Professional Documents
Culture Documents
TINJAUAN PUSTAKA
membahas mengenai pemurnia DNA yang paling sederhana, yaitu bila dibutuhkan
seluruh komplemen DNA sel bakteri. Modifikasi yang diperlukan untuk preparasi
DNA plasmid dan fag dapat diuraikan kemudian. Prosedur preparasi DNA total
kecuali DNA
Gambar 1. Langkah-langkah dasar pada preparasi DNA sel total dari kultur
bakteri
1
2.1.1 Menumbuhkan dan Memanen Kultur Bakteri
medium cair (broth culture). Medium untuk kultur harus memberikan campuran
tumbuh dan membelah secara efisien. Medium sin merupakan contoh medium
magnesium dan kalsium, juga glukose sebagai sumber karbon dan energi.
volume yang sekecil mungkin dan oleh karena itu pemanenan dilakukan dengan
memutar kultur dalam sentrifus. Kecepatan sentrifugasi yang cukup rendah akan
dinding sel yang kuat. Pada beberapa spesies, termasuk E.coli, dinding sel
memecah dan membuka isi sel bakteri dapat dibagi menjadi cara fisik dan cara
kimiawi. Cara fisik, yaitu sel dipecahkan dengan kekuatan mekanis dan cara
kimiawi, yaitu sel dilisis dengan memaparkannya pada senyawa kimia yang dapat
merusak integritas barier sel. Lisis secara kimia biasanya dilakukan dengan satu
senyawa yang merusak dinding sel dan senyawa lain yang merusak membran sel.
Senyawa yang akan dipakai tergantung pada spesies bakteri yang digunakan.
2
2.1.3 Pemurnian DNA dari Ekstrak Sel
Disamping DNA, ekstrak sel bakteri mengandung protein dan RNA dalam
murni. Pada beberapa ekstrak sel kandungan protein begitu besar sehingga
ekstraksi tunggal dengan fenol tidak cukup untuk memurnikan asam nukleat
dengan sempurna. Masalah ini dapat diatasi dengan melakukan beberapa kali
ekstraksi fenol, tetapi hal ini tidak dianjurkan karena setiap pencampuran dan
fenol, tetapi kebanyakan molekul ini akan tetap bersama DNA dalam lapisan
akuosa. Satu-satunya cara yang efektif untuk menghilangkan RNA adalah dengan
enzim ribonuklease yang akan memcah molekul ini dengan cepat menjadi subunit
ribonukleotida.
Preparasi yang baik sering menghasilkan larutan DNA yang sangat pekat
larutan yang encer sehingga dalam hal ini penting untuk menggunakan cara untuk
Dengan adanya garam (kation monovalen seperti Na+) dan pada temperatur -20 oC
dengan baik. Pada larutan DNA yang pekat larutan etanol dapat ditambahkan pada
3
antara kedua larutan. Salah satu cara yang dapat digunakan adalah dengan cara
memasukkan batang kaca melalui etanol sampai larutan DNA. Ketika kaca ini
ditarik molekul DNA akan melekat dan tertarik keluar dari larutan dalam bentuk
dengan tepat berapa banyak DNA yang ada dalam larutan. Konsentrasi DNA
Banyaknya radiasi ultraviolet yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus
dengan banyaknya DNA dalam sampel. Biasanya absorben diukur pada 260 nm.
Pada suatu sampel DNA yang murni rasio absorben pada 260 nm dan 280 nm.
diperlukan. DNA sel total dari tanaman atau hewan akan diperlukan jika tujuan
modifikasi mungkin harus dilakukan sehubungan dengan ciri-ciri khusus sel yang
akan digunakan.
Jelas bahwa pertumbuhan sel dalam medium cair tidak selalu memadai
walaupun kultur sel tanaman dan hewan menjadi semakin penting dalam
4
digunakan untuk organisme lain, misalnya lisozim yang berpengaruh pada sel
jenis dinding sel, tetapi sering teknik secara fisik, seperti penumbukan bahan yang
padat dengan penumbuk, sering lebih efisien. Dilain pihak kebanyakan sel hewan
tidak mempunyai dinding sel sama sekali dan dapat dihancurkan dengan
Untuk pemurnian dari kultur digunakan cara yang sama seperti pada
preparasi DNA sel total, kultur sel yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam
medium cair, kemudian dipanen, dan dibuat ekstrak sel. Ekstrak ini dihilangkan
protein dan RNAnya, kemudian DNA dipekatkan dengan cara presipitasi etanol.
preparasi DNA sel total. Pada preparasi plasmid perlu pemisahan DNA plasmid
dari DNA kromosom bakteri yang besar jumlahnya yang juga terdapat dalam sel.
