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MONOGRAFIA
DIRECTOR
CODIRECTOR
Universidad Javeriana”
A la Doctora Diana Patiño por permitirme trabajar con ella y brindarme siempre su
ayuda y paciencia durante el desarrollo de este trabajo. A todas las personas del
colaboración.
7
INDICE DE TABLAS
Pág.
8
INDICE DE FIGURAS
Pág.
9
TABLA DE CONTENIDO
Pág
2. Justificación 3
3. Objetivos 4
3.1 Objetivo General 4
3.2 Objetivos específicos 4
4. Marco Teórico 5
4.1 Generalidades de las inmunodeficiencias primarias 5
4.1.1 Epidemiología 6
4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias 9
4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias 12
4.3.1 Ligadas a X 12
4.3.1.1 Enfermedad granulomatosa Crónica (EGC) 12
4.3.1.2 Agamaglobulinemia ligada al sexo (enfermedad de Bruton) 13
4.3.1.3 Síndrome de Hiper IgM 14
4.3.1.4 Síndrome de Wiskott Aldrich 15
4.3.2 Autosomicas recesivas 16
4.3.2.1 Inmunodeficiencia combinada severa 16
4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA) 17
4.3.2.3 Deficiencia de la Fosforilasa de Purina (PNP) 17
4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2 18
4.3.2.5 Deficiencia de Zap70 18
4.3.2.6 Deficiencia de Jak3 19
4.3.2.7 Deficiencia de Adhesión leucocitaria 19
10
4.3.2.10 Ataxia Telangiectasia 21
4.4 Pruebas diagnosticas 22
4.4.1 Pruebas de primera etapa 23
4.4.2.1.3 Isohemaglutininas 28
4.2.2.3.4 Quimiotaxis 37
4.2.2.3.5 Fagocitosis y actividad bactericida de los neutrófilos 38
4.2.2.3.6 Adherencia 39
4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4 39
11
4.2.2.4.3 CD59 en eritrocitos 40
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 45
6. BIBLIOGRAFIA 46
12
1. Definición del problema
13
de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema esquelético y del
corazón, entre otros. Los defectos que implican alguna alteración en la función de
la célula de B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes que a menudo y
según el compromiso de la respuesta humoral pueden terminar en septicemia
bacteriana. La carencia de la producción de anticuerpos puede también aumentar
la susceptibilidad a infecciones por enterovirus dando por resultado meningitis viral
crónica y giardiasis entre otras. Las células T son esenciales para el control de la
enfermedad viral y fúngica, no obstante, también proporcionan la función de
colaboración a las células B mediante la liberación de citocinas como activadoras
de la respuesta inmune de tipo humoral garantizando así, una respuesta
adecuada y efectiva. Enfermedades como la inmunodeficiencia combinada severa
(IDSC) de LT y LB da como resultado susceptibilidad aumentada a enfermedades
por patógenos virales, fúngicos y bacterianos. Los pacientes con desórdenes de
granulocitos son susceptibles a las enfermedades por Estaphylococcus y a
infecciones por microorganismos Gram negativos (Lim, 2004).
14
2. Justificación
Las razones previamente expuestas nos llevan a revisar cuáles son las pruebas
de laboratorio que existen actualmente que puedan ser útiles para la confirmación
diagnostica temprana por parte del personal medico que acompaña a pacientes
con algún tipo de inmunodeficiencia primaria y de esta manera proporcionar una
herramienta de consulta para llevar a cabo un diagnostico mas certero.
15
3. Objetivos
Realizar una revisión de la literatura científica lo más actualizada posible sobre las
pruebas del laboratorio de inmunología clínica útiles en el diagnostico de pacientes
con inmunodeficiencias primarias.
16
4. Marco Teórico
17
infecciones que presentan a repetición. Otros síntomas que podrían estar
asociados a las inmunodeficiencias primarias son; erupciones y alteraciones en la
pigmentación de la piel, anomalías en el desarrollo de la cara, del sistema
esquelético y del corazón. Los defectos que implican alguna alteración en la
función de los linfocitos B dan lugar a infecciones pulmonares recurrentes, a
menudo relacionados con septicemia bacteriana. La carencia de la producción de
anticuerpos puede también aumentar la susceptibilidad a las infecciones por
enterovirus dando como resultado el desarrollo de meningitis viral crónica y
giardiasis gastrointestinal. Las células T son esenciales para el control de la
enfermedad viral y fúngica ya que colaboran con las células B mediante la
liberación de citocinas que promueven una respuesta inmune adecuada y efectiva.
Así, desórdenes como la inmunodeficiencia combinada severa de LT y LB da
como resultado una mayor susceptibilidad a los patógenos virales, fúngicos y
bacterianos (Lim, 2004).
4.1.1 Epidemiología:
18
En cuanto a la prevalencia de inmunodeficiencias primarias se encuentran
diferentes reportes como el publicado por la asociación latinoamericana de
inmunodeficiencias primarias LAGID en 1998 en el que se encontró que las
inmunodeficiencias primarias por defectos en los anticuerpos son las más
frecuentes (Zelazko, 1998).
Inmunodeficiencia
combinada severa Deficiencias de
Desordenes de (5%) Complemento
fagocitos (2%)
(9%)
Anormalidades
asociadas
a defectos en los
granulocitos
(8%)
Síndromes
Deficiencia de
asociados con
anticuerpos
otras
(58%)
anormalidades
(18%)
19
deficiencias combinadas, estos datos concuerdan con los encontrados
mundialmente en otros estudios como los de LAGID en 1998. (Tabla 1)
20
4.2 Clasificación de las inmunodeficiencias primarias
El aumento reciente sobre el conocimiento de los defectos moleculares de muchas
de las inmunodeficiencias primarias ha llevado a grandes avances en el
diagnóstico y manejo de estas patologías permitiendo clasificarlas de acuerdo al
tipo de defecto genético que presentan en: Inmunodeficiencias ligadas a X (Tabla
2) e inmunodeficiencias autosomicas recesivas que a su vez se subclasifican en
inmunodeficiencia combinada severa Tabla 3) y en no asociadas a
inmunodeficiencia combinada severa (Tabla 4)
Desorden (año de
Localización
definición del defecto Gen Defecto Prueba diagnostica
cromosomica
molecular)
Componentes de los
receptores para IL-2, IL-4, Expresión de CD154
Inmunodeficiencia
Cadena IL-7, IL-9, IL-15, sobre LT activados por
combinada severa ligada a X Xq13
común γ desarrollo de células T y citometría de flujo, análisis
(1993)
NK, función de células T y de mutaciones
B
Expresión de CD145
Síndrome de Hyper-IgM
CD40L Cambio de Isotipo, sobre LT activados por
(deficiencia de CD40L) Xq26
(CD154) función de LT citometría de flujo, análisis
(1993)
de mutaciones
21
Tabla 3. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, Asociadas a inmunodeficiencia
combinada severa (Jones, 2000)
Defectos en la
Deficiencia del gen de
recombinación de DNA
activación de la recombinasa RAG1 y Análisis de las mutaciones
11p13 afectando inmunoglobulinas
(RAG 1 y 2) (1996) Síndrome RAG2 en RAG1 y RAG2
y el gen del receptor de de
de Omenn
LT
Intensidad de fluorescencia
Deficiencia en el receptor de LT Función y señalización del
11q23 CD3γ/CD3ε de CD3, análisis de
(1987) receptor de LT
mutaciones
Receptor de señalización
Activación y expresión de
Deficiencia de JAK3 (T-B+NK- de Il-2, Il-4, IL-7, IL-9, IL-15,
19p13 JAK3 JAK3, análisis de
SCID) (1995) desarrollo de LT y NK,
mutaciones
Función de LT y LB
22
Tabla 4. Inmunodeficiencias autosomicas recesivas, no asociadas a inmunodeficiencia
combinada severa (Jones, 2000)
Desorden (año de
Localización
definición del defecto Gen Defecto Prueba diagnostica
cromosomica
molecular)
Análisis de la expresión de
Deficiencia de adhesión Defectos en la adhesión y CD18/CD11 por
21q22 CD11/CD18
leucocitaria tipo I (1987) migración de leucocitos citometría, análisis de
mutaciones
Anormalidades en los
Inclusiones gigantes en
Síndrome de Chediak microtubulos mediado por
1q42 LYST los granulocitos, análisis
Hisgashi (1996) las proteínas lisosomales
de mutaciones
circulantes
Defecto en el ensamblaje
Deficiencia de MHC clase I
del péptido y en la
(1994) 6p21 TAP2 Expresión de MHCI
presentación de las
(1999) 6p21 TAP1
moléculas de MHCI
Receptor de
Susceptibilidad inherente a Expresión del receptor de
Interferón
micobacterias Defecto en la producción Interferón γ, expresión de
6q23 γ, IL-12
(1996) de Interferón γ y en la IL-12, Expresión del
5q31 p40,
(1998) función de señalización receptor de IL-12, análisis
19p13 Receptor β1
(1998) de mutaciones
de IL-12
23
4.3 Aspectos Clínicos de las inmunodeficiencias Primarias
4.3.1 Ligadas a X
24
citoplasmáticos hacia la membrana y su acople al citocromo. La ausencia o
disfunción de alguno de estos componentes imposibilita el correcto funcionamiento
enzimático
Figura 2. Relación entre el sistema NADPH oxidasa que esta afectado en los pacientes con
granulomatosis crónica (Mackay, 2000).
25
manifestaciones clínicas son las infecciones recurrentes, pero además de ellas los
pacientes pueden presentar cuadros de artritis crónica o cuadros semejantes a
dermatomiocitis. Las infecciones virales son controladas normalmente en su
mayoría con excepción de infecciones por enterovirus del sistema nervioso central
(meningoencefalitis crónica). El examen físico muestra la ausencia de ganglios
linfáticos superficiales y amígdalas. Las inmunoglobulinas séricas son
indetectables o están francamente disminuidas (por lo general la IgG es menor de
200 mg/dl) y los linfocitos B en sangre periférica están ausentes o muy
disminuidos (menor al 2 %). La inmunidad celular no está afectada (Oleastro,
2001).
Esta deficiencia está determinada por una alteración en la proteína kinasa Btk
(Bruton tirosin kinasa), proteína relacionada con la maduración y proliferación del
linfocito B. La falta de actividad de esta proteína como consecuencia de
mutaciones en el gen que la codifica genera un bloqueo en la maduración a nivel
del estadio de células pre-B (Jones, 2000).
Se caracteriza por presentar tanto niveles normales como muy elevados de IgM
con marcada hipogammaglobulinemia IgG e IgA. Además de las infecciones
recurrentes por gérmenes extracelulares encapsulados, los pacientes suelen
presentar infecciones por Pneumocystis carinii, episodios de neutropenia,
manifestaciones de autoinmunidad (citopenias hemáticas, artritis) y mayor
predisposición a las neoplasias de estirpe linfoide (linfomas y leucemias). Estos
pacientes comúnmente presentan adenomegalias, hipertrofia amigdalina y
hepatoesplenomegalia. El recuento de linfocitos B circulantes es normal y la
inmunidad celular generalmente está conservada (Oleastro, 2001).
26
La falla molecular responsable se ubica en el ligando de CD40, molécula
normalmente expresada en linfocitos T activados, imprescindible para el cambio
de isotipo de IgM a IgG e IgA. Mutaciones en el gen de esta molécula condicionan
la falta de síntesis o la síntesis de una molécula no funcional (Jones, 2004).
27
El gen responsable del síndrome del Wiskott Aldrich codifica para la proteína
WASP localizada en el cromosoma Xp11.22-p11.23, se han identificado diferentes
mutaciones localizadas a través del gen, pero la más común envuelve la
sustitución de nucleótidos. La interacción entre la proteína WASP el Cdc42 de la
familia GTPasa Rho y el complejo organizador del citoesqueleto Arp2/3 es muy
importante en la transducción de señales que cuando presentan algún tipo de
alteración se refleja en problemas a nivel de señalización, polarización, movilidad y
fagocitosis de las células (Chien, 2004).
28
4.3.2.2 Deficiencia de Adenosin Deaminasa (ADA)
29
4.3.2.4 Deficiencia de Rag1 y Rag2
30
disminución marcada de los CD8+. A pesar de encontrarse en número total normal
o incluso elevado, estos linfocitos CD4+ son incapaces de responder a la
estimulación in vitro frente a mitógenos específicos o células alogénicas. Los
linfocitos B y las células NK son normales tanto en número como en función (Lim,
2001).
31
El diagnóstico se confirma demostrando por citometría de flujo la ausencia o
disminución de la expresión de la molécula CD18 en la superficie celular. Las
formas severas tienen un curso fatal en los primeros años de vida por lo cual
deben ser sometidas a un transplante de medula ósea alogénico. Para LAD-2 se
ha visto un número reducido de pacientes con manifestaciones similares a LAD 1,
acompañadas de talla baja y retardo mental, en los que se ha encontrado
deficiencia de otra molécula denominada Sialil-Lewis X (CD15s) (Oleastro, 2001).
32
La enfermedad se manifiesta generalmente antes de los 5 años, los niños
afectados no presentan sintomatología hasta que desarrollan alguna infección por
microorganismos intracelulares como el virus de Epstein Barr el desencadenante
mas común de la sintomatología (Rugeles, 2004).
33
pacientes suelen fallecer en la segunda década de sus vidas por secuelas
pulmonares o enfermedad linfoproliferativa (Lim, 2001).
34
4.4.1 Pruebas de primera etapa
35
Tabla 5. Alteraciones en el extendido de sangre periférica observadas en las
inmunodeficiencias primarias (Castaño, 2003)
* Enfermedad de Kostman
* Síndrome de Schwachman
* Neutropenia cíclica
* Neutropenia familiar benigna
* Mielokatexis
* Síndrome Chediak-Higashi
Neutropenia
* Hipoplasia cartílago-pelo
* Agamaglobulinemia ligada al X
* ID común variable
* Síndrome Hiper-IgM
* Deficiencia de adhesión leucocitaria
* Tipo III
DISMINUCIÓN
* ID combinada severa
* Síndrome de DiGeorge completo
* Hipoplasia cartílago-pelo
Linfopenia
* ID común variable
* Ataxia telangiectasia
* Agamaglobulinemia ligada al X
ALTERACIONES EN EL * Síndrome Wiskott-Aldrich
NÚMERO DE CÉLULAS * ID común variable
* Síndrome de Schwachman
Trombicitopenia
* Síndrome Hiper-IgM ligado al X
* Agamaglobulinemia ligada al X
* Síndrome Chediak-Higashi
* Deficiencias de adhesión leucocitaria tipos 1,2,4
Neutrofilia * Infecciones bacterianas recurrentes asociadas a las ID
con producción normal de fagocitos
* Enfermedad proliferativa ligada al X
Linfocitosis
* Síndrome de Omenn
* Neutropenia familiar benigna
Monocitosis
AUMENTO * Enfermedad de Kostmann
* Síndrome de Omenn
* Síndrome de Job
Eosinofilia * Síndrome Wiskott-Aldrich
* Síndrome Nezelof
* ID combinada severa
* Infecciones recurrentes asociadas a las diferentes
Trombocitosis
inmunodeficiencias
* Anemia megaloblástica y células blásticas asociadas a
Aumento defectos en la maduración o carencia de cofactores
enzimáticos (vitaminas del complejo B)
36
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y
carga eléctrica, a través de una matriz gelatinosa
(www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electrof
oresis.html). Es muy útil en el diagnóstico de trastornos humanos paraproteínicos
como mieloma múltiple y algunas inmunodeficiencias primarias.
En algunas ocasiones se puede detectar con esta técnica una notable disminución
en las concentraciones de gamma globulinas sericas como en el caso de la
hipogammaglobulinemia (Figura 4). Por este método no se puede detectar la
reducción de IgA o IgM a valores muy bajos, ya que representan una fracción
relativamente pequeña del total de inmunoglobulinas sericas (Stites, 1999).
.
Albúmina α1 α2 β γ
Alb α1 α2 β γ
37
4.4.2 Pruebas de Segunda Etapa
38
Se han estandarizado varios métodos para la cuantificación serica de las
inmunoglobulinas. El clásico es la inmunodifusión radial que fue utilizada en por
varios años. Actualmente el método más usado para la cuantificación de
inmunoglobulinas es la turbidimetria, esta técnica es la medida de la turbidez de
una solución o suspensión en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica
con un espectrofotómetro o se estima mediante comparación visual con
soluciones de turbidez conocida (www.iqb.es/diccio/t/tu.htm).
39
4.4.2.1.3 Isohemaglutininas
40
como CD10. Los anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos se utilizan
para detectar células que tienen los marcadores de LB (Stites, 1999).
41
La representación grafica de las poblaciones celulares usualmente se realizan
utilizando diagramas de puntos. Estos diagramas son usados habitualmente tanto
en la adquisición celular como en su análisis y se presentan sobre un eje de
coordenadas X/Y. Las poblaciones celulares, representadas por agrupaciones
homogéneas de puntos, se situarán dependiendo de sus características físicas de
dispersión (SSC/FSC) y antigénicas (Figura 6) (www.citometriadeflujo.com).
42
aproximadamente 48-72 horas, observando la aparición de una pápula, si esta
pápula tiene un diámetro mayor de 2 mm se considera positiva (Folds, 2003).
Deficiencias inmunitarias
Congénitas
Deficiencias combinadas de inmunidad celular y humoral
Ataxia-telangiectasia
Síndrome de Nezelof
Inmunodeficiencia combinada severa
Síndrome de Wiskott-Aldrich
Celulares
Síndrome de DiGeorge
Candidiasis monocutanea
Adquirida
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida
Sarcoidoisis
Leucemia linfocitica crónica
Carcinoma
Los linfocitos T, poseen dos subgrupos que pueden distinguirse por dos proteínas
de superficie especificas para cada uno; los linfocitos T ayudadores expresan en
su superficie la molécula CD4 y los linfocitos T citotóxicos expresan CD8. La
mayor parte de los LT CD8+ tienen actividad citotóxica es decir, tienen la
propiedad de destruir células que expresen moléculas extrañas en su superficie,
43
estos linfocitos son muy importantes en la defensa contra infecciones virales. Los
linfocitos CD4+ funcionan como células cooperadoras promotoras de la
proliferación, maduración y función inmunitaria de otros tipos celulares mediante la
secreción de citocinas (Stites, 1999).
Aproximadamente el 70% de los linfocitos T de sangre periférica son CD4+ o
CD8+ (Stites, 1999) y su cuantificación se realiza principalmente por la técnica de
citometría de flujo (Figura 7).
R1
44
moléculas coestimuladoras como el CD28. Todas estas moléculas pueden ser
identificadas mediante citometría de flujo, siempre que exista el anticuerpo
monoclonal específico para cada una.
45
Figura 8. Prueba de liberación de cromio (Herrera, 1999).
Las células NK son un componente importante del sistema inmune innato, son
capaces de lisar las células infectadas por virus o células tumorales y son la fuente
de una gran variedad de citocinas, cuando se presentan defectos en este tipo de
células se incrementa la posibilidad de presentar mayor susceptibilidad a
infecciones virales.
46
Figura 9. Análisis de células NK (CD16+/CD56+) por Citometría de Flujo. Cortesía Dra.
Adriana Cuellar.M.Sc, Universidad Javeriana.
Los neutrófilos son leucocitos derivados de la medula ósea con una vida media
finita, que tienen una función principal en la defensa contra infecciones
ocasionadas por diferentes microorganismos. El neutrófilo desempeña una función
principal como célula efectora o asesina. Sin embargo, en el flujo sanguíneo y en
los espacios extravasculares, los neutrófilos ejercen efectos antimicrobianos a
través de interacciones con anticuerpos, complemento y factores quimiotacticos
(Stites, 1999).
47
Para poder evaluar el tipo de defecto que presentan estas células existen varias
clases de pruebas de laboratorio como la reducción de NBT, la medición de
radicales libre de oxigeno y la expresión de beta-2 integrinas, entre otras.
La reducción del NBT es una prueba útil para analizar la integridad metabólica de
los neutrófilos ya que la falla en la reducción del colorante se asocia con
enfermedad granulomatosa crónica por lo tanto los neutrófilos de estos pacientes
no pueden dar muerte a ciertos microorganismos intracelulares ni generar
radicales superoxido (Stites, 1999).
48
Entre los métodos directos está la medición de la concentración de agentes
oxidantes, que es muy difícil debido a su corta vida media. El uso de la
espectrometría de la resonancia de rotación (espín) de electrones, es la única
técnica analítica que mide directamente las especies oxígeno reactivas, pero
debido a su costo y complejidad su aplicación en el ser humano es difícil. Los
métodos indirectos se realizan mediante la determinación de los productos finales
de la acción oxidante sobre algunas moléculas biológicas tales como los lípidos,
ácidos nucleicos y proteínas. Los métodos para medir peróxidos lipídicos son el
patrón de oro, cuando se trata de probar el papel de los oxidantes en algún tipo de
daño celular. Es posible medir los dienos conjugados derivados del ácido
araquidónico mediante espectrofotometría UV, los hidroperóxidos lipídicos
mediante cromatografía líquida de alta presión (Gastell)
4.2.2.3.4 Quimiotaxis
49
Cámara superior con
células fagocíticas
Filtro
Figura 10. Quimiotaxis en filtro. Cortesía Dra. Diana Patiño C. M.Sc. Pontificia Universidad
Javeriana.
50
4.2.2.3.6 Adherencia
El sistema del complemento trabaja en asocio con otros componentes del sistema
inmune innato y adaptativo, proporcionando vías y mecanismos para la
destrucción de microorganismos o células dañadas. Esta conformado por más de
40 glicoproteinas que trabajan en cascada y existen en el plasma en forma de
precursores.
4.2.2.4.1 Cuantificación de C3 y C4
Muchas de las proteínas del complemento pueden ser cuantificadas por métodos
inmunoquimicos como nefelometría, inmunoprecipitación, turbidimetria, RIA y
ELISA (Wen, 2004). Actualmente la técnica más utilizada es la turbidimetria.
51
4.2.2.4.3 Complemento hemolítico 50 (CH50)
52
4.2.3 Pruebas de tercera etapa
Las Btk, BLNK y NEMO, están relacionadas con la maduración y proliferación del
linfocito B, y se pueden determinar por Western Blot.
En la prueba de Western blot primero se debe hacer una electroforesis en gel de
duodecil sulfato sodico poliacrilamida (SDS-PAGE), luego las proteinas obtenidas
se transfieren a una matriz de soporte por ejemplo nitrocelulosa donde se emplea
un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés en este caso Btk, BLNK
o NEMO, un segundo anticuerpo marcado con una enzima y contra la especie en
53
la que se produjo el anticuerpo monoclonal que usualmente es ratón. El anticuerpo
secundario se puede marcar de diversas formas con el fin de producir una señal
detectable, que va a ser observada como bandas en el papel de nitrocelulosa
(Stites, 1999)
54
producido su efecto máximo sobre la síntesis de DNA. La síntesis de DNA se mide
mediante el marcaje de los cultivos con intermitencias de timidina tritiada (3H-Tdr),
este es un precursor de nucleósido que se incorpora en el DNA que se acaba de
sintetizar. La cantidad de 3H-Tdr incorporada es relativa a la velocidad de síntesis
del DNA y se determina por la cuenta de centelleos en un espectrofotómetro de
líquido de centelleo (Stites, 1999).
55
linfocitos, estas proteínas se encuentran alteradas principalmente en la
inmunodeficiencia combinada severa, por lo que su analisis se hace muy
importante en el diagnostico de esta patología. Su cuantificación se puede realizar
mediante la prueba de western blot utilizando anticuerpos monoclonales anti- ZAP-
70, JAK3 y STAT-1.
Para realizar la prueba de Western Blot para evaluar el sistema NADPH oxidasa
se realiza primero una electroforesis en gel de poliacriamida (SDS-PAGE) de la
membrana del neutrófilo y sus fracciones citosolicas. A las bandas obtenidas de
esta electroforesis se le agregan anticuerpos monoclonales del ratón contra
gp91phox, gp22phox, p47phox o p67phox y se detectan con un anticuerpo anti
IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Boer,1998).
56
5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
57
6. BIBLIOGRAFIA
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