INFORME DE TRABAJO PRÁCTICO

INMUNOENSAYOS II

1. Metodología utilizada:

Se utilizó para la determinación de la Hormona Luteinizante (LH) un método no

competitivo, con marca radiactiva, IRMA.

2. Fundamento del método:

Se utilizan tubos de ensayo con anticuerpos adsorbidos a la fase sólida en este caso son
mismos son monoclonales murinos anti-LH, se coloca en ellos el antigeno (suero del
paciente o control) y posteriormente un segundo anticuerpo policlonal de cabra anti-LH
humana marcado con 125I, luego de la incubación se detectará la señal, que aumentará
conforme aumente la concentración.

3. Cálculos de las concentraciones de la hormona en las muestras

correspondientes.

Tubo cpm U% Concentración

(mlU/ml)
Ct 60923 776,02
Ct' 60322
Bo (stdA) 56 0,00 0,00
Bo' (std A') 60
Std C 985 11,30 7,50
Std C' 895
Std D 1526 19,79 15,00
 Std D' 1679
Std E 2412 32,15 30,00
Std E' 2723
Std F 4871 63,71 74,00
Std F' 5189
Std G 7743 100,00 151,00
Std G' 7982
Control LH 2 1615 19,73 16,00
Control LH 2' 1580
Control LH 3 4021 50,37 56,00
Control LH 3' 3957
Muestra 1 1840 23,28 20,00
Muestra 1' 1910
Muestra 2 4285 53,46 62,50
Muestra 2' 4175

*No se incluyen el Estándar de Concentración B, ni la Muestra 3 debido a que no entran

en el rango de validez (ver conclusiones).

4. Validación analítica del procedimiento.

Rango de validez del duplicado

Tubo cpm Rango Validez D/F

Ct 60923 56336-64909 D
Ct' 60322 D
Bo (stdA) 56 54-62 D
Bo' (std A') 60 D
Std B 200 222-256 F
 Std B' 278 F
Std C 985 874-1006 D
Std C' 895 D
Std D 1526 1489-1716 D
Std D' 1679 D
Std E 2412 2386-2749 D
Std E' 2723 D
Std F 4871 4674-5386 D
Std F' 5189 D
Std G 7743 7307-8418 D
Std G' 7982 D
Control LH 2 1615 1485-1710 D
Control LH2' 1580 D
Control LH 3 4021 3707-4271 D
Control LH3' 3957 D
1
Muestra 1 1840 1742-2008 D
Muestra 1' 1910 D
2
Muestra 2 4285 3931-4529 D
Muestra 2' 4175 D
3
Muestra 3 390 400-460 F
Muestra 3' 470 F

D = dentro del rango

F = fuera del rango
1
M1: nº 322171
2
M2: nº 322911
3
M 3: nº 32351

Control del corrimiento del ensayo:

El Bo está comprendido en el rango de validez:

Bo: 58 Rango de validez: (54 ; 62)

5. Resultados:

Muestra 1 nº 322171: ˂ 61,5mUI/ml

Muestra 2 nº 322911 : 62,5 mUI/ml
 6. Conclusiones:

En este trabajo práctico realizamos un IRMA (ensayo inmunoradiométrico) para

dosar hormona luteinizante (LH). El diseño de este inmunoensayo es no competitivo.
Debido a la estructura proteica de la LH, podría haberse elegido cualquiera de
los dos diseños disponibles (competitivo y no competitivo). Pero el diseño no
competitivo ofrece como grandes ventajas mayores sensibilidad y especificidad repecto
al competitivo. La mayor sensibilidad está dada por la utilización de anticuerpos anti-
LH en exceso que van a captar toda la hormona presente en la muestra. La mayor
especificidad resulta del reconocimiento de la hormona por dos sitios antigénicos que a
los que se unen dos anticuerpos distintos: el de captura unido al tubo de ensayo y el
marcado.
El diseño del inmunoensayo se ratifica con el gráfico obtenido, en el que a
mayores concentraciones de analito se obtiene una señal mayor debida a la unión de los
anticuerpos marcados radiactivamente con la hormona unida al anticuerpo de captura.
El Inmunoensayo cuenta con estándares o calibradores, que son concentraciones
de analito conocidas calibradas con patrones internacionales (trazabilidad), y que
permiten asegurar que los resultados obtenidos por nuestro método son comparables al
método de referencia.
Por otro lado, los controles utilizados, son muestras comerciales o pooles, cuyo
valor de concentración es conocido y cuya composición debe ser lo más similar posible
a las muestras a analizar, y que se procesaran igual que estas. El hecho de que den
resultados dentro del rango esperado, como en este caso, nos permite evaluar la
determinación llevada a cabo y validarla (implica que las condiciones en que se ha
llevado a cabo la misma-reactivos, tiempos de incubación, los instrumentos utilizados-
etc-son correctas) e informar los resultados con certeza y seguridad.
La sensibilidad funcional del método, mínima concentración de analito que
puede detectarse con un coeficiente de variación menor al 20%, establece que no
puedan informarse resultados menores a este valor, ya que no se sabría con que error se
están determinando. En nuestro caso, como la sensibilidad funcional no se conocía,
hicimos la salvedad de que era igual a la sensibilidad teorica o analítica, pese a que en
verdad esta última se refiere a la mínima cantidad de analito detectable por el método
(límite de detección) y no al límite de cuantificación (esto no podría hacerse en un
laboratorio que trabaje con adecuadas normas de calidad).
Con respecto a los valores obtenidos se puede decir que en el caso de la M3 y STD B se
encontraron fuera del rango por lo cual, no se pudieron informar. A través de los
cálculos y el gráfico realizados se pudieron obtener las concentraciones de las muestras
1 y 2 y de los controles respectivos.

Anexo de Cálculos

Análisis de duplicados, estándares, controles y muestras:

Rangos de Validez:

Bo = (56 + 60)/2
Bo = 58

2DS= Bo x √2 x 0.05
2 DS = 58 x √2 x 0.05

2DS= 4.1

Rango de validez para Bo = 58 + 4.1

58 – 4.1

*El mismo procedimiento se realiza para cada par de estandars, muestras y controles.

Gráfico:

%U = porcentaje de Unión

%U = (B – NBS) / (Bmax-NBS)*100

Donde B = cpm promedio de cada par de tubos de la curva de calibración.

NBS= cmp de tubo de unión inespecífica (Bo)
Bmax= cmp tubo de unión máxima (tubo de estándar de mayor concentración)

Ejemplo Tubo de estándar C

%U = (940 – 58) / (7862.5 – 58) *100

%U = 11.3

*El mismo procedimiento se realiza para cada par de estandars, muestras y controles.
Para determinar la concentración de de las muestras se interpola en el gráfico.

Utilizando la hoja log vs log se graficó %U en función de la concentración de los

estándares: