HPLC “High Performance Liquid Chromatography”

Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas Kimia Analisis Instrumen

Dosen Pengampu:

Dr. Sri Wardani, M.Si

Disusun Oleh :

1. Ida Rosida 4301416008

2. Afifa Chandra Wibowo 4301416015
3. Zaqiatul Mudhakiyah 4301416016

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2018
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan
partisi cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam,
dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu
kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom
kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah ‘kromatografi’ dipakai oleh Tswett
untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner
dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes
lewat atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu
cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis
kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-
cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi
cairan kinerja tinggi (KCKT). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur
pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat
lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang
rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian
dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena
dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada
tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom
berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang
tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat
(sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun
peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas
penggunaannya dalam kimia organik.
1.2. Rumusan Masalah
1. Bagaimana definisi dari HPLC ?
2. Apa saja jenis- jenis HPLC ?
3. Apa saja komponen HPLC ?
4. Bagaimana prinsip kerja HPLC ?
5. Bagaimana preparasi sampel pada HPLC ?
6. Apa saja kelebihan dan kekurangan HPLC ?
7. Apa saja kegunaan HPLC dalam kehidupan sehari-hari ?
8. Bagaimana kualifikasi pada HPLC ?
9. Bagaimana cara perawatan pada HPLC ?
10. Bagaimana contoh aplikasi pada HPLC ?

1.3. Tujuan
1. Untuk mengetahui definisi dari HPLC.
2. Untuk mengetahui jenis- jenis dari HPLC.
3. Untuk mengetahui komponen dari HPLC.
4. Untuk mengetahui prinsip kerja dari HPLC.
5. Untuk mengetahui preparasi sampel pada HPLC.
6. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan dari HPLC.
7. Untuk mengetahui kegunaan HPLC dalam kehidupan sehari-hari.
8. Untuk mengetahui kualifikasi pada HPLC.
9. Untuk mengetahui cara perawatan pada HPLC.
10. Untuk mengetahui contoh aplikasi pada HPLC.
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1. Definisi HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat. Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis
secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun kompleks. Pada akhir
1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT adalah kromatografi cair kolom
modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu
sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan

performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang
jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase
gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping
itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi
dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam
analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan penetapan
kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap
dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan metode KG. Banyak
senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa ion anorganik sampai
senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat/bahan obat campuran
rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral yang mampu menetukan
rasemis dan isomer aktif.
2.2. Jenis- Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang
non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain
klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan
atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai
silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang
akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi
secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi
silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media
air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan
fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan
ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-
sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran
 ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan
sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.3. Komponen HPLC

1. Pompa (Pump)
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu pompa kinerja konstan (constant
pressure) dan pompa pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan
dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa
reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena
itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis
dasar (base line) detector yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan
aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
2. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang
baikM memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons
linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang
rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh.
3. Injektor
Injektor merupakan tempat untuk memasukkkan sempel ke kolom. Waktu yang
dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai
waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa
senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

 tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
 komposisi yang tepat dari pelarut
 temperatur pada kolom

4. Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama
analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat
waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi
gradien dijelaskan oleh Snyder.
5. Kolom
Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan
kembali (reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama
sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang
digunakan. Kolom diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara
 kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam. Komponen-komponen
sample dibawa oleh cairan fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan tekanan tinggi
melewati kolom fasa diam. Komponen-komponen dipisahkan berdasarkan partisi antara
fasa diam dan fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur.
Efisiensi kolom salah satunya sangat tegantung dari besarnya partikel fase
stasioner. Oleh karena itu bila ukuran fase stasioner lebih kecil, maka tinggi plat teoritik
akan berkurang, sehingga jumlah plat teoritik akan bertambah, yang meningkatkan
efisiensi kolom. Dengan kolom yang pendek dan efisiensi, pemisahan akan berjalan
dengan cepat. Terdapat banyak analisis yang dikerjakan pada suhu kamar, suhu kolom
sering dapat diatur dengan konstan dengan memakai cara pemanasan. Sering
dibutuhkan suhu kolom yang lebih tinggi dari suhu kamar untuk mengatasi masalah
daya larut solute yang dianalisis dan viskositas fase gerak yang agak tinggi
6. Pengolahan Data (Data Handling)
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder.waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui atau
dihitung. Ini bisa digunakanuntuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen,
bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau
proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara
kuantitatif.

2.4. Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase
stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase
stasionernya adalah silika gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang
memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.
Urutan skala polaritas: golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol <
golongan asam.
Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa dalam
eluat;
 1. Fasa Normal
 Fasa gerak nonpolar
 Fasa diam polar
2. Fasa Terbalik
 Fasa gerak polar
 Fasa diam nonpolar

Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat

ditingkatkan dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu retensi,selektifitas,
dan efisiensi. Secara praktis parameter-parameter HPLC tersebt dapat dioptimalkan dengan
mengubah:

1. Komposisi dari fase gerak

2. Laju alir
3. Sifat kimia dari fase gerak
4. Jenis kolom

Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif.
Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan
kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya (Retention Time/RT).
PEAK YANG MEMPUNYAI RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai
peak milik analat. Selain melihat RT, hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari
signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang sama juga.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan
adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Sedangkan untuk analisa kuantitatif dapat digunakan dengan persamaan : Cx = Ax /

Ap X Cp

Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C = Konsentrasi
X = sampel
P = pembanding Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan
dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.
Melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis dalam
sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada sistem HPLC adalah kolom. Ada kolom
yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan
untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dans ebagainya. Namun ada juga kolom yang
khusus dibuat untuk tujuan anlisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent)
yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polisakarida). Keberhasilan
proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
Setelah komponen dalam sampel berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah
proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sampel.
Sampel yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh
karena itu biasanya untuk sampel jenis ini dilakukan tahapan preparasi sampel yang lebih
rumit agar sampel yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.
Sampel farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain
zat aktif. Sampel ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Contoh kromatogram dengan banyak peak.

2.5. A. Preparasi Sampel pada HPLC
 Sampel harus dalam bentuk larutan
 Untuk skala analisis sampel dalam mikroL , konsentrasi sampel yang diinjeksikan tidak
boleh terlalu pekat karena dapat menyumbat kolom.
 Konsentrasi maksimal adalah 40 ppm.
B. Preparasi Fase Gerak
 Fase Gerak (eluen) yang digunakan harus dalam kualitas p.a ataupun grade HPLC.
Untuk air digunakan akuabidest.
 Sebelum digunakan, eluen harus disaring dengan milipore kemudian diawagaskan ( di
digest ) dengan sonikator sekitar 30 menit untuk menghilangkan udara terlarut.
 Eluen harus dimasukkan ke dalam tabung eluen sebelum alat dinyalakan untuk
menghindari adanya gelembung pada selang penghubung.
 Tabung eluen yang diisi harus diberi label sesuai dengan eluen yang di gunakan.

2.6. Optimasi HPLC

Optimasi adalah suatu proses untuk mencapai hasil yang ideal atau nilai efektif yang
dapat dicapai. Optimasi dapat diartikan sebagai suatu bentuk mengoptimalkan sesuatu hal
yang sudah ada, ataupun merancang dan membuat sesuatu secara optimal.
Pada penelitian Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Siprofloksasin Dalam
Media Mueller Hinton Broth Menggunakan HPLC yang telah dilakukan oleh Maya Dian
R., 2016, tahapan optimasi metode analisis dilakukan dengan urutan sebagai berikut:
a. Penetapan Panjang Gelombang Optimum Analisis
Optimasu panjang gelombang dilakukan pada panjang gelombang 272, 275, dan
280 nm menggunakan larutan standar siprofloksasin 100 µg/mL dalam media
Mueller Hinton Broth.
b. Pemilihan komposisi fase Gerak Analisis
Larutan standar siprofloksasin 100 µg/mL dalam media Mueller Hinton Broth
diinjeksikan dalam kolom kromatografi, kemudian dilihat pemisahan antara
area kromatogram siprofloksasin dan media Mueller Hinton Broth yang paling
baik.
 c. Pemilihan Suhu Kolom
Suhu kolom diuji pada suhu 30˚C dan 42˚C (Muchohi et al., 2011).

Faktor yang dapat mempengaruhi kerja HPLC dalam penetapan kadar suatu
senyawa dalam media adalah pH fase gerak, suhu kolom, volume asetonitril, dan fase
aqueous di fase gerak. Penjagaan pH fase gerak diperlukan untuk mengoptimalkan
pemisahan dengan senyawa lain, biasanya pH fase gerak dijaga stabilitasnya
menggunakan buffer.

2.7. Kelebihan dan Kekurangan Metode Analisis dengan HPLC

Kelebihan itu antara lain:
1. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran
2. Mudah melaksanakannya
3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü Resolusi
yang baik
5. Dapat digunakan bermacam- macam detektor
6. Kolom dapat digunakan kembali
7. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali cuplikan,
karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
8. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena
HPLC dilakukan pada suhu kamar.
9. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
10. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya
sangat tinggi seperti polimer

Sedangkan kekurangannya adalah:

1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
2. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
2.8. Kegunaan HPLC dalam kehidupan sehari-hari
1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
7. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

2.9. Kualifikasi pada HPLC

Pelaksanaan kalibrasi maupun kualifikasi pada HPLC sejatinya tergantung pada
bagaimana cara pandang kita terhadap instrumen tersebut. Apabila HPLC dilihat tiap-tiap
bagiannya, maka bagian per bagian HPLC tersebut dapat dilakukan kalibrasi. Misalnya
kalibrasi detektor, pompa (laju aliran), dan oven pemanas kolom. Kalibrasi bagian
perbagian tersebut dilaksanakan secara terpisah dan beranggapan bahwa HPLC dapat
terkalibrasi bila semua bagian dikalibrasi serta memenuhi syarat.
Akan tetapi ada pula yang memandang bahwa HPLC termasuk dalam ranah
kualifikasi, salah satunya adalah Kualifikasi Kinerja. HPLC masuk dalam ranah kualifikasi
karena HPLC merupakan instrumen yang “sophisticated” instrumen rumit dimana masing-
masing bagian alat bekerja secara sinergis bersamaan membentuk suatu sistem dan
akhirnya menghasilkan suatu output. Kualifikasi Kinerja dilakukan dengan menentukan
parameter-parameter kinerja Unit HPLC. Parameter-parameter ini dipilih karena
menentukan kunerja HPLC, parameter ini merupakan parameter kunci yang menandakan
apakah HPLC bekerja dengan benar atau tidak dalam analisa rutin.
2.10. Cara Perawatan pada HPLC
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom,
namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering
digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan
fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.
Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.
1. Stabilitas pH
Kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH,
pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut
organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang
memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner
didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih
tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan
dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan
silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
2. Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat stabil, dikemas dalam
kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40
MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam
kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
3. Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari
kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah selektivitas
kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.
4. Penyimpanan Kolom
 Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang
digunakan dalam terakhir analisis.
 Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom
harus dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
  Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan
dalam pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik
adalah pelarut Asetonitril.

2.11. Aplikasi pada HPLC

Contoh Penelitian :
1. Analisis Anion Nitrat (NO3-)
Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam
atau bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan
industri. Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air
tersebut. Untuk itu diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur
kandungan nitrtat tersebut. Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan
dengan pengembangan metode dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk
analisis anion nitrat. Dari beberapa model pemutakhiran HPLC diketahui metode
analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta eluen campuran Na-Borat glukonat :
Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor Konduktivitas dapat menganalisis ion nitrat
dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi 3,661 ppm dan sensitivitas 0,01 ppm serta
uji recovery 110,41+ 1,59%.
2. Analisis Vitamin C
Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni
dalam menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun
1933 oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh
King dari USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk,
yaitu bentuk oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai
aktivitas biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat
terus teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.
3. Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae
Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder
golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa
zat yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp.
terdapat komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya
(etanol, heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam
rimpang dengan berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi
instrumental dengan selektifitas (resolusi) yang tinggi, kromatografi cari kinerja tinggi
(HPLC) untuk komponen yang termolabil, seperti dilakukan untuk stabilitas kandungan
gingerol dari rimpang Jahe dan andrografolid dari Sambiloto.
Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi dibutuhkan cara eluasi
gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai
metanol 100% dan pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan
ionisasi senyawa metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti
prinsip pasangan ion.
Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-
perkolasi dengan pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat
diuapkan dengan rotavapor sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk
simplisia, diperoleh suatu ekstrak total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan
kembali dalam metanol ( 10X), kemudian dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18
1 X 1 cm) untuk selanjutnya diinjeksikan sejumlah 20 ul ke HPLC.
Kondisi HPLC dalam penelitian adalah sbb.: Eluasi dilakukan gradien pada
kondisi awal Solvent-A (As-fosfat 0,1 N dalam aquabidestillata) : Solvent B
(Metanol pro HPLC) = 90 10; kemudian program gradien linear selamn 35 menit menuju
100% Metanol, dilanjutkan 15 menit Metanol 100%, dilanjutkan program pencucian
kolom dengan 40% MetOH selama 10menit, dan diakhiri kembali kekondisi awal (10%
MetOH) dalam waktu 5 menit. Kromatogram direkam selama total waktu 60 menit.
Setiap kali injeksi bahan uji (ekstrak) memerlukan waktu 75 menit, kemudian dapat
langsung diinjeksikan bahan uji berikutnya. Analisis HPLC dilakukan pada setiap sampel
ekstrak dengan kondisi eluasi dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm 365 nm.
Analisis data : Sidik jari HPLC masing-masing ekstrak dianalisis dan dibedakan
berdasarkan jumlah puncak komponen dan waktu retensinya untuk dicari
karakterisasinya jika ada dalam campuran atau dalam produk.
Dari hasil pengamatan kromatogram, dapat disimpulkan bawah pada ekstrak
C.domestica, C.xanthorrhiza dan C.zedoaria, jumlah puncak pada 254nm sama dengan
jumlah puncak yang muncul pada 365nm juga dan jumlah puncak pada 365nm lebih
 besar dari pada jumlah puncak 254nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram
HPLC terbaik digunakan deteksi pada 365nm. Pada ekstrak Alpinia galanga,
Z.cassumunar, Z.zerumbet dan K.galanga, jumlah puncak pada 365nm sama dengan
jumlah puncak yang muncul pada 254nm juga dan jumlah puncak pada 254nm lebih
besar dari pada jumlah puncak 365nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram
HPLC terbaik digunakan deteksi pada 254nm. C heyneana, C aeroginosa, Z offinalis, K
pandurata, K angustifolia dan K rotunda jumlah puncak yang muncul sama pada 254nm
dan 365nm lebih kecil dari jumlah puncak pada 254nm dan pada 365nm, sehirigga untuk
pembuatan sidik jari kromatogram HPLC harus digunakan kombinasi deteksi pada
254nm clan 365nm.
4. Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis
Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang
menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya
menilai sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan
kerusakan bagian dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus
digunakan cara kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi
masalah ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat
dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak.
Hasil penelitian tugas akhir yang telah dilakukan menunjukkan bahwa metode
ultrasonik dapat dipakai untuk menentukan tingkat kematangan buah manggis secara
tidak merusak. Berdasarkan basil kalibrasi 80 buah manggis, kecepatan gelombang
ultrasonik yang merambat melalui buah manggis untuk tiap tingkat kematangan
mempunvai nilai yang berbeda-beda. Buah manggis yang masih mentah mempunyai
kecepatan gelombang ultrasonik rata-rata 337.4 m/s, untuk buah setengah matang 369.1
m/s, buah matang 397.4 mis, serta untuk buah Iewat matang mempunyai nilai kecepatan
rata-rata 449.6 mis. Nilai kecepatan rata-rata gelombang ultrasonik yang merambat pada
tiap tingkat kematangan buah digunakan untuk membuat suatu persamaan empiris.
Persamaan ini menghubungkan tingkat kematangan terhadap kecepatan gelombang
ultrasonik untuk memperkirakan tingkat kematangan berdasarkan ultrasonik. diperoleh
Tk = 0.0268 V 7.9258.
 Persamaan empiris yang diperoleh diuji dengan pengukuran kecepatan pada
berbagai kondisi buah dengan warna visual yang beraneka ragam. Berdasarkan basil uji
coba 100 buah manggis diperoleh perbedaan perkiraan kematangan antara ultrasonik dan
warna kulit. Perbedaan tersebut mencapai 21%, hal ini menunjukkan bahwa warna kulit
belum tentu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah.
5. Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa
Tanaman Obat
Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain
melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier
Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan
melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran
dengan HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal.
Untuk itu sangat diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan.
Alternatif cara penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa
aktif atau penciri hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR
(absorban).
Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama
dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan
Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah
Kulonproggo dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi
menggunakan dua sumber yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan
temulawak daerah Kulonprogo dan Karanganyar. Pendekatan terbaik untuk kalibrasi
yang diperoleh pada tahun pertama digunakan untuk penyusunan model kalibrasi data
persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin tanaman hasil percobaan pada tahun
kedua. Model kalibrasi yang diperoleh pada tahun kedua merupakan model terbaik
berdasarkan data simulasi, data hasil pengamatan (Karanganyar dan Kulonprogo) serta
data hasil percobaan. Pada tahun ketiga dilakukan validasi model kalibrasi yang diperoleh
apda tahun sebelumnya dengan cara menerapkannya pada data konsentrasi dan persentase
transmitan Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan jahe dan
temulawak yang diambil dari contoh Bogor, Cianjur, Kuningan, Majalengka dan
Sukabumi.
 BAB III

PENUTUP

3.1. Kesimpulan
1. Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.
2. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase
stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa
aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi
dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam
suatu campuran.
3. HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu
menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak
mudah menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk
mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen
zat yang dianalisis, dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan
efisiensi pemisahan. Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase
diamnya terlebih dahulu, hanya bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui
kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal
sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

3.2. Saran
Penulis berharap kromatografi gas yang telah disajikan dalam bab isi dapat dijadikan
referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga dapat membedakannya dan
dapat menerapkannya secara tepat dengan tujuan memajukan pendidikan di Indonesia.
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, M., dan Suherman 1995. Analisis Instrumental. Airlangga University Press : Surabaya

Ahmad, M., dan Suherman. 1991. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Airlangga University Press
: Surabaya

Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisika. Universitas Padjajaran : Bandung

Bassett, J., R.C. Denney, G.H. Jeffery, dan J. Mendham. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif
Anorganik. Penerbit Buku Kedokteran EGC : Jakarta.

Day, R.A dan Underwood, A.L. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga : Jakarta

Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press : Jakarta

Putra,Effendy D. L. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan
Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara

Rakhmawati, Dian Maya. 2016. Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Kadar Siprofloksasin
Dalam Media Mueller Hinton Broth Menggunakan HPLC. Semarang: UMS

Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Kanisius : Yogyakarta

PERTANYAAN AUDIENCE

1. Ikrimatul Lailiah (021)

Bagaimana kombinasi pelarut dan gradien?

JAWAB: gradien ialah kekuatan fasa gerak. Jadi kombinasi yang tepat ialah antara fase
gerak dan fase diamnya, dimana salah satu diantara keduanya harus lebih polar atau
sebaliknya. Hal ini akan menyebabkan elusi gradien meningkat.

2. Ayu Meizy A. (019)

Kenapa memakai asetonitril untuk mencuci kolom? Bisa diganti atau tidak?

JAWAB: karena asetonitril termasuk pelarut aprotik yang memiliki ikatan dipol besar,
dan dapat melarutkan senyawa organik yang tidak dapat disosiasi oleh pelarut air.
Penggunaan asetonitril dapat diganti dengan pelarut lain yaitu menggunakan pelarut inert
yang tidak mudah menguap, misalnya metanol, metanol-air, dan air suling.

3. Zuyyina H. (039)

Aplikasi kromatografi penukar Ion?

JAWAB: aplikasi kromatografi pertukaran ion biasanya berupa pemisahan ion-ion renik
dalam sampel, misalnya untuk tujuan pemurnian air minum.dalam bidang penelitian
kimia dan biokimia, kromatografi pertukaran ion sering dilakukan untuk pemisahan asam
amino atau enzim-enzim.

4. Fitri Nur A. (045)

Bagaimana aplikasi HPLC dalam masalah-masalah biokimia? Zat yang dapat dianalisis
menggunakan HPLC apa saja?

JAWAB: aplikasi HPLC dalam biokimia ialah bisa digunakan untuk analisis vitamin C,
pendugaan kandungan senyawa bioaktif atau senyawa penciri beberapa tanaman obat,
dan lain sebagainya. Sampel yang dapat dianalisis yaitu berbagai senyawa organik,
anorganik, dan biologis.
5. Linihayatin A. (027)

 Yang dimaksud stabil secara kimia yaitu?

 Kenapa tekanan yang digunakan harus diatas tekanan udara?
 Yang dimaksud diawagaskan ialah?

JAWAB:

 Yang dimaksud stabil secara kimia ialah pH di fase gerak harus stabil, hal ini
dikarenakan untuk optimasi HPLC tersebut.
 Tekanan dibuat diatas tekanan udara dengan tujuan agar kecepatan mengalir fasa
gerak dalam kolom dapat berjalan dengan cepat serta agar senyawa dapat
dipisahkan dan mampu terbaca pada detector dan membentuk kromatogram.
 Diawagaskan ialah kata lain dari didigest, yaitu pemisahan sampel dari pengotor-
pengotornya.

MENAMBAHKAN:

1. Naufal Lina Azmi