You are on page 1of 20

PASAL DALAM PERS G 

Model
BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10

Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxxxxx

daftar Isitersedia di SciVerse ScienceDirect

Journal of Biotechnology
Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba di transgenik tanaman kentang 
menganugerahkan peningkatan resistensi terhadap bakteri patogen dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005

Penumpukan dari tanaman kentang transgenik di gen antimikroba menganugerahkan 
Peningkatan ketahanan terhadap bakteri dan jamur patogen
Mercedes Riveroa, Nicolas Furmana, Nicolas Mencaccia, Pablo Piccac, Laila Toum sebuah, Ezequiel 
Lentzb, Fernando Bravo­Almonacid b, Alejandro Mentaberry sebuah, *
Laboratorium Agrobiotecnología, Departemen Fisiologi, Biologi Molekuler dan Seluler, Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam, 
Universitas Buenos Aires. Av. Intendant Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina b INGEBI­
CONICET, Vuelta de Obligado 2490, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina c Sistematika Laboratorium Vaskular Tanaman, 
Departemen Keanekaragaman Hayati dan Biologi Eksperimental, Fakultas Ilmu Exact alam, Universidad de Buenos Aires.  Av 
Walikota Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentinasejarah

articleinfo

.Pasal  Diterima 13 Juni 2011 Diterima dalam bentuk direvisi 7 Oktober 2011 Diterima 4 November 2011 Tersediaxxx secara

Kata kuncionline:Transgenik Potato Resistance AP24 osmotine lisozim Dermaseptin Erwinia carotovora Streptomyces scabies 
Phytophthora infestans Fusarium solani Rhizoctoniasolani

abstrak

tanaman tuberosum SolanumApakah Berubah dengan tiga konstruksi genetik tiana tabacum mengungkapkan osmotine AP24
Nico, Phyllomedusa sauvagii dermaseptin dan Gallus gallus lisozim, dan dengan double­transgen mengungkapkan pembangunan
AP24   dan   urutan   lisozim.   Re­transformasi   tanaman   dermaseptin­Berubah   Dengan   pemilihan   AP24   /   lisozim   tanaman
diperbolehkan   konstruksi   simul­   simultan   mengungkapkan   tiga   transgen.   garis   kentang   mengekspresikan   transgen­transgen
kombinasi tunggal atau ganda dan tiga diuji untuk ketahanan terhadap Erwinia carotovora menggunakan seluruh tanaman dan tes
infeksi   umbi.   tingkat   resistensi   untuk   infeksi   Kedua   tes   konsisten   untuk   PALING   garis   kentang   Dibandingkan   dan   seleksi
diperbolehkan fenotipe sangat tahan. Adalah tingkat resistensi yang lebih tinggi ditemukan di garis membawa dermaseptin dan
lisozim   urutan,   menunjukkan   Bahwa   protein   adalah   tesis   utama   tributors   con   untuk   aktivitas   antibakteri.   Hasil   yang   sama
diperoleh dalam tes infeksi umbi Dilakukan Dengan Streptomyces scabies. baris tanaman yang menunjukkan resistensi yang
lebih tinggi terhadap infeksi bakteri Apakah Tertantang Dengan Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani dan Fusarium solani.
tingkat signifikan resistensi terhadap masing­masing patogen ini Were semi­kuantitatif dibuktikan Mempekerjakan tes berbasis di
terpisah daun­inokulasi, penghambatan pertumbuhan jamur dan inokulasi tanaman vitro. Atas dasar hasil ini, kami mengusulkan
susun transgen ini Itu adalah pendekatan yang menjanjikan untuk Mencapai resistensi terhadap bakteri patogen dan jamur Kedua.

© 2011 Elsevier­undang.

1. Pendahuluan

Kentang Terkena banyak penyakit memproduksi kerugian ekonomi yang besar di seluruh dunia. bakteri patogen, seperti
Erwinia   carotovora   dan   Streptomyces   scabies,   dan   jamur   patogen,   seperti   Phytophthora   infestans,   Fusarium   solani   dan
Rhizoctonia solani, sering terjadi di daerah produksi PALING dan memerlukan beberapa langkah­langkah pengendalian untuk
mengurangi kejadian mereka (Stevenson et al, 2001; Termorshuizen 2007 ). Erwinia adalah agen penyebab penipu dan lembut­
busuk   penyakit,   masing­masing   Melibatkan   gejala   parah   pada   daun   dan   umbi   jaringan   (Pérombelon,   2002).   Streptomyces,
meskipun tidak serius Mempengaruhi hasil, Anda menghasilkan lesi umbi keropeng sig­ nificantly Kurangi Itu jual kentang. Di
antara patogen jamur, P. infestans menghasilkan gejala yang sangat merusak Mempengaruhi daun, batang dan umbi­umbian
(Erwin dan Ribeiro, 1996), sedangkan F. solani dan R.

Sesuai penulis. Telp:. +54 11 4756 3300x448. alamat E­mail: mrivero@fbmc.fcen.uba.ar, riveromer@gmail.com (M. Rivero), 
amentaberry@fbmc.fcen.uba.ar (A. Mentaberry).

solani   diinduksi   stolon   dan   umbi   penyakit   yang   menyebabkan   kecambah   kematian,   pengembangan   tanaman   miskin,   dan
mengurangi jumlah umbi dan ukuran (Gerlach dan Nirenberg, 1982; Sneh et al, 1991). Sedangkan kontrol bakteri saat ini terbatas
pada prosedur profilaksis, penggunaan umbi bibit Termasuk tified cer­, Meminimalkan umbi memar dan disinfeksi sebelumnya
untuk   penyimpanan,   manajemen   jamur   Mengandalkan   terutama   padapraktek­praktek   budaya   dan   ekstensif   menggunakan
fungisida (Platt dan Petters, 2006; Lebecka et al., 2006). Fungisida Memberikan gelar cukup perlindungan, tetapi aplikasi mereka
masuk biaya produksi yang lebih tinggi, dapat menginduksi resistensi jamur, dan ronmental gus Melibatkan Peningkatan Risiko.

resistensi genetik terhadap penyakit bakteri dan jamur telahsulit karena Melaksanakan kelangkaan gen Alam R dan waktu
yang   lama   Terlibat   dalam   pemuliaan   kentang.   Strategi   dieksplorasi   untuk   menghasilkan   resistensi   oleh   Sarana   Pendekatan
Rekayasa   Genetika   mencakup   langkah­langkah   yang   berbeda   dari   tuan   Mempengaruhi­patogen   interaksi,   memunculkan
dariseperti respon pertahanan tanaman, penghambatan faktor virulensi bakteri atau jamur dan ekspresi pon com­ antimikroba dari
tanaman dan non­tanaman asal (Shah, 1997; Mourgues et al, 1998; Melchers dan kelip, 2000; Osusky et al, 2005). Meskipun

0168­1656 / $ ­ melihat hal depan © 2011 Elsevier­undang. doi: 10,1016 / j.jbiotec.2011.11.005

jou rn ke epage hom: www.elsevier.com/locate/jbiotec
PASAL G Model Biotec­5919; Jumlah Halaman 10

DI PRESS
2M Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­xxx

perlindungan yang signifikanTelah Diperoleh di sejumlah kasus, resistensi simultan ke berbagai patogen telahpernah ficult dif­
untuk mencapai. Salah satu cara yang mungkin untuk mencapai tujuan esta adalah piramida dari transgen encoding antibakteri
dan antikegiatan jamur melengkapi gal (Campbell et al, 2002; Datta et al, 2002; Douglas dan Halpin, 2009). strategi transformasi
beragam digunakan untuk gen Telah susun, silang konvensional ing Termasuk seksual, re­transformasi, co­transformasi dan
transformasi Dengan transgen terkait (Qi et al, 2004; Halpin, 2005; Lee et al, 2007; Jha dan Chattoo, 2009). Setiap Pendekatan
ini menyajikan kelebihan dan keterbatasan harus hati­hati Dianggap Itu MENURUT modus reproduksi dari tanaman dan Tujuan
diproyeksikan.

peptida antimikroba kationik (CAP) yang hadir di alam luas dan Memberikan awal, penghalang pertahanan non­spesifik terhadap
bakteri, jamur dan protozoa. Beberapa ratus CAP char­ acterized Telah pada organisme Termasuk serangga, krustasea, mamalia
dan tanaman (Zasloff, 2002). Model untuk Jelaskan aktivitas dalil mereka paraf interaksi antara muatan positif di domain
hidrofilik CAP dan muatan negatif pada komponen struktural membran bakteri, diikuti oleh pembentukan pori, fisik dan / atau
gangguan membran fungsional dan lisis sel berikutnya (Yeaman dan Yount 2003 ). CAP diklasifikasikan menjadi Biasanya
Termasuk Mereka peptida ­helical ­ dermaseptins Seperti, cecropins dan inins Mage ­ dan ­sheet Termasuk Mereka peptida ­
defensin Seperti, dan tachyplesins protegrins. Transformasi dari urutan spesies tanaman encoding Dengan CAP dan Analog
mereka mempertimbangkan penggunaan tingkat mampu perlawanan diberikan ke banyak mikroorganisme fitopatogenik (Arce et
al, 1999; Chakrabarti et al, 2003; Alan et al, 2004). maseptins Der­ adalah CAP asam amino 28­34 terisolasi dari katak dari genus
Phyllomedusa menunjukkan aktivitas in vitro terhadap bakteri, jamur protozoa mentous baris­dan ragi. Berubah tanaman kentang
Dengan analog dermaseptin MsrA2 pameran luas jangkauan ketahanan terhadap jamur fitopatogenik, Termasuk Cercospora,
Fusarium dan Pythium (Osusky et al., 2005).

Lysozymes menghidrolisis asam N­asetil­d­muramic: N­acetyl linkage D­glukosamin dari peptidoglikan, AKIBAT degradasi
parsial dinding sel bakteri dan lisis bakteri (Höltje, 1996). Enzim Milik keluarga ini terisolasi dari sumber yang berbeda Memiliki
Berkunjung dan kegiatan lisozim­seperti yang juga hadir dalam vakuola dari Beberapa spesies tanaman lar cellu­. akumulasi
konstitutif   lisozim   eksogen   dalam   ruang   apoplasmic   dapat   menjadi   penghalang   efektif   untuk   menangkap   serangan   Kedua
necrotrophic dan biotrophic teria bac­. Hen putih telur lisozim di transgenik akumulasi tanaman kentang pertumbuhan Jauh
menghambat spesies bakteri Beberapa, E. carotovora Termasuk dan Pseudomonas syringae (Kato et al., 1998). Demikian pula,
ekspresi T4 dan lisozim manusia dalam tembakau dan kentang tanaman Menghasilkan E. carotovora resistensi parsial untuk P.
syringae dan (selama, 1993; Serrano et al, 2000), dan ekspresi dari T4 lisozim di kultivar apel yang disediakan resistensi yang
signifikan untuk tion terinfeksi oleh E. amylovora (Hanke et al., 1999). Di samping, ekspresi lisozim manusia dalam tanaman
terhambat tembakau pertumbuhan jamur, gesting nyarankan­ untuk memungkinkan pemanfaatan untuk tanaman lain patogen
Control (Nakajima et al., 1997).

AP24 adalah terkait patogenesis protein taumatin­seperti yang merupakan milik keluarga PR­5 Yang awal Ditandai sebagai
protein anti jamur (Abad et al., 1996). AP24 menginduksi lisis sel dengan mekanisme Melibatkan pembentukan pori dan disipasi
potensial membran (Selitrennikoff, 2001). tanaman kentang mengungkapkan AP24 transgen menunjukkan peningkatan resistensi
terhadap P.  infestans  (Liu  et  al.,  1994)  dan  tanaman  tomat  Berubah  tembakau  Dengan  transgen  AP24  dan  kacang  kitinase
Menunjukkan peningkatan daya tahan terhadap Fusarium oxysporum (Ouyang et al., 2005).

Tiga protein antimikroba Termasuk dalam pekerjaan penelitian ini Apakah dipilih berdasarkan risiko rendah diduga mereka
untuk konsumsi manusia. Hen lisozim putih telur adalah salah satu enzim protein lebih sively memperpanjang Belajar de este
keluarga dan itu sudah
hadir   dalam   banyak   komponen   bahan   makanan.   Tembakau   AP­24   adalah   homolog   protein   respon   pertahanan   Yang   Telah
Counterpart pada tanaman yang dapat dimakan dan saham homologi urutan signifikan Dengan taumatin, ral natu­ untuk diterima
sebagai agen pemanis penyedap aman di Beberapa negara (Singh et al., 1987). Di samping, seperti peptida lainnya antimi­ crobial
Hewan   yang   diturunkan,   turunan   dermaseptin   Telah   diusulkan   berpotensi   sebagai   makanan   tambahan   untuk   Pengendalian
mikroorganisme resisten (Yaron et al., 2003).

Dalam  tulisan  ini,   kami  melaporkan  tingkat  resistensi  tinggi  untuk  E.   carotovora  dan  S.   scabies  di  Solanum  tuberosum
Beberapa baris Berubah Dengan konstruksi yang berbeda mengungkapkan dermaseptin, lisozim dan AP24 coding urutan. Garis
menunjukkan resistensi terhadap bac­ teria lebih tinggi Juga Menunjukkan Peningkatan resistensi terhadap infeksi infestans P.
Dengan, R. solani dan F. solani, menunjukkan ekspresi gabungan Itu ini transgen antimikroba Bisa menjadi pendekatan yang
cocok untuk Mendapatkan stabil, luas jangkauan perlindungan terhadap berbagai jenis bakteri patogen kentang.

2. Bahan dan metode

2.1.  genetik

Konstruksidermaseptin   coding   urut   dari   Phyllomedusa   sauvagii   (GenBank   AJ564794.1;


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank), situs untuk NcoI mengapit Termasuk dan XbaI, disintesis menggunakan oligonukleotida
tumpang tindih enam sebagian (Gao et al., 2003). DNA fragmen dimurnikan dihasilkan dan dikloning ke dalam plasmid pHES74,
wadah yang berisi virus kembang kol mosaik (CaMV) 35S moter pro, Tobacco mosaik virus (TMV) penambah, yang esporamine
sinyal