MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II INFORME Nº: 06

DETECCIÓN DE SALMONELLA
I. OBJETIVOS

 Investigar la presencia de Salmonella en muestras de alimentos.

 Diferenciar Salmonella y Shigella del género Proteus.

 Estudiar las enterobacterias lactosa negativas, mediante la utilización de medios

de cultivo apropiados y pruebas bioquímicas.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram

negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 µm, anaerobios facultativos, no formadores de esporas,
generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa,
maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa.

Son generalmente catalasa positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos.

Son viables en diferentes condiciones ambientales, sobreviven a la refrigeración y

congelación y mueren por calentamiento (mayor a los 70 °C). El serotipo de Salmonella
está determinado por los siguientes tres tipos de antígenos:

 El antígeno somático (O),

 El antígeno flagelar (H) y
 El antígeno de virulencia (Vi).

Los antígenos somáticos son lipopolisacáridos componentes de la pared celular y se han

identificado 60 antígenos diferentes. Los antígenos flagelares son proteínas localizadas en el
flagelo móvil. El antígeno de virulencia es un polisacárido termolábil localizado en la
cápsula.

Antes del 1° de Julio de 1963 se utilizaban 3 especies de Salmonella: S. typhi, S.

choleraesuis y S. enteritidis y la mayoría de los serotipos pertenecían a esta última especie.
En la actualidad, todas las especies y subgrupos anteriores de Salmonella y Arizona se
consideran de la misma especie, pero pueden separarse en 6 subgrupos. La única excepción
la constituye S. bongori que por estudios de hibridación de ADN se constató que es una
especie distinta.

La Salmonella es un bacilo en forma de bastoncillo, negativa a la tinción de Gram, que

puede causar enfermedades diarreicas en los humanos.

Los miembros del genero salmonella son bacilos gran negativos, de 0.7 – 1.5 x 2- 5um no
fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados generalmente móviles por
flagelos peritricos.

Las salmonellas se multiplican bien en medios ordinarios, las salmonellas crecen en un

amplio rango de temperatura de 1 -28ºC y su pH ideal para su crecimiento es entre 6.6-8.2,
son incapaces de tolerar altas concentraciones de sal, y sobreviven en agua congelada
durante periodos prolongados.

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La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema

general que consiste de 5 pasos básicos:

Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo

no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta
manera una condición fisiológica estable.

Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos

condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir
otros microorganismos presentes en la muestra.

Aislamiento de placas, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios
selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que
permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas.

Pruebas bioquímicas, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de

Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

Pruebas serológicas, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la

identificación específica de un microorganismo.

III. EQUIPOS Y MATERIALES:

 Frasco con 225ml de caldo peptonado bufferado o caldo lactosado.

 Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento selenito-cistina

 Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento tetrationato seg. MULLER-

KAUFFMANN

 Placas con Agar SS (salmonella shigella), o agar bismuto – sulfito seg. WILSON
BLAIR.

 Placas con agar BPL (agar verde brillante - rojo fenol- lactosa seg.
KAUFFMANN).

 Tubos con agar hierro tres azucares TSI.

 Tubos de solución salina (0.85% NaCl).

 Antisuero polivalente 0 (somático)

 Pipetas de 10ml

 Portaobjetos para la prueba serológica.

 Asas y agujas de inoculación.

 Baño de agua caliente regulada a 43 (+/- 0.1°C) o incubadora regulada a 35-37°C.

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IV. PROCEDIMIENTO

Los métodos para el aislamiento de salmonella se consideran en los siguientes pasos

1. Pre enriquecimiento:

 Pesar 25g de muestra (huevo de gallina + piel de pescado=homogenizado)

 Sembrar 225ml de caldo de enriquecimiento caldo peptonado bufferado(pH=8)
o alternativamente en 225ml de caldo lactosado en un matraz.
 Incubar a 35-37ºC por 16-24 horas. Este paso es indispensable para alimentos
desecados y liofilizados.

2. Enriquecimiento selectivo:

 Llevar 1ml del cultivo anterior a 10ml de caldo de enriquecimiento selenito y a

10ml de caldo de enriquecimiento de tetrationato seg. MULLER y
KAUFFMANN. Se añade yodo 5 gramos más yoduro de potasio 6 g.
 Se coloca la muestra 100 ml de caldo tetrationato, se hierve y se distribuye en
matraz, se refrigera.
 Incubar a 43ºC por 24horas. O suspender directamente en 100ml de caldo
tetrationato unos 10g del material objeto de investigación
 Incubar a 43ºC durante 18-24horas a 37ºC durante 48horas.