Meskipun kedua jenis DNA tersebut mungkin sangat sulit, tetapi hal
sangat penting bila yang akan digunakan untuk wahana cloning adalah plasmid.
Adanya kontaminasi DNA kromosom dalam jumlah kecil pun pada percobaan
cloning gen dapat dengan mudah memberikan hasil yang tidak dikehendaki.
Untung terdapat beberapa cara untuk menghilangkan DNA kromosom pada waktu
pemurnian plasmid daan penggunaan cara ini, baik dengan satu cara maupun
dengan cara kombinasi, dapat menghasilkan isolasi plasmid yang sangat murni.
plasmid dan DNA kromosom, terutama dalam hal ukurannya. Plasmid yang
5
paling besar ukurannya hanya merupakan 8% ukuran kromosom E.coli dan
kebanyakan plasmid lebih kecil dari ukuran ini. Oleh karena itu teknik yang dapat
memisahkan molekul DNA yang kecil dari molekul yang besar akan sangat efektif
yang paling sederhana adalah bentuk linear dan sirkular, plasmid dan kromosom
bakteri adalah sirkular, tetapi pada waktu preparasi ekstrak sel kromosom akan
selalu pecah menjadi fragmen-fragmen yang linear. Dengan demikian suatu cara
yang dapat memisahkan molekul sirkular dari molekul linear akan menghasilkan
waktu preparasi ekstrak sel, jika sel dilisiskan di bawah kondisi yang dikontrol
dengan seksama, maka kerusakan yang terjadi pada DNA akan sangat sedikit.
Fragmen DNA yang dihasilkan akan masih sangat besar, yaitu lebih besar
daripada plasmid, dan akan dapat dihilangkan bersama debris sel dengan cara
sentrifugasi. Proses ini dipermudah karena kromosom secara fisik melekat pada
selubung sel dan fragmen-fragmen akan selalu mengendap bersama debris sel bila
perlekatan tersebut tidak pecah. Oleh karena itu pemecahan sel harus dilakukan
mencegah pecahnya sel secara cepat. Pada keadaan ini terbentuk sferoplas, yaitu
sel yang sebagian tidak berdinding yang masih mempunyai membrane sitoplasma
6
yang utuh. Lisis sel kemudian diinduksi dengan deterjen non-ionik seperti Triton
X-100 (deterjen ionic, seperti SD, menyebabkan pecahnya kromosom). Cara ini
seluruhnya DNA plasmid. Meskipun demikian lisat yang jernih akan selalu masih
mengandung DNA kromosom. Lagi pula jika plasmid sendiri merupakan molekul
yang besar maka plasmid ini dapat juga mengendap bersama debris sel. Oleh
karena itu pemisahan berdasarkan ukuran jarang memuaskan dan kita harus
bakteri.
Pelilitan penting dalam preparasi plasmid karena molekuk yang berlilitan dapat
digunakan dua macam cara yang berbeda. Keduanya dapat memurnikan DNA
plasmid dari ekstrak sel, walaupun dalam praktek hasil yang paling baik diperoleh
7
2.2.3 Amplifikasi plasmid
hanya merupakan bagian kecil dari DNA total dalam sel bakteri. Hasil DNA darri
memberikan cara untuk meningkatkan hasil ini. Tujuan amplifikasi adalah untuk
perbedaan pokok antara pemurnian DNA fag dan preparasi DNA sel total
atau DNA plasmid adalah bahwa bahan permulaan yang digunakan untuk fag
biasanya bukan ekstrak sel. Hal ini disebabkan karena partikel bakteriofag dapat
diperoleh dalam jumlah besar dari medium ekstrasel pada kultur bakteri akan
mengendap dan partikel fag tertinggal dalam suspense. Kemudian partikel fag
8
9