivo, um teste in vivo deverá ser realizado
___________________________________________
 Estratégia dos testes de genotoxicidade
Ensaios padrão para prosseguimento:

 Para substâncias com adequada disponibilidade

sistêmica os testes in vivo recomendados são:

 Teste de aberração cromossômica em medula óssea

de mamífero
 Teste de micronúcleo em eritrócito de mamífero
 Teste UDS in vivo
______________________________________
 Estratégia dos testes de genotoxicidade –
Ensaios específicos para prosseguimento
 Para substâncias que são de vida curta, mutágens reativos in
vitro ou para as quais não se tenha apresentado indicações de
disponibilidade sistêmica, devem ser considerados testes
alternativos in vivo com tecidos nos locais iniciais de contato com
o corpo.
 Testes alternativos devem também ser selecionados quando é
mais apropriado avaliar genotoxicidade em outros tecidos
sistêmicos diferentes da medula óssea ou fígado.

OPÇÕES:
 Ensaio Cometa in vivo
 Estudos in vivo de adutos no DNA
 Testes in vivo de mutação gênica com animais transgênicos
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Estratégia de testes de genotoxicidade – Ensaios de
prosseguimento após resultados in vivo positivos:

 Ensaio em células germinais deve ser considerado para

substâncias com resultados positivos em testes para efeitos
genotóxicos em células somáticas in vivo.
 Um estudo sobre a toxicocinética é preferido se resolver o
problema.
 Exposição de células germinais pode ser determinado com testes
indicadores (por exemplo: ensaio cometa; análise de adutos de
DNA).
 Testes específicos para investigar efeitos transmitidos (por
exemplo: teste de translocação hereditária; teste locus específico)
não serão normalmente exigidos para substâncias químicas
industriais e biocidas.
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 Ensaio de genotoxicidade:
Avaliação dos dados

I. Resultados de teste positivo:

 efeito “claro“?
 efeito reprodutível?
 dose-resposta?
 toxicidade / citotoxicidade?
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 Ensaio de genotoxicidade:
Avaliação dos dados

II. Resultados de teste “negativo“:

 protocolo de teste de acordo com guideline?
 dose apropriada / concentração?
 volatilidade da substância teste (in vitro)?
 apropriada ativação metabólica (in vitro)?
 reatividade da substância teste?
 apropriada exposição das células alvo (in vivo)?
_________________________________
 Ensaio de genotoxicidade :
Avaliação dos dados

III. Resultados de teste “equívoco“:

 tem que ser esclarecido
 repetição do teste

 introdução de variações no protocolo

__________________________
 Teste de genotoxicidade:
Avaliação dos dados
IV. Resultados de testes contraditórios:

 deve ser avaliado com respeito ao seu significado individual

 a qualidade de cada estudo tem que ser avaliado
(planejamento do estudo, reprodutibilidade dos dados,
relação dose-efeito, plausibilidade biológica, GLP)
 resultados de testes de mutagenicidade são geralmente de
maior significado do que os resultados de testes indicadores
 resultados de testes in vivo realizados apropriadamente
geralmente indicam um maior grau de confiança em
comparação com resultados de testes in vitro
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