Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria

Centro de Investigacion Palmira

LIMPIEZA FITOSANITARIA
DE ENFERMEDADES VIRALES
EN PLÁNTULAS DE CÍTRICOS

Palmira, Agosto de 2006 Boletín Divulgativo Nº 26

 Proyecto:
Fortalecimiento del Centro de Investigación Palmira como un centro de referencia
nacional para la producción de plántulas certificadas y el mejoramiento de la
productividad de cítricos en Colombia.

LIMPIEZA FITOSANITARIA DE ENFERMEDADES VIRALES

EN PLÁNTULAS DE CÍTRICOS

Álvaro Caicedo A 1
Oscar Julián Muñoz R 2
1
I.A. Master en Citricultura, CORPOICA, C. I. Palmira. E-mail acaicedo@telesat.com.co
2
Biólogo, CORPOICA, C. I. Palmira. E-mail: oscarive9@hotmail.com
Introducción
Los cítricos en Colombia se encuentran afectados por enfermedades vírales y
otros agentes patógenos los cuales causan pérdidas económicas; una
citricultura rentable a largo plazo debe partir de la siembra de árboles sanos
que permitan maximizar los rendimientos con buena calidad del fruto y
longevidad de la explotación.

CORPOICA en el Centro de Investigación de Palmira (C.I.), adelanta proyectos

de “Mejora Sanitaria de Cítricos”, utilizando la técnica de Microinjertación in
Vitro de ápices caulinares. Estas actividades buscan sanear las introducciones
del Banco de Germoplasma de Cítricos del C.I. Palmira, y en especial las
variedades comerciales demandadas por los citricultores, promoviendo el uso
de variedades libres de enfermedades y garantizando la pureza genética del
material de siembra.

El objetivo de esta publicacion es ilustrar el proceso de limpieza fitosanitaria de

plántulas de cítricos con el uso de técnicas biotecnológicas, mediante tres
etapas: 1) Acondicionamiento de la infraestructura y equipos, 2)
Microinjertación y 3) Serologia y multiplicación de yemas sanas, por medio del
cual se ilustra al lector en puntos clave de la limpieza fitosanitaria enfocada a la
certificación de plántulas de cítricos.
I ETAPA
REQUERIMIENTOS MINIMOS DEL PROCESO DE LIMPIEZA
FITOSANITARIA DE CÍTRICOS EN EL C.I. PALMIRA
Acogiendo el concepto de Certificación de plántulas de cítricos, como la implementación de una serie de normas
legales y procedimientos de laboratorio para garantizar el óptimo ESTADO FITOSANITARIO, la AUTENTICIDAD
VARIETAL y la CALIDAD AGRONÓMICA, de material ampliamente demanda por los viveristas, citricultores y demás
actores relacionados con el sector citricola de una país. En este sentido uno de los pilares fundamentales de este
proceso lo constituye la identidad genética del material de propagación, que se logra solo a partir de Bancos de
Germoplasma constituidos para tal fin. El siguiente esquema integra algunos conceptos relacionados con la
importancia de los bancos de germoplasma de cítricos y otras especies.

CONCEPTOS INTEGRADOS A BANCO

DE GERMOPLASMA DE CITRICOS
• Biodiversidad: Variabilidad de organismos vivos (Ej.: colecta de cítricos que reposan en
el B.G.)
• Recurso Genético: Material biológico (planta), portador y transmisor de características
genéticas heredables, de valor social, económico y cultural (investigación).
• Germoplasma: Material genético que forma la base física de la herencia
(introducciones).
• Banco de Germoplasma: Colección de la diversidad de genes existente en cada
especie.
• Conservación: Manejo, preservación y utilización de los recursos genéticos.
• Variedades: Grupo de cultivares de una misma especie, introducidas y criollas con
características de algún interés.

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En el C.I. Palmira se tiene la responsabilidad ante el país y ante los citricultores de velar por la conservación (sanidad), estudio,
caracterización, ampliación y multiplicación del material vegetal conocido como introducciones, procedentes de colectas
nacionales e importaciones de materiales extranjeros. La composición de este recurso genético se ilustra en la Tabla 1.

