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DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”
BIOQUÍMICA GENERAL
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INTRODUCCIÓN.
OBJETIVO.
Guanina 0.3717
Citosina 0.3544
Uracilo 0.5696
Timina 0.6282
Citosina 0.3205
Guanina 0.4102
RNA
Adenina 0.4871
Uracilo 0.5769
Citosina 0.3376
Guanina 0.3896
DNA
Adenina 0.4805
Imagen #1: Cromatografía en capa fina
Timina 0.6233
0.35
0.3
0.25
Absorbancia
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Longitud de onda (nm)
𝐴𝑏𝑠
𝐶= (𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)
22500
260𝑛𝑚
𝐶= (6) = 𝟎. 𝟎𝟔𝟗
22500
X=25.75
Aislamiento de DNA de origen μL de DNA
vegetal:
Para poder aislar DNA de guayaba se trituro una muestra y se añadió 5 ml de solución
Tris/EDTA/NaCl la cual se*Nomograma anexo
utilizó para preparar las condiciones regulando el pH que
rompe la pared celular, también fungiendo como agente coagulante (quitando el cofactor y
tomando los iones Mg y protegiendo al DNA.
Posteriormente se agita y se añade 0.3 ml de amilasa que hidroliza enlaces α 1-4 que
degrada carbohidratos como almidón, fructosa, etc. Al dejar incubar, se agregó 5 ml de
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SDS al 10% que disgrega las grasas en la membrana celular, esto para poder llegar al
núcleo. Al filtrar con la tela “magitel” se purifica el DNA de restos celulares de pared
celular, después al agregar cloroformo-alcohol isoamílico, se solubiliza el DNA y disuelve
compuestos no polares de lípidos filtrados, posteriormente se agita para retirar las
histonas del DNA lo que le confiere una carga (-). Al centrifugar obtenemos tres fases: el
DNA en agua, proteínas (que son las histonas) carbohidratos o lípidos que están en
cloroformo- alcohol isoamílico. Se recupera la fase acuosa donde está el DNA y se vierte
en un frasco que contiene alcohol del 96°, haciendo que flocule el DNA. Una vez
recuperado el DNA se disolvió y se hicieron dos diluciones (1:3,1:2) con solución de NaCl
para leer en espectrofotómetro determinando el espectro de absorción del DNA. Una vez
obtenido el espectro de absorción se cuantifica por tres diferentes métodos obteniendo
0.069 utilizando la absorbancia de 260 nm, 25.75 microlitros de DNA por el segundo
método y al último con el nomograma (que viene anexo al final).
DNA Plasmídico: Para este experimento se utilizó un crecimiento bacteriano el cual fue
centrifugado, se agregó 100µL de solución 1 (Glucosa-Tris-EDTA) el cual fungirá como
agente quelante, inhibiendo las enzimas presentes capturando los iones divalentes,
posteriormente se incubo en hielo y se añadió 200µL de la solución 2 (SDS 1%-NaOH
0.2M) la cual es necesaria para disgregar la pared y que así salga el contenido celular, se
invirtió el tubo 4 veces cuidadosamente para no romper nuestro DNA; se procedió a
agregar 150µL de la solución 3 (Acetato de potasio 5M), para inducir la precipitación de
las proteínas contenidas en la célula y que las cadenas de DNA se cerraran por completo,
una vez realizado este paso procedimos a centrifugar, donde el DNA genómico precipitara
por tener un mayor peso que el DNA plasmídico.
Finalmente tomamos una muestra del DNA obtenido y se colocó en el pozo del gel de
agarosa, el cual forma una red con poros definidos por los cuales emigrara el DNA hacia
el cátodo debido a que este presenta carga negativa.
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Cromatografía en capa fina: Se nos proporcionó pool de DNA y RNA, el cual se podía
interpretar que era una muestra de cada uno, por lo que en la cromatografía se reconocía
cada de uno de los ácidos nucleicos que los conforman. El DNA se caracteriza por la
presencia de la base nitrogenada Timina y en su forma más difundida se presenta como
una doble hélice en las que las bases nitrogenadas complementarias se disponen en el
interior de la cadena. Las cadenas complementarias presentan una dirección inversa y
determinan un hélice que da una vuelta completa cada 10 bases. El RNA presenta Uracilo
en lugar de Timina y está formado por una cadena simple de nucleotidos.
CONCLUSIÓN.
BIBLOGRAFIA.