3. Aislamiento de placas de agar selectivo:

 Partir de los cultivos de incubados realizar siembras por estrías sobre agar BPL
y sobre agar SS.
 Incubar a 35-37ºC el agar BPL durante 24horas
 El agar SS 18-24 horas a 37ºC.

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Examinar las placas:

 El agar BPL (medio de cultivo especifico) las colonias sospechosas de salmonella

son incoloras de un color intermedio entre rosa y el fucsia o entre traslucidos y
opacas y el medio que los rodea varía entre rosáceo a rojo.

 En el agar SS (medio de cultivo general) son incoloras y transparentes o

transparentes con centro negro.

 En el agar bismuto sulfito son pardas, grises y negras y presentan a veces un brillo
metálico, el medio que las rodea es por lo general oscuro al principio volviéndose
más tarde negro a medida que aumenta el periodo de incubación.

4. Pruebas bioquímicas:

1) Elegir dos o más colonias sospechosas de cada placa.

Si se trabaja con agar BPL y agar bismuto sulfito, purificar en placas con agar
MAC MONKEY.
2) Sembrar en agar nutritivo inclinado.
3) Incubar a 35- 37ºC por 24horas.
4) Comprobar la dureza de los cultivos mediante la coloración gran, realizar
prueba TSI.

Si se trabaja con el agar BPL y SS, realizar directamente la prueba TSI y demás
pruebas bioquímicas.

Prueba TSI:

Degradación lactosa, sacarosa, glucosa, producción de gas y H2S; en el medio de

cultivo en tubos de agar inclinado de hierro de tres azucares, el cual se inocula por
puntura y estría se incuba a 35-37ºC por 24horas.

Reacciones positiva:

 Parte inclinada: reacción alcalina (color rojo), lactosa y sacarosa negativa.

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 Parte columnar: reacción acida (color amarillo), glucosa positivo con o sin
producción de H2S.

Lectura:

 Fermentación de la Glucosa: fondo amarillo y tendido rojo.

 Fermentación de la Lactosa y/o Sacarosa: Tendido Amarillo.
 Producción de Gas: Ruptura del agar. Informar la producción de gas de 1 a 3 cruces (+).
 Producción de H2S: Ennegrecimiento del medio que puede ser de intensidad variable.
Informar la presencia de 1 a 3 cruces (+)

Prueba Ureasa: Se siembra la muestra y se incuba a 37ºC por 24 horas

Prueba LIA:

Interpretación de los cambios decarboxilación de la lisina:

Positivo: Fondo color morado (Descarboxilación) el tubo azul.

Se forma amino cadaverina la cual causa que el indicador de pH púrpura de bromocresol cambie
a color violeta. Como la descarboxilación solamente ocurre en medio ácido (bajo pH 6) el
cultivo es acidificado por la fermentación de la glucosa.

Negativo: el fondo amarillo.

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Desaminación de la lisina: positivo: el tendido rojo. La deaminación de la lisina produce α-

ácido ketocarboxílico compuesto que reacciona con la sal de yodo presente en el medio, bajo la
influencia del oxígeno y forma compuestos café rojizo

5) Prueba serológica:

Técnicas para la reacción con el antisuero polivalente o somático en portaobjetos.

1. Ensayar primero el antisuero con cultivos testigos a fin de comprobar su eficacia.

2. Usando un marcador de vidrio dividir la lámina portaobjetos en dos secciones de

1x2cm.

3. Depositar una pequeña cantidad de cultivo joven en agar nutritivo en la parte superior
de cada una de las secciones marcadas.

4. Depositar una gota de una de una solución de cloruro de sodio al 0.85% estéril en la
parte inferior de cada sección marcada. Con una aguja de inoculación estéril
emulsificar el cultivo con la solución salina en cada una de las secciones.

5. Añadir una gota de antisuero Salmonella polivalente 0 a uno de los cultivos

emulsificados y mezclar con un asa o aguja estéril.

6. Imprimir al portaobjetos movimientos de balance adecuados durante 1 minuto hasta

conseguir la mezcla completa.