Tabla 1. Resumen de la composición del Banco de Germoplasma de Cítricos del C.I. Palmira,
Por cultivares, géneros y procedencia.

Algunos elementos básicos a conocer en programas de ENFERMEDADES VIRALES DE MAYOR IMPORTANCIA

limpieza fitosanitaria, están representados por el PARA COLOMBIA
conocimiento de los principales disturbios fitosnitarios y las • Tristeza de los Cítricos. En especial en limas tahití y
técnicas o herramientas que nos permiten afrontar estos pajarito, pomelos, y todas las combinaciones sobre
problemas, se ilustran en los siguientes temas:. naranjo agrio.
• Psorosis. Especialmente susceptibles naranjos y
tangelos.
• Exocortis y xyloporosis. Patrones: naranja trifoliada y sus
híbridos.
• Cristacortis, blight, leprosis
4
TRANSMISION DE ENFERMEDADES VIRALES.
• HOMBRE. Injerto (practica que perpetua
enfermedades sistémicas), herramienta (la no
desinfección de esta), movimiento ilegal
fronterizo, Cuarentena (traslado ilegal de material
procedente de países con enfermedades exóticas
para Colombia).
• INSECTOS. Áfidos (Toxoptera citricida, Aphis
gosiipy, vs. Virus CTV)
• OTRAS. Ausencia de medidas legales, asistencia
técnica, monitoreo, diagnósticos, Certificación…)

LIMPIEZA FITOSANITARIA.
B. Germoplasma: Variedades sanas
• Técnica de Microinjertación, (herramienta
biotecnológica que permite sanear material madre B. Fundación: Plantas élite
contaminado) B. Propagación: Plántulas Madre.
• Patrón o Portainjerto, Citranges: Troyer y Carrizo u B. Multiplicación: Aumento yemas.
otros patones trifoliados (permiten identificar la
yema meristemática microinjertada). Tablas 2 y 3
resume el listado de características de los
patrones a utilizar en injertaciones.
• Variedades o Copas, “Demanda Comercial” VIVEROS COMERCIALES
(Ápices meristemáticos).

DIAGNOSTICO FITOSANITARIO. Figura 1. Esquema simplificado de la función de los bloques de multiplicación

• Pruebas Serológicas, Tristeza de los Cítricos o de material sano de cítricos.
CTV.
• Pruebas Moleculares, Psorosis, Leprosis,
Viroides, etc.
• Plantas Indicadoras, Razas CTV, psorosis,
viroides de la exocortis y xyloporosis.

5
La Tabla 2 y 3.
Presentan un
resumen de las
principales
características
agronómicas
de los patrones
más utilizados
en Colombia.

6
EL PROCESO DE LIMPIEZA FITOSANITARIA DEBE CONTAR CON CASAS DE MALLAANTIÁFIDO:
Estas son estructuras metálicas, de madera inmunizada o de guadua, recubiertas con plástico y malla antiáfidos,
preferiblemente blanca, diseñadas para aislar plántulas sanas de insectos-plaga vectores de virus y otros patógenos, y poder así
conservar e incrementar material de propagación sano (yemas) obtenido de plantas madre multiplicadas por procesos
biotecnológicos.

A. B.

C.
D. E.
F.

Figura 2: (A). Vivero tecnificado con plantas sanas de

cítricos (1 millón plantas/año) en Sao Paulo, Brasil, (B). (C). Visita a Viveros certificados de EMBRAPA (Cruz
Empresa citricola que se autoabas-tecimiento de das Almas, Bahía), (D). Estructuras metálicas
plantas certificadas, invernaderos y casas malla Cenicafé, (E). Casa malla
antipulgón C.I. Palmira, (F). Casas de malla CIAT.

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Huerto de semilla de patrones: Casa-malla antiáfido en el C.I. Palmira, en donde se
Área convenientemente demarcada y aislada, para la conservan, evalúan e injertan las variedades élite,
producción de semilla sexual de patrones que serán (comerciales), saneadas por métodos de microinjertación
utilizados en la multiplicación masiva de plántulas sanas a in-Vitro, para multiplicación masiva de yemas con destino a
partir de yemas de plantas madre producidas en ambientes investigación, viveristas y citricultores en general.
protegidos o casas de malla antipulgón. La extracción y
conservación de semilla se debe hacer siguiendo protocolos
de laboratorio que existen para tal fin (Corpoica, C.I.
Palmira).

Figura 4: Casas de malla antiáfido en el C.I. Palmira: (A)

Figura 3. Huerto de semilla sexual de patrones de cítricos procedentes del Casas malla bloque de fundación, propagación y
Bando de Germoplasma del C.I. Palmira. multiplicación respectivamente, (B) Casa malla antiáfido
que conserva el germoplasma microinjertado “Plantas
madre”.

8
II ETAPA.
PROCESO DE MICROINJERTACION Y DIAGNOSTICO.

A. B.. C.

D. E. F.

Figura 5. Laboratorio para “limpieza” fitosanitaria y equipos de uso frecuente en microinjertación y diagnostico serológico: (A) laboratorio
equipado con equipos y reactivos en procesos de diagnostico de enfermedades virales (Fundecitrus-Brasil), (B) autoclave para esterilización de
cristalería y otros usos, (C) peachímetro para monitorear soluciones, (D) reactivos de uso frecuente en el C.I. Palmira en microinjertación, (E)
lector de Elisa para procesamiento de muestras de tejido vegetal de plantas microinjertadas y plantas madre, y (F) estereoscopio) equipo básico
para proceso de microinjertación de ápices caulinares de cítricos.

9
 A.
B.

C.
B.

F.
E.

D.

Figura 6. Proceso de Microinjertación en laboratorio: (A) semilla escarificada para facilitar y agilizar el proceso de germinación en tubos de
ensayo, (B) preparación de yemas de 0.2 mm, siembra de semilla patrones in-Vitro, y preparación de patrones para la microinjertación, (C)
siembra de semilla, que servirá de patrón en un tubo de ensayo en medio sólido MS, (D) patrón en desarrollo por incubación en oscuridad a 24
26°C donde al cabo de 15 días se obtienen plántulas etioladas para realizar la técnica de microinjerto, (E) Poda de árbol madre e inducción de
yemas para micro injertar, (F) yemas o brotes aptos para micro injertar en patrones etiolados.

10
Figura 7. Proceso de preparación del patrón etiolado, y microinjertación de la yema, y su posterior prendimiento, desarrollo y
conservación en tubos de ensayo. La yema micro-injertada es re-injertada en patrones desarrollados que crecen en casas de malla antiáfido.
Estos ápices de 2 a 3 cm, se obtienen de plantas donantes, portadoras de patógenos, previamente seleccionadas y podadas. Después de
esterilizarlas y con la ayuda del estereoscopio se extrae el ápice meristemático y se procede a la eliminación de cotiledones del patron, poda de
epicotilo, despunte radicular (A), la yema con una longitud 0.2 a 0.4 mm, está acompañada con uno o dos primordios foliares (B). Las plántulas
microinjertadas (C), se colocan en un tubo con medio nutritivo líquido “Murashige+Sacarosa” (D), suspendidas mediante un soporte de papel de
filtro a una temperatura de 24 - 36oC y 16 horas luz por espacio de 30-40 días (E).

11
 A. B. C.

D. E. F. G.

Foto 8. Proceso de Re-injertación en casa de malla antipulgón, con brotes microinjertados en patrones etiolados en laboratorio. El transplante se
hace directamente en macetas con suelo tratado, o se reinjerta sobre un patrón desarrollado en bolsa (A), mediante injertación convencional: (B)
patrón trifoliado, (C) Injertación y amarre, (D) microinjerto procedente del tubo de ensayo, (E) prendimiento del brote microinjertado. Se cubre con
bolsas de polietileno para evitar deshidratación (F); permaneciendo en invernadero a T °C. y H.R. controladas. Finalmente se obtiene una plántula
madre (G) que será evaluada por serologia para confirmar su sanidad.

12
(Tabla 4).Cultivares de cítricos saneados en el C.I. Palmira (Julio/06), mediante
la técnica de microinjertación In Vitro de ápices caulinares de cítricos,
conservados en casa malla antiáfido

Grupo Nombre científico Microinjertadas +

Reinjertadas

Naranjas Citrus sinensis 210

Mandarinas C. reticulata 42
Limas ácidas C. aurantifolia 40
Clementinas C. clementina 27
Pomelos C. paradisi 22
Limones C. limón 8
Satsumas C. satsuma 7 Figura 9. Lector de Elisa, Equipo básico de diagnóstico para
Otros Varias sp. 7 determinar presencia de partículas virales mediante la utilización de
anticuerpos policlonales, en tejido vegetal de plantas madre
Híbridos Varios cruzamientos 47 microinjertadas en laboratorio de biotecnología. Garantiza el proceso de
Total plantas en casa malla 410 saneamiento de las variedades élite y del Banco de Germoplasma de
cítricos. Después de tener la planta desarrollada, se practican pruebas
serológicas y biológicas para enfermedades de origen viral, como es el
caso de la técnica de inmunoimpresión ELISA, para diagnóstico de
CTV.

13
III. ETAPA.
PROCESO DE MULTIPLICACION INTENSIVA
Y MANEJO AGRONÓMICO

Figura 10.
Proceso de conservación y B.
mantenimiento de plantas A.
saneadas procedentes del C.
Banco de Germoplasma, y
protegidas en casas de malla
antipulgón, para preservar su
sanidad como plantas madre.
Las fotos (A, B, C, D y E) ilustran
el estado actual de
conservación de las plantas
madre provenientes del
laboratorio de biotecnología del
C.I. Palmira, las cuales son
monitoreadas periódicamente
para comprobar su sanidad
como plantas donadoras de
yemas en programas de
certificación.
D. E.

14
 A. B. C.

D. E. F.

Figura 11. La aplicación de practicas agronómicas desde el momento de preparar el sustrato en proporción 1:1:1 arena+cascarilla arroz+tierra, (A),
y el germinador (D), para el desarrollo de la plántula en bolsa, el manejo de la nutrición química y orgánica, esta última a base de productos biológicos
(B, C): Ej.: agroplus (10%), y las medidas de desinfección de la herramienta de corte con hipoclorito de sodio, 5% (F), permiten asegurar el normal
desarrollo de yemas y plántulas (E) conservadas en condiciones de ambientes protegidos (casas de malla antiplulgon), para procesos de
multiplicación masiva de yemas.

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Varetas porta-yemas sanas listas para ser injertadas en patrones desarrollados previamente seleccionados de acuerdo a la
variedad a injertar. Plantas injertadas y desarrolladas sobre patrones en procesos posteriores a la injertación a partir de material
sano. Fase final del proceso de limpieza fitosanitaria el cual debe ser sometido al chequeo de las autoridades sanitarias para
garantizar el proceso de sanidad del material y proceder a la entrega de material certificado a viveristas y citricultores en general.

Figura 12. Varetas porta-yemas sanas procedentes de programas de certificación de plántulas de cítricos, tal es el caso de países como:
España, Brasil, Sudáfrica, Estados Unidos, Uruguay, Argentina, Cuba y México, que han sido referentes para procesos de certificación en
países como Colombia.

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Plano de distribución de casas de malla antipulgón con árboles madre sanos para multiplicación masiva de yemas y
plántulas con destino al sector viverista y citricultores en general. El C.I. Palmira dispone de esta infraestructura para iniciar el
proceso de escalamiento tecnológico con material de propagación sano a escala comercial.

Figura 13. El esquema detalla el número de plantas posibles de instalarse en un área construida de 500 mtr2. En el C.I. Palmira, el modulo (A) contempla la
instalación de los cultivares élite de citricultores provenientes del Banco de Germoplasma de Cítricos (88 plantas de las variedades comerciales de mayor
demanda de los citricultores). El modulo (B) contiene la propagación de plántulas, en el suelo directamente (1.404 plántulas madre donadoras de yemas), para
producir yemas para abastecer el modulo (C) que es donde se realiza la multiplicación masiva de yemas para beneficio del sector viverista (3.375 plántulas
levantadas en mesas de 1.0x3.0 metros).

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Figura 14. Esquema final que integra la producción de yemas sanas a partir del B.G. de cítricos (casa malla antipulgón matriz “centro”),
alimentando bloques de fundación (variedades elite “izquierda”), bloque de propagación (incremento masivo de plántulas), bloque de multiplicación
(incremento masivo de yemas). Paralelo a este proceso, el proceso se apoya con laboratorios y pruebas biológicas (“derecha”), como también
viveristas y semilla certificada que alimenta todo el proceso de multiplicación de plántulas y yemas sanas.

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Conclusiones
· El programa de certificación de plántulas de cítricos libres de enfermedades virales para
Colombia, se da inicio con la limpieza o sanidad de las variedades élite y la introducción al Banco
de Germoplasma de Cítricos (es un procedimiento genérico, no solo de Colombia).

· El programa se ha fortalecido en los últimos años con el apoyo de entidades gubernamentales

(Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia, COLCIENCIAS), en aspectos
tecnológicos (técnicas, diagnósticos, propagación masiva de yemas…).

· Con la implementación y puesta a punto de técnicas biotecnológicas como la microinjertación In-

Vitro de ápices meristemáticos de cítricos y la posterior comprobación serológica, se ha
avanzado significativamente en la sanidad del Bancos de Germoplasma y en especial de los
materiales élite de agricultores.

· CORPOICA en el C.I. Palmira, ha estructurado procesos en el tema de limpieza fitosanitaria

mediante una mayor capacidad instalada en infraestructura, equipos y personal capacitado, que
permiten dar respuesta a la demanda de material sano de plantas madre por parte de viveristas.

· Colombia cuenta con material básico y comercial libre de enfermedades virales, (virus de la
Tristeza de los Cítricos), y próximamente para el virus de la Psorosis y el viroide de la Exocortis.

· El programa ha contemplado la capacitación y transferencia de tecnología a viveros del país,

quienes se han apoyado en las experiencias de CORPOICA en la producción de yemas sanas, lo
cual se convierte en un impacto positivo para el futuro de la citricultura colombiana.
Agradecimientos
Al Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología “Francisco José de Caldas”
COLCIENCIAS, quien financió el Proyecto: “Fortalecimiento del Centro de Investigación Palmira como
un centro de referencia nacional para la producción de plántulas certificadas y el mejoramiento de la
productividad de cítricos en Colombia”, y del cual hace parte esta cartilla.

A los investigadores de diferentes países que han desarrollado experiencias exitosas en programas de
Certificación de Plántulas de Cítricos, compartiendo sus conocimientos para enriquecer este proceso,
investigadores agrupados en la Red Interamericana de Cítricos RIAC.

A los viveristas: Profrutales Ltda., Granja Venecia y El Sesteo del Comité de Cafeteros del Valle,
Jaibana, Vivero Oriente, El Paraíso, Frutos Tropicales, Hawai, Cicolsa, y todos aquellos quienes de
una u otra forma han apoyado esta iniciativa.
BOLETIN DIVULGATIVO No. 26
Código No. : 2.7.26.05.32.06

Revisión: Juan Jaramillo V, Coordinador de Investigación Corpoica C.I. Palmira.

Edición y Arte: Jesan Gómez S. Progr. Transferencia de Tecnología. C.I. Palmira.
Fotografía: Álvaro Caicedo A. Corpoica - Palmira.
Impresión: Editorial Litotamara Ltda.
Tiraje: 1.000 ejemplares.