UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

Instituto de Investigación de la Facultad de zootecnia

IMFORME DE INVESTIGACION
Efecto de la Conservación de semen ovino con los
dilutores

NOMBRE DE INVESTIGADOR:

ROMAN ASTO NAYDA MIGUELINA

Huancayo, 17 de julio de 2017

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN

I. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN pág. 3

1.1 FUNDAMENTACIÓN DEL PROBLEMA pág. 3

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA pág. 3
1.3 HIPÓTESIS pág. 3
1.4 JUSTIFICACIÓN pág. 3
1.5 OBJETIVOS pág. 3

II. MARCO TEÓRICO pág. 3

2.2 ANTECEDENTES pág. 3

2.3 BASES TEÓRICAS pág. 3
2.4 DEFINICIÓN DE TÉRMINOS BÁSICOS

III. METODOLOGÍA pág. 7

3.1 TIPIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN pág. 7

3.2. MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN pág. 8
3.4 VARIABLE

IV. RESULTADOS

V. DISCUSIÓN

CONCLUCIONES

RECOMENDACIONES

BIBLIOGRAFÍA

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INTRODUCCIÓN
La finalidad de diluir el semen es aumentar el volumen del eyaculado y facilitar la
preservación de la viabilidad del espermatozoide por un tiempo mayor. Un diluyente
eficiente mantiene o mejora el medio que rodea al esperma suministrándole energía y
protección contra productos del metabolismo y variaciones de temperatura (Gordon,
1997).
Con el fin de evitar el daño durante el proceso de congelamiento, se han desarrollado
numerosos diluyentes en base a amortiguadores de pH (tris, ácido cítrico), azúcares de
bajo peso molecular (fructuosa, glucosa) que pasan a través de la membrana celular
sirviendo como fuente de energía para el esperma, agentes protectores de membrana
(yema de huevo, leche descremada) que contienen macromoléculas que proveen
protección contra el shock por frío, y crioprotectores (glicerol y otros polialcoholes,
aminoácidos) que reducen la formación intracelular de cristales de hielo durante el
proceso de congelado-descongelado (Molinia et al., 1994; Salamon y Maxwell, 1995).
El problema de nos lleva a realizar la investigación es por la escaza información
existente sobre la conservación de la cobertura vegetal en lomo-largo y se eligió este
tema por la importancia que conlleva su investigación que está directamente relacionada
con la infiltración de agua en el suelo.

El interés del estudio es netamente académico por tratarse de estudiantes que tienen
como objetivo aprender los temas que respecta el conocimiento científico.

El método empleado en el estudio fue de investigación , detallando cada uno de las

partes a partir de los datos obtenidos atreves del proceso de la Investigación.

El Informe está organizado de la siguiente manera: Planteamiento de la Investigación,

Marco teórico, Metodología, Resultados, Discusión, Conclusiones y Bibliografía

Los objetivos de estudio son:

1.conocer el efecto de la conservación de semen ovino con los dilutores .

2. conocer la importancia de los dilutores de semen

3. definir la composición de diluyentes para congelar semen

4. cuales son los principios de preservacion

3
I. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN

1.1. FUNDAMENTACIÓN DEL PROBLEMA

El problema fue la escasa información sobre el efecto de la conservación de semen de

ovino con los dilutores .

La crio preservación de semen y la inseminación artificial son técnicas reproductivas

utilizadas para conseguir un rápido progreso genético por consiguiente su importancia
dentro de la investigación y que tendrá como principal solución generar información
para disipar las dudas de los lectores.

1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

PROBLEMA GENERAL
¿Cuál es el efecto de la conservación de semen con los dilutores?

PROBLEMAS ESPECIFICOS

¿ conocer la importancia de los dilutores de semen?

¿definir la composición de diluyentes para congelar semen?
¿cuales son los principios de preservación?

1.4. JUSTIFICACIÓN

Los daños producidos en los espermatozoide durante el proceso de

criopreservación podrían ser prevenidos parcialmente controlando la velocidad
de congelamiento, usando un dilutor adecuado y agregando agentes
crioprotectores apropiados. En la criopreservación de semen ovino, se ha
venido evaluando diferentes tipo de dilutores y agentes crioprotectores

4
II. MARCO TEÓRICO

2.2. ANTECEDENTES DEL PROBLEMA

En un trabajo de investigación realizado que se llevó acabo en las instalaciones de

banco nacional de semen de la universidad agraria la molina, se realizó un estudio que
se tomó como objetivo evaluar el efecto de los dilutores y salió como resultados.

• El uso del dilutor Tris evidenció niveles adecuados en la conservación de la

motilidad individual espermática del semen antes y después del congelamiento.

• Fue factible la congelación de semen de ovinos en pellets de 0.3 ml.

• El factor raza del carnero no fue influyente ni determinante en relación a las

características seminales durante la congelación.

2.3 BASES TEÓRICAS

2.3.1 CARACTERISTICAS REPRODUCTIVAS DEL CARNERO

Los ovinos son animales poliestruales estacionales, con una estacionalidad

reproductiva regida por el fotoperíodo, su efecto es más marcado en las hembras que
en los machos. Los machos no llegan a ser infértiles durante la estación no reproductiva
, p ero muestran una disminución en el tamaño testicular y con ello una disminución de
la producción de espermatozoides. Por tanto, la actividad sexual suele ser más intensa
y eficiente durante la estación reproductiva que se da con el fotoperíodo decreciente.
Cuando disminuye el número de horas diarias de luz se estimula la secreción de FSH,
LH y testosterona (Coy, 1995a). Sin embargo, la actividad sexual puede ser modificada
por otros factores como la temperatura, alimentación, enfermedad y el estrés (Jainudeen
y col., 2000).
La pubertad en el carnero es una etapa relativamente larga, que se caracteriza por un
aumento progresivo de la secreción de testosterona, de la espermatogénesis y del
tamaño testicular (Coy, 1995a). Recién entre los 4 a 6 meses de edad se presentan las
primeras cópulas con eyaculación de espermatozoides viables, momento en el que
alcanzan un 40 a 60 % del peso del animal adulto. Al igual que en el vacuno y caprino,
la madurez sexual se correlaciona mejor con el peso corporal que con la edad
(Jainudeen y col., 2000).
Sin embargo, la producción de semen de un carnero adulto no se alcanza hasta que los
testículos pesen alrededor de 100 g (Lapwood, 1986).

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 2.3.2 CARACTERISTICAS DEL SEMEN DEL CARNERO

El semen está conformado por una fracción líquida o plasma seminal y una fracción
celular que la conforman los espermatozoides (Garner y Háfez, 2000). A partir de
diversos reportes (ver Cuadro 1), se tiene que en promedio el carnero tiende a eyacular
una cantidad de semen que oscila entre 0.75 a 2 mL., conteniendo una alta
concentración de espermatozoides, los cuales son altamente viables.

2.3.3 PLASMA SEMINAL

El plasma seminal ovino está compuesto por las secreciones provenientes de la próstata
y de las glándulas vesiculares y bulbouretrales. Durante la eyaculación, dichas
secreciones son vertidas hacia la uretra generándose así una mezcla con la suspensión
de espermatozoides y las secreciones ampulares del conducto deferente (Garner y
Hafez, 2000).
La importancia funcional del plasma seminal es cuestionable, dado que es posible
inducir la preñez por inseminación empleando espermatozoides colectados del
epidídimo. Sin embargo, el plasma seminal sí muestra ser un componente esencial en
el apareamiento natural porque actúa como portador y protector de los espermatozoides
(Garner y Hafez, 2000), situación que es más importante en el apareamiento de la oveja
y la vaca, en las cuales el eyaculado es depositado en la vagina.

2.3.4 Espermatozoide del carnero

Los espermatozoides maduros son célula alargadas conformadas por una cabeza
aplanada portadora del núcleo y una cola que contiene el aparato necesario para la
motilidad celular (Garner y Hafez, 2000).

6
La célula espermática del carnero está cubierta en su totalidad por la membrana
plasmática (Garner y Hafez, 2000), cuya composición lipídica es notablemente diferente
a la de las demás células somáticas. Los lípidos vienen a ser las sustancias que
confieren la característica de permeabilidad de la membrana espermática (Martínez y
Morros, 1996). A su vez juegan un rol importante en los procesos de maduración y de
capacitación espermática.
Morfológicamente el espermatozoide está conformado por una cabeza, en la cual se
encuentra el acrosoma y por un flagelo o cola. La cabeza está conformada por el núcleo,
el cual es aplanado y de apariencia oval y que a su vez contiene una cromatina dispuesta
de manera muy compacta (Garner y Hafez, 2000). El acrosoma es la parte anterior que
recubre al núcleo espermático, es un delgado saco membranoso de doble capa
estrechamente adherido al núcleo. En el acrosoma están contenidas varias enzimas
hidrolíticas que participan en el proceso de la fecundación, como la proacrosina,
hialuronidasa, esterasas y ácidohidrolasas (Mann y Lutwak-Mann, 1981).
La cola espermática está conformada por un cuello y tres segmentos subsiguientes, el
medio, el principal y el caudal. El segmento medio está comprendido entre el cuello y el
anillo citoplásmico y está conformado por el axonema, las fibras densas y numerosas
mitocondrias dispuestas en un patrón helicoidal. El segmento principal continúa en
sentido posterior al anillo citoplásmico y está conformado por el axonema y las fibras
densas asociadas. Finalmente, el segmento caudal está conformado únicamente por el
axonema y la membrana plasmática (Garner y Hafez, 2000).

2.4 Colección de Semen

El uso de la vagina artificial se ha convertido en uno de los mejores métodos para la
colección de semen en ovinos por su rapidez y limpieza, por no ser estresante para el
animal y por proporcionar un semen de alta calidad Este dispositivo es una imitación de
la vagina de la oveja y que proporciona los estímulos térmicos (temperatura) y
mecánicos (presión) adecuados para la erección del pene y la eyaculación. La calidad
de semen obtenido depende de la frecuencia de colección, pero sobre todo, del estado
del animal al momento de la colección (Evans y Maxwell, 1990).

La vagina artificial consta, normalmente, de un cilindro que puede ser de goma y es

rígido de 12 a 15 cm de largo y alrededor de 5 cm de diámetro en el cual se hace un
orificio provisto de un tapón de rosca (Apéndice 1). Por el centro del dispositivo se
introducirá el agua caliente a 40-42 °C y aire para simular las condiciones de
temperatura y presión adecuadas. Entre el tubo de la vagina y el agua caliente, debe
existir un tubo de látex que sirve como funda para la vagina (Bearden y Fuquay, 1982).

Se utiliza una hembra para estimular la libido y la monta. El operador, situado al lado
derecho de la hembra, coloca la vagina artificial en dicho flanco y la sujeta con la mano
derecha, de tal forma que el extremo abierto quede mirando hacia el macho. La válvula
de la vagina debe dirigirse hacia abajo con una inclinación de aproximadamente 45°,
evitando el contacto con el carnero macho. En el momento del salto, se dirige con la
mano izquierda el pene hacia el interior de la vagina 15 artificial, procurando hacerlo
siempre del prepucio para evitar la retracción del mismo. Cuando el pene entra en

7
contacto con la superficie caliente de la vagina artificial, el semental da el característico
¨golpe de riñón¨ y eyacula dentro tubo colector (Evans y Maxwell, 1990).

Existen otras técnicas de colección de semen como la de electro eyaculación, que

consiste en introducir un electrodo bipolar, a una longitud no mayor de 10cm, en el recto
del macho. Se aplican estímulos eléctricos en serie y a intervalos de tiempo definidos
consiguiendo la erección del pene y la posterior eyaculación. Toda la operación dura
entre 10 y 15 minutos, con considerables variaciones individuales (Hafez, 2002).

2.5 Evaluación de las características de una muestra seminal

La evaluación espermática nos permite estimar la fertilidad potencial de cualquier
semental y consiste en la evaluación, en el laboratorio, de parámetros espermáticos que
son indicadores de la calidad del semen del reproductor de interés (Sorensen, 1991).

Estos parámetros pueden ser de carácter macroscópico (color, aspecto, volumen, pH)
ya que pueden ser evaluados a simple vista de la muestra seminal; y microscópicos
(motilidad masal, motilidad individual, concentración espermática, anormalidades,
integridad de membrana, vitalidad) que deben ser evaluados utilizando un microscopio
(Aisen, 2004).

Los valores normales de los parámetros espermáticos considerados en una evaluación

seminal se resumen en el Apéndice 2. Se toma por sentado que cualquier muestra
seminal a utilizarse en un estudio experimental debe cumplir con los valores
mencionados.

2.5.1 Color

La cantidad de espermatozoides presentes en el eyaculado hace que la muestra tome

una coloración blanquecina – amarillenta cuando la muestra es de buena calidad.
Cuando es de baja calidad, es similar a la leche acuosa (Hafez, 1996).

En este sentido puede admitirse una relación directa entre la intensidad del color y la
riqueza espermática (Pérez y Pérez, 1985). Un color rojizo indica la presencia de sangre,
así como los colores grises o marrones indican contaminación o infección, debiéndose
en estos casos, desechar el eyaculado y proceder a la revisión del carnero (Gibbons et
al., 2004).

2.5.2 Aspecto

El aspecto del semen depende de la relación de dos constituyentes: la concentración de

espermatozoides y la calidad del plasma seminal. Las muestras de alta consistencia
contienen más espermatozoides que las muestras más acuosas (Apéndice 3). El semen
debe tener un aspecto cremoso - lechoso y uniforme (Evans y Maxwell, 1990).

2.5.3 Volumen

Cuando la recolección se realiza con vagina artificial, normalmente se obtienen

eyaculados de aproximadamente 1 ml. Este volumen, varía según la edad, tamaño,
condición corporal del animal, frecuencia de colección y destreza del operador (Gibbons
et al., 2004). Los volúmenes de eyaculados pueden admitirse como normales cuando

8
sus rangos van de 0.5 a 2.0 ml con una media de 0.8 ml. Se sabe, además, que las
cópulas reiteradas a intervalos demasiado cortos disminuyen el volumen recolectado y,
por el contrario, la excitación acentuada aumenta (Pérez y Pérez, 1985).

2.5.4 pH

El valor del pH es el resultante de la neutralización entre las reacciones glandulares de

acción tampón y la concentración iónica del material de las ampollas de Henle y del
epidídimo. En ovinos, el pH tiende a la acidosis, fenómeno importante ya que en él radica
su capacidad fecundante. La reacción alcalina es características de una escasa fertilidad
y muchas veces va acompañada de necrospermia y de una disminución en la
concentración espermática y motilidad (Evans y Maxwell, 1990). En el carnero y en el
macho cabrío, los valores de pH oscilan entre 6.2 – 7.3, llegando incluso a citarse como
normal un pH de 7.5 (Pérez y Pérez, 1985). En el Perú, Ascue (1985), trabajando con
muestras de ovinos de la sierra central, reportó un rango de pH de entre 6.3 y 6.8. 2.5.5
Motilidad Masal

2.5.6 Motilidad Individual

Es una de las pruebas que se utiliza con mayor frecuencia para evaluar la calidad de
semen diluido. En algunas especies, parece estar correlacionada con la capacidad
fertilizante del espermatozoide. Si existe menos del 40% de espermatozoides con
movimiento lineal progresivo, es menos probable que haya 18 fertilidad. Debido a la
influencia que tienen las variaciones de temperatura sobre la motilidad espermática, las
muestras deben ser evaluadas tan pronto sea posible (WHO, 1992). La técnica consiste
en la observación microscópica a 400 aumentos (400x) de una muestra de semen
diluido en una lámina portaobjetos temperada. Se consideran espermatozoides mótiles
aquellos que aparecen activos y con movimiento progresivo. La motilidad individual es
el porcentaje de espermatozoides mótiles con respecto al total de espermatozoides
visualizados (Sorensen, 1991; Arthur, 1991).

En el Perú, Quispe (1998), evaluando 3 tiempos de equilibrio (2, 10 y 18 horas) en

semen de carneros, reportó motilidades de 78.3%, 73.5% y 71.6%, respectivamente,
utilizando el dilutor Tris–yema de huevo. Con el dilutor leche– yema de huevo reportó
motilidades de 78.3%, 75.0% y 73.3% a los mismos tiempos de equilibrio. Por su parte,
Ramírez et al. (2001), trabajando con semen refrigerado, encontró que los porcentajes
de motilidad individual fueron de 85.2 + 4.33% con dilutor Tris–Fructosa–Yema de
huevo, 84.2 + 1.44% con dilutor Citrato–Glucosa–Yema de huevo y 85.8 + 5.2% con
dilutor leche descremada. Observaron, también, que la motilidad disminuye al aumentar
el tiempo de de refrigeración a 5°C, obteniéndose valores de motilidad a las 48 horas
post refrigeración de 75.0 + 9.01% con Tris–Fructosa–Yema de huevo, 77.5 + 2.50%
con Citrato-Glucosa-Yema de huevo y de 67.5 + 15.21% con leche descremada
(Ramírez et al. 2001).

2.5.7 Concentración espermática

La concentración espermática está definida como el número de espermatozoides por

unidad de volumen, expresada normalmente en millones por ml de eyaculado (esp/ml).

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Los diferentes métodos utilizados para su cálculo varían en función de la rapidez y
exactitud (Evans y Maxwell, 1990). Son varios los métodos que permiten determinar la
concentración espermática. Entre ellos, figuran el recuento de la cámara de Neubauer
y el 19 método del fotocolorímetro. Ambos métodos son precisos y, si bien el
fotocolorímetro permite un recuento más rápido, su costo es más elevado que la cámara
de Neubauer (Gibbons, 2004). Debido a que se quiere aprovechar al máximo una
muestra de semen de buena calidad, se procura dosificarlo (tener la cantidad óptima de
espermatozoides en un volumen determinado) y así manejar varias muestras para
inseminación. Por tanto, es necesario conocer el número de espermatozoides por
mililitro de eyaculado ya que nos permitirá saber cuántas dosis se pueden preparar; en
pocas palabras, cuántas veces puedo diluirlo (factor de dilución) (Evans y Maxwell,
1990). Guillén (2001), evaluó las características seminales de carneros de la raza
Blackbelly del INIA, obteniendo concentraciones de 3.14x109 espermatozoides/ml. Así
mismo, Huamán (2003), reportó concentraciones de 3.63, 3.316, 2.78 y 2.67 x 109
esp/ml.

2.5.8 Morfología espermática

La morfología espermática se refiere al estudio de la forma del espermatozoide y permite

determinar las posibilidades que tiene una célula espermática para fertilizar. El objetivo
de esta evaluación es eliminar aquellos espermatozoides no ideales para la
reproducción (Madrid y Bohada, 1993). La presencia de altos porcentajes de formas
anormales parece estar asociada con inmadurez sexual, procesos degenerativos y
patologías (Ascue, 1985). Las anormalidades encontradas en los espermatozoides se
clasifican en dos: anormalidades primarias y secundarias. Las primeras ocurren durante
el proceso de espermatogénesis y pueden ocurrir a nivel del acrosoma (pérdida del
borde apical, con abultamiento, arrugado, incompleto, desdoblado), cabeza (piriforme,
flagelado, lanceolado, irregular, angosta, cabeza doble, macrocéfalo, microcéfalo),
cuello (fractura, retroacción, con presencia de gota citoplasmática) y cola (corta, doble,
retorcida, con presencia de gota citoplasmática). Las anormalidades secundarias
ocurren durante el transporte de los espermatozoides 20 desde el túbulo seminífero y/o
epidídimo hasta su salida por la uretra durante la eyaculación. En este tipo de
anormalidades tenemos cabezas sueltas, acrosoma desprendido, etc. (Evans y
Maxwell, 1990). La morfología espermática es una de las características más estudiadas
en el análisis seminal (Madrid y Bohada, 1993). Su estudio ha utilizado tradicionalmente
técnicas de tinción entre las que destacan la eosina-nigrosina (Merino, 2003). La
introducción de los sistemas de Análisis Espermáticos Asistidos por Computadora
(CASA, por sus siglas en inglés), ha permitido realizar evaluaciones morfométricas
objetivas y cuantitativas del semen de diversas especies (Casey et al., 1997). Un
eyaculado de carnero se considera normal cuando el porcentaje de formas anormales
es inferior al 15%. Existen variaciones en la morfología espermática debido al estrés
ambiental, factor individual, temperatura, estación del año, etc. (Gibbons, 2004). Merino
(2003), trabajando con 3 carneros de 2 a 3 años de edad, reportó 12,8% de
anormalidades. Así mismo, Brito et al. (2003), trabajando con el semen de carneros de
las razas Rambouiller y Suffolk; y, utilizando frotis de semen teñido con los colorantes
eosina y nigrosina, reportaron 15% de anormalidades.

2.5.9 Vitalidad

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 La membrana celular de los espermatozoides representa una barrera al paso de
tinciones al medio intracelular. Los espermatozoides vivos no dejan pasar ningún tipo
de colorante a su medio intracelular, mientras que los muertos, los absorben. Este
fenómeno biofísico permitió el desarrollo de técnicas orientadas a la diferenciación de
espermatozoides vivos de muertos (Fernández et al., 1998). Actualmente, existe toda
una serie de técnicas destinadas a identificar espermatozoides vivos y muertos. Se han
descritos numerosas tinciones basadas en la permeabilidad selectiva de la membrana
plasmática como por ejemplo la eosina-nigrosina (Colas, 1975) y azul de Tripán
(Suttiyotin y Thwaites, 1992) de tal manera que si el espermatozoide está vivo, la
membrana celular actúa como 21 barrera impermeable impidiendo el paso del colorante
a través de ella, permaneciendo la célula sin teñirse. Ozturkler et al. (2000), trabajando
con 6 caneros de la raza Kivircik y utilizando una tinción a base de eosina y nigrosina,
reportaron 77.45% de espermatozoides vivos en semen fresco.

2.5.10 Integridad de la membrana espermática

Una de las propiedades bioquímicas más importantes de los espermatozoides es la

capacidad de que las moléculas puedan ser transportadas a través de su membrana.
Esto no solo es esencial para la motilidad espermática, sino también para la inducción
de la reacción acrosómica y posiblemente otros eventos relacionado a la fertilización
(Jeyendran et al., 1984). La prueba de permeabilidad vía endosmosis o ¨Hiposmotic-
swelling test¨ (HOST), consiste en colocar a los espermatozoides a un medio de presión
hiposmótica más baja que la fisiológica, lo que causa la entrada de agua hacia el interior
de la célula en un intento de equilibrar la presión osmótica interna con la del medio
externo (Pérez-Llano et al., 1999). Para que esta respuesta se produzca, la membrana
plasmática del espermatozoide debe de estar íntegra y con los mecanismos de
intercambio de fluidos funcionando correctamente. La entrada de agua provoca en estas
células un hinchamiento y enrollamiento del flagelo. Las células con la membrana física
funcionalmente dañada no experimentaran cambios en la forma del flagelo (Apéndice
5).Se considera endosmosis positiva cuando se aprecia como el flagelo del
espermatozoide, en un medio hiposmótico (125mOsm/Kg), toma forma helicoidal y
asciende dentro de la misma membrana celular. Esto se debe a un desequilibrio
osmótico entre el medio extracelular y el intracelular, situación que el espermatozoide
trata de vencer difundiendo agua al compartimiento intracelular y, como consecuencia,
la célula aumenta su volumen (Vazquez et al., 1997). En condiciones fisiológica
normales, la fecundación no ocurre si la membrana plasmática del espermatozoide es
bioquímicamente inactiva, aun cuando permanezca estructuralmente intacta, por tanto,
la prueba hiposmótica es 22 un indicador preciso porque permite distinguir el adecuado
funcionamiento de la membrana plasmática (Tamuli y Watson, 1992). Aisen (2004),
indica que el porcentaje de endosmosis en semen fresco de ovino varía de 60% a 90%
y en semen refrigerado es mayor al 60%. Además, sostiene que la endosmosis se
correlaciona estrechamente con la fertilidad in vitro, siendo su valor para el ovino de
0.86.

2.6 Diluyente

A) Definición:

11
Los diluyentes son compuestos químicos, o conjunto de sustancias que preservan la
viabilidad y fertilidad del semen, a la vez que posibilitan el procesamiento de un número
previamente establecido de espermatozoos, acondicionados en envases adecuados, de
un tamaño conveniente para la inseminación.

El esperma eyaculado no sobrevive durante largos períodos, a menos que se hayan

añadido agentes protectores. Tradicionalmente, los diluyentes que se han utilizado para
tal fin deben:
a) Proteger contra los efectos dañinos de los cambios térmicos (especialmente en las
membranas con sustancias crioprotectoras penetrantes y no penetrantes)
b) Proporcionar nutrientes como fuentes de energía
c) Proporcionar un medio de amortiguación de pH, compensando la producción de acido
láctico durante la congelación
d) Mantener una presión osmótica adecuada
e) Mantener un equilibrio electrolítico
f) Aumentar el volumen del eyaculado, a fin de permitir múltiples dosis para inseminar
(Evans, 1990; Aisen, 2004)

C) Funciones de un Diluyente.

1. Proveer nutrientes a los espermatozoos, como fuente de energía.

2. Proteger los espermatozoos contra los efectos dañinos de un enfriado
rápido.
3. Proveer un buffer para prevenir efectos nocivos de cambios de PH, al
formarse ácido láctico, resultante del metabolismo de la glucosa por los
espermatozoos.
4. Mantener una presión osmótica y un balance electrolítico adecuado.
5. Inhibir el crecimiento bacteriano.
6. Aumentar el volumen de semen de modo que pueda ser utilizado para
múltiples inseminaciones.
7. Proteger los espermatozoos del congelado.

D) Componentes Básicos de un Diluyente.

1) Agua Destilada. Actúa como solvente para los componentes semanales y del
diluyente.
Debe ser destilada (o mejor bidestilada) para eliminar la presencia de metales
pesados en solución, que son dañinos para el espermatozoo.

2) Sustancias Buffer y no iónicas. (Disueltas para mantener la osmolaridad y el PH del

medio).
Entre éstas se encuentran:
- Citrato de Sodio (dihidrato)
- TRIS
- TES
- TEST (TRIS + TES)
- Glutamato Monosódico
- Diferentes buffers con combinaciones de soluciones salinas o
carbohidratos
- Preparaciones a base de leche

12
3) Materiales orgánicos.

Tienen la capacidad de prevenir el shock de frío (yema de huevo o leche).

Concentraciones de aproximadamente 20% de YEMA DE HUEVO son comunes en la
mayoría de los diluyentes. La yema de huevo actúa previniendo el shock de frío a través
de sus constituyentes:

Lipoproteínas, fosfolípidos y lecitinas.

En el caso de la LECHE (que puede ser entera o descremada), la caseína es la
sustancia responsable de la protección contra el shock de frío.
Cuando se utiliza leche en un diluyente, ésta debe ser calentada por encima del punto
de pasteurización, para destruir la lactenina que es espermicida (los grupos sulfóxido
liberados al calentar la leche, probablemente eliminan este factor tóxico). El
procedimiento adecuado consiste en calentar la leche hasta 92 o 95 grados por 10
minutos, dejándola enfriar y repitiendo la operación un par de veces más (tyndalización).
A los efectos prácticos, puede ser utilizada la denominada "leche de larga vida" o leche
en polvo reconstituida, ya que el
Proceso de preparación de ambas incluye un calentamiento adecuado para la
destrucción de la lactenina.

4) Agentes crioprotectores.

El glicerol es el agente crioprotector más comúnmente usado. La concentración varía

con el diluyente utilizado y el modo de congelación. Otro agente crioprotector es el di-
Metil Sulfóxido (DMSO), aunque no es utilizado generalmente en los diluyentes para
semen.

5) Azúcares.
Los monosacáridos (Glucosa y Fructosa) son azúcares de los cuales el espermatozoo
puede obtener energía para sus procesos vitales. También actuaran como sustitutos
de electrolitos, manteniendo el balance osmótico del diluyente.
Di y Trisacáridos, los cuales no pueden ser metabolizados por el espermatozoo,
proporcionan algo de acción crioprotectora, principalmente como moléculas
relativamente grandes que contribuyen a mantener un balance osmótico, actuando
como sustitutos de electrolitos. No son capaces de penetrar la membrana espermática
y probablemente disminuyen los efectos de la concentración de solutos durante la
congelación y la descongelación. Proporcionan mejores resultados cuando se agregan
al semen en la fracción glicerolada antes de la congelación y no están presentes en la
primera fracción del diluyente. Para el congelado de pellets (pastillas), donde la tasa de
congelado es rápida, estos azúcares reemplazan efectivamente las sales bufferado de
los diluyentes.
6) Aditivos. Tales como algunas enzimas, pueden mejorar la fertilidad.
7) Antibióticos. Para controlar el crecimiento de microorganismos. Los más utilizados
son Penicilina y Estreptomicina.

2.6.1 Diluyentes para semen

Los diluyentes de semen permiten incrementar el volumen de los eyaculados para

inseminar a un mayor número de hembras con un semen de alta calidad, que en el caso
de monta natural, sería a una sola. Además, como el plasma seminal sólo otorga al

13
espermatozoide una protección limitada contra los cambios bruscos de temperatura, el
uso de diluyentes que contienen agentes protectores de la membrana celular durante el
enfriamiento a 5°C (generalmente yema de huevo) y/o el congelamiento (generalmente
glicerol) es de vital importancia.

Los diluyentes seminales deben cubrir una serie de requisitos tales como pH, capacidad
tampón, osmolaridad y fuerza iónica. Deben también contener una fuente que sirva de
reserva para darle energía al espermatozoide, no deben deteriorarse durante el
almacenamiento previo a su uso y, sobre todo, proporcionar a la célula espermática
protección frente a efectos de baja temperatura (Cortés Gallego, 1997).

La gran mayoría contiene tris(hidroximetil) aminometano (Tris) o citrato como buffers,

glucosa o fructosa como fuente de 23 energía y Penicilina y/o Estreptomicina como
agentes anti microbianos (Bearden, 1980; D'Alessandro et al., 2001; Gibbons, 2004).

El uso de Tris en diluyentes para semen ovino fue descrito en algunas investigaciones
a principio de los años setenta. Sus características principales son poseer una buena
capacidad tampón, actividad diurética y osmótica, además de baja toxicidad en altas
concentraciones.

Existe una amplia gama de diluyentes desarrollados a través del tiempo, los cuales
presentan diferentes composiciones y cualidades. De todos éstos, el diluyente Tris-
glucosa-yema de huevo desarrollado por Salomon y Maxwell (2000), es hasta hoy el
más recomendado para semen refrigerado y congelado de carnero. Hay diluyentes que
se utilizan para refrigerar, los cuales son soluciones acuosas tamponadas a las que se
les añade una fuente de energía (glucosa, fructosa) y un crio protector no penetrante,
que es opcional dependiendo de la temperatura y tiempo de refrigeración (leche
descremada, yema de huevo).

Algunos diluyentes de refrigeración incorporan antioxidantes o agentes quelantes de

manera experimental, observándose un aumento en el porcentaje de fertilización in vitro
en los diluyentes que incorporan en su composición superoxidodismutasa (SOD) y
catalasa (Hammerstedt, 1993). Los diluyentes empleados en la conservación de células
espermáticas deben cumplir una las siguientes condiciones mínimas (Paulenz et al.,
2002):

 Ser isotónico con el plasma seminal (320 mOsm/kg) cuando es utilizado en

refrigeración e hiperosmótico (400 mOsm/Kg) en congelación.

 Poseer un pK próximo a 7 y capacidad tampón con el fin de mantener el pH en la

neutralidad, compensando la producción de ácido láctico durante la congelación

.  Contener moléculas que protejan a los espermatozoides frente al frío. Estas se

clasifican en función de su capacidad de atravesar la membrana plasmática en:
sustancias crioprotectoras penetrantes y no penetrantes.

 Contener en su constitución una fuente de energía, siendo la glucosa y fructosa las

más utilizadas.

 Estar libre de bacterias y contaminación, para lo cual debe contener antibióticos.

14
2.6.2. Composición de diluyentes para congelar semen

Los dilutores de semen para la criopresevación están compuestos por diferentes

sustancias que cumplen las siguientes funciones:
a) proveer nutrientes como fuente de energía.
b) proteger a los espermatozoides del efecto dañino del enfriamiento.
c) mantener un adecuado equilibrio del pH.
d) mantener una adecuada presión osmótica y balance electrolítico.
e) inhibir el crecimiento bacteriano.
f) incrementar el volumen del semen para que pueda ser usado para múltiples
inseminaciones .g) proteger a los espermatozoides durante el congelamiento (Háfez,
2000).

Entre los componentes utilizados para mantener un adecuado pH e incrementar

el volumen seminal tenemos:

a) Tris:

El compuesto tris-[hidroximetil] aminometano (C4H11NO3), conocido como Tris se

emplea en la criopresevación del toro), caprino y carnero (Molinia y col., 1994a;, 1995;
2000; 2002; Salamon y Maxwell, 2000), entre otros. Es una sustancia orgánica, de
aspecto cristalino, su peso molecular es de 121.14 g/L., que posee la particularidad de
formar soluciones acuosas y sistemasreguladores de la concentración de iones de
hidrógeno. Posee una constante de
disociación básica, tal que una solución de 50 mM de Tris corresponde a un pH
de 10.4, el cual protege a los espermatozoides de cambios de pH. Por este motivo
para ser utilizado en la criopreservación de semen requiere estar asociado con el
ácido cítrico (Anduaga, 1980).
El Tris por su capacidad amortiguadora, osmótica y el ser de baja toxicidad, aun en altas
concentraciones, es empleado en la criopreservación de semen para, entre otros
aspectos, neutralizar los productos de desecho resultantes del metabolismo de los
espermatozoides, y en particular al ácido láctico (Salamon y Maxwell, 1995a). Los
espermatozoides ovinos toleran un rango de concentraciones entre 100 a 400 mM
(Salamon y Visser, 1972; Molinia y col.,
1994b).
b) Leche:
La leche es un producto que se utiliza como diluyente ya que proporciona un
medio isotónico, mantiene la viabilidad espermática y su uso se difundió
inicialmente en el semen bovino, en ovino se utiliza para semen fresco y
refrigerado ya que se han tenido resultados variables en la congelación.

Composición de la leche: La lactosa es el carbohidrato característico de la leche. Es

un disacárido compuesto por glucosa y galactosa.

La materia grasa está constituida fundamentalmente por triglicéridos muy distintos que
forman una mezcla compleja; la leche también contiene pequeñas cantidades de otros
lípidos, como fosfolipidos, colesterol, ácidos grasos libres y digliceridos.

15
Alrededor de las cuatro quintas partes de las proteínas de la leche son caseínas que a
su vez, están constituidas por una mezcla de aproximadamente 10 proteínas diferentes.
El resto corresponde esencialmente a las llamadas proteínas del suero y además hay
algunas otras proteínas minoritarias, como las enzimas. Los minerales no equivalen
exactamente al contenido de sales.

Los principales son K, Na, Mg, Cl y fosfato. La leche contiene muchos otros elementos
en cantidades traza (Walstra et al, 2001).

C) Yema de Huevo:

Su acción consiste en proteger a los espermatozoides contra el choque térmico por frío,
además la fracción lipídica de la yema de huevo (lecitina y cefalina) tiene una acción
protectora, y la fracción lipoproteica, un efecto conservador. (Daza, 1994).

Composición de la yema de huevo: En las tablas 10 y 11 viene expuesta la

composición de la yema del huevo. Tanto desde el punto de vista químico como desde
una perspectiva funcional, las proteínas y los lípidos de la yema deben ser considerados
de forma conjunta.

n efecto, la yema es una fuente de lípidos fácilmente dispersables en el agua, y que

permiten la emulsión de otras sustancias. Estas propiedades se deben al alto contenido
en fosfolípidos y al importante hecho de que todos los lípidos (incluidos los triglicéridos)
están asociados a dos proteínas, al menos: la vitelina y la vitelinina. Por medio de la
centrifugación pueden separarse en tres fracciones los constituyentes de la yema:

a) Una fracción lipoproteica de baja densidad (lipovitelina de baja densidad) que

contiene un 90% de lípidos; de ellos, la casi totalidad de los triglicéridos. Esta fracción
representa, aproximadamente, dos tercios de la materia seca de la yema.

b) Una fracción de mayor densidad que sedimenta una forma de gránulos. Supone el
23% de la materia seca total. Contiene la totalidad de la fosfovitina asi como las
lipovitelinas de alta densidad (lipoproteínas). Estas últimas contienen un 18% de lípidos
repartidos, casi por igual, entre triglicéridos y fosfolipidos.

c) Una fracción de proteínas solubles que contiene, principalmente, las livetinas y

algunas trazas de otras proteínas séricas.

PRINCIPIOS DE PRESERVACION

Los requerimientos de los espermatozoos son, primariamente, para el mantenimiento

de las funciones vitales para sobrevivir, incluyendo energía para su motilidad.
Los espermatozoos deben estar vivos para ser fértiles y la motilidad ha sido utilizada
para determinar la viabilidad. La motilidad es, sin embargo, un reflejo de la actividad
flagelar y no necesariamente garantiza que esa célula sea fértil. La integridad del
material genético en la cromatina del espermatozoo también debe ser preservada para
lograr un desarrollo embrionario normal luego de la fertilización.

1) Temperatura: La actividad metabólica es proporcional a la temperatura absoluta, de

modo que la disminución de ésta es el mecanismo principal para enlentecer las

16
reacciones químicas y prolongar la vida de las células (los espermatozoos consumen
42 veces más oxígeno a 37 grados que a 5 grados).
Al mismo tiempo que la temperatura disminuye, ocurren cambios en el ambiente interno
y externo del espermatozoo. La solubilidad de los gases en el ambiente externo
aumenta: la del 02 se duplica y la del C02 se triplica. Esto permite que una mayor
proporción de la actividad metabólica total sea realizada a través de un metabolismo
oxidativo.
Los espermatozoos son eyaculados a temperatura corporal. Pueden ser mantenidos
por un corto período a esa temperatura, en un medio adecuado, pero mueren
rápidamente cuando ésta excede los 46 grados C.
Los espermatozoos pueden ser enfriados por debajo de la temperatura corporal, con la
mencionada disminución de la actividad metabólica y sin que sufran daños
detestables. Sin embargo, si son enfriados a 5 grados C sin un medio protector, sufren
un shock de frío (ver más adelante).

2) Energía: El requerimiento principal de energía del espermatozoo es para mantener la

motilidad, pero se requiere energía adicional para el mantenimiento celular. Los
espermatozoos tienen capacidad tanto de metabolismo aeróbico como anaeróbico. Una
simple fuente de energía, como fructosa o glucosa (que son capaces de penetrar al
espermatozoo) se debe adicionar al diluyente para proteger las reservas intracelulares
del espermatozoo (la fructosa presente en el plasma seminal se diluye
considerablemente con la extensión). En ausencia de un sustrato simple como los
mencionados, los espermatozoos pueden oxidar fosfolípidos intracelulares, lo que
resulta nocivo para la célula. La yema de huevo y la leche contienen glucosa así como
otros componentes utilizados por el espermatozoo.

3) Osmolaridad: La osmolaridad (número de partículas suspendidas como solutos en

una solución) influencia no solamente la presión osmótica de una solución, sino el punto
al cual el solvente se congela. Por lo tanto, la disminución del punto de congelación de
una solución refleja su concentración osmolar. Una concentración osmolar de un soluto
en agua disminuye su punto de congelación 1,86º C. La depresión del punto de
congelación del semen de toro es aproximadamente - 0, 55 grados C, equivalente a una
concentración de + 300 miliosmoles, que aumenta cuando el espermatozoo metaboliza
nutrientes. Por lo tanto, es preferible errar hacia el lado de la hipotonía que el de la
hipertonía en un diluyente.
Los espermatozoos se comportan como osmómetros y son capaces de grandes
cambios de tamaño, dependiendo de la tonicidad del medio en que se encuentran. El
plasma seminal tiene una presión osmótica de 285 miliosmoles y se asume que
representa la presión osmótica ideal. Aún en ese caso, no debe asumirse que
soluciones de presión osmótica equivalente, medida por pruebas físicas, sean
isotónicas con el espermatozoo, ya que la permeabilidad de la célula a diferentes
sustancias varía. Pueden haber interacciones entre la concentración total de sustancias
en el líquido que rodea al espermatozoo, el pH del medio, iones específicos y electrolitos
presentes. Si la tonicidad del medio se desvía considerablemente, los espermatozoos
pueden mostrar colas dobladas, nadar en círculos y morir. Afortunadamente, los
espermatozoos pueden tolerar una variación moderada de tonicidad sin perder
fertilidad. El grado de tolerancia está afectado por interacciones con el PH y otros iones
presentes. Los diluyentes elaborados para preservar el semen deben ser isotónicos
bajo las condiciones de su empleo para no causar daños morfológicos o funcionales.

4) Buffers y pH: Los espermatozoos necesitan ser protegidos contra una

autointoxicación debido a productos ácidos (ácido láctico) derivados de su metabolismo.
La motilidad y fertilidad se preservan bien en yema de huevo y leche con PH neutro,
aunque una reducción del pH a 6,5 puede resultar beneficioso.

17
 5) Inhibición del Crecimiento de Microorganismos: La yema de huevo, así como otros
medios, proporcionan un buen ambiente para el desarrollo de microorganismos, los que
a su vez producen productos que pueden ser dañinos para los espermatozoos y que
pueden infectar las hembras. Algunos organismos se encuentran en el semen de toros
sanos aún en condiciones asépticas de colección y procesamiento. Es, por lo tanto, una
práctica común y adecuada, incluir antibióticos tales como penicilina y estreptomicina
en los diluyentes.

6)Exclusión de Materiales Tóxicos : Los diluyentes deben ser formulados no solamente

de manera que prevengan la formación de productos tóxicos durante el
almacenamiento, sino que además deben estar libres de sustancias que puedan ser
dañinas para los espermatozoos, tales como metales pesados, de modo que debe
emplearse siempre agua destilada. Agentes crioprotectores como el glicerol son algo
tóxicos y espermatozoos muertos son una fuente de aminoácido oxidasa, que es dañina
para las células a través de la producción de H202.

7)"Efecto Diluyente”: La dilución de espermatozoos, particularmente en medios

sintéticos, declinan su motilidad en una relación directa a la tasa de dilución. Las causas
de este "efecto de dilución" parecen ser debidas a una pérdida de componentes del
espermatozoo en presencia de un medio muy diluido. Por otra parte, el semen debe ser
mezclado con una cantidad suficiente de diluyente de manera que la concentración
inicial de espermatozoos sea diluida hasta llegar a un número deseado de
espermatozoos en una dosis inseminante.
Se deben agregar, por lo tanto, agentes protectores tales como macromoléculas
presentes en productos naturales así como yema de huevo o leche, para así reducir o
eliminar este "efecto".

8) Protección de los Espermatozoos Contra el Frío.

Cuando los espermatozoos son enfriados a 5 grados C., están sujetos a un shock de
frío que afecta la membrana plasmática y causa la pérdida de enzimas intracelulares,
lipoproteínas, potasio, ATP y otros materiales de las células. Más aún, la motilidad
disminuye y las colas se pueden doblar. Si los espermatozoos son enfriados
lentamente, especialmente por debajo de 20 grados, el daño es menos severo, lo que
indica que ocurren cambios internos y externos a un ritmo que permite a la célula
ajustarse a la caída de temperatura. El medio más efectivo de proteger a los
espermatozoos contra los efectos del enfriamiento es proveerlos con lecitina, proteínas,
lipoproteínas y compuestas similares presentes en la yema de huevo o leche.

III. METODOLOGÍA

3.1. TIPIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

El tipo de investigación es Descriptivo y predictivo no experimental

3.2. MÉTODOS DE INVESTIGACIÓN

18
 El método de investigación es investigación

3.3. VARIABLES

 VARIABLES DEPENDIENTE

Efecto de la Conservación de semen ovino con los dilutores

 VARIABLES INDEPENDIENTES

1.conocer el efecto de la conservación de semen ovino con los dilutores .

2. conocer la importancia de los dilutores de semen

3. definir la composición de diluyentes para congelar semen

4. cuales son los principios de preservacion

IV. RESULTADOS

los efectos sobre la preservacion de semen con los diilutores son:

a) proveer nutrientes como fuente de energía.

b) proteger a los espermatozoides del efecto dañino del enfriamiento.
c) mantener un adecuado equilibrio del pH.
d) mantener una adecuada presión osmótica y balance electrolítico.
e) inhibir el crecimiento bacteriano.
f) incrementar el volumen del semen para que pueda ser usado para múltiples
inseminaciones .
g) proteger a los espermatozoides durante el congelamiento .

Existe una amplia gama de diluyentes desarrollados a través del tiempo, los cuales
presentan diferentes composiciones y cualidades. De todos éstos, el diluyente Tris-
glucosa-yema de huevo desarrollado por Salomon y Maxwell (2000), es hasta hoy el
más recomendado para semen refrigerado y congelado de carnero. Hay diluyentes que
se utilizan para refrigerar, los cuales son soluciones acuosas tamponadas a las que se
les añade una fuente de energía (glucosa, fructosa) y un crio protector no penetrante,
que es opcional dependiendo de la temperatura y tiempo de refrigeración (leche
descremada, yema de huevo

CONCLUCION

19
La adición de yema de huevo al dilutor tiene un efecto benéfico sobre el porcentaje
de motilidad, especialmente después de un rápido enfriamiento del semen a 10 y 5
ºC, ya que las lipoproteínas de baja intensidad actúan como crioprotectores,
contribuyendo a la protección contra el shock de frío (factor de resistencia) y
manteniendo la viabilidad del espermatozoide (factor de conservación) (Fiser y
Fairfull, 1986).

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