7. Observar la reacción sobre un fondo oscuro.

a. Si se produce una aglutinación en la mezcla cultivo-solución salina-suero y

en la mezcla cultivo solución salina se considerara como prueba positiva.

b. Se considerara como prueba negativa si se produce aglutinación en la mezcla

cultivo – solución salina. Estos cultivos deberán probarse con antisuero
polivalente H (flagelar).

c. Se considerara no especifico sino produce aglutinación n ambas mezclas. En

este caso será necesario recurrir a las pruebas adicionales descritas por
EDWARDS y EWING 1972.

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V. RESULTADOS

1.-En Caldo Tetrationato. 2. En agar BPLS 3 . En agar SS

Pruebas bioquímicas

TSI LIA Caldo Úrea

VI. CONCLUSIONES

1. Debido a que los productos de origen animal pueden estar contaminado con
Salmonella deben tomarse medidas para evitar la presencia de estos
microorganismos en los alimentos como la cocción suficiente, el lavado correcto y
oportuno de las manos, y la educación sanitaria de los manipuladores.

2. En este casos las condiciones insalubres de los establecimiento no fijos, la falta de

servicios sanitarios y la inocrrecta manipulacion de los alimentos deterioran la
calidad de estos provocando contaminaciones cruzadas y un gran riesgo para la
población.

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3. RECOMENDACIONES

 Tanto los manipuladores de alimentos profesionales como familiares deberían

observar cuidadosamente las normas de higiene en la preparación de los
alimentos.
 Los manipuladores profesionales de alimentos deben notificar inmediatamente
a sus empleadores todo episodio de fiebre, diarrea, vómito o lesiones cutáneas
infectadas y visibles.
 Mantener la higiene
 Separar los alimentos crudos de los cocidos
 Cocer totalmente los alimentos
 Mantener los alimentos a temperaturas seguras
 Utilizar agua e ingredientes crudos seguros

4. CUESTIONARIO

1.- ¿Cuáles son los principales géneros de enterobacterias lactosa negativas que se
desarrollan en los alimentos y en cuáles?

 Género Escherichia
 Género Klebsiella
 Género Citrobacter
 Género salmonella

2.-¿Mediante qué pruebas bioquímicas se pueden diferenciar Proteus de Salmonella y

Shiguella en el agar SS.?

 Prueba indol
 Ptueba Indol
 Prueba LIA

3.-¿Qué enfermedades puede causar Salmonella en el ser humano?

Salmonelosis

Síntomas son dolor abdominal, diarrea, náuseas, vómitos, dolor de cabeza, fiebre,
escalofríos, dolores musculares y heces sanguinolentas. La mayoría de las infecciones
provienen del consumo de huevos, productos con huevo, aves y carnes crudos o mal
cocidos.

Fiebre tifoidea

La infección por Salmonella también puede desencadenar un cuadro de fiebre tifoidea,

una enfermedad potencialmente mortal con síntomas como fiebre de más de 102° F
(38,8° C), estreñimiento o diarrea, tos, confusión mental, agrandamiento del hígado y el
bazo y bradicardia.

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Enfermedad de Reiter

Luego de una infección por Salmonella, algunas personas pueden desarrollar una
patología llamada enfermedad de Reiter o artritis reactiva. Los síntomas son dolor
articular, irritación ocular y dolor al orinar.

4.-¿Qué características poseen las colonias de Salmonella en el agar SS?

Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican

el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o
rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no
fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias
transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro
negro debido a la formación de sulfuro de hierro.

5.- ¿Qué otros agares se utilizan para el reconocimiento de Salmonella?

 Caldo Tetrationato.
 Caldo selenito-cistina
 Vassiliadis-Rappaport
 Agar BPLS

6.-¿Qué indican las normas sobre la presencia de Salmonella para un producto

alimenticio terminado?

El primer paso es aislar el alimento. La transmisión se realiza a través de los alimentos,

destacando la carne y productos cárnicos (carnes picadas, salchichas), la leche y los
huevos (cremas, pasteles, helados). La refrigeración de los alimentos y una correcta
manipulación y cocción limitan la contaminación

5. BIBLIOGRAFÍA

 Bourgeois C.M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental S.A.1995.

 Frazier , W. C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia . España 2000.
 Mossel.D. Microbiología de los alimentos. Ed. Acribia. España 2000.
 DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
 MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
 Ministerio de Salud DIGESA. Manual de Análisis Microbiológico de Alimentos.
 FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la agricultura y
la Alimentación. Roma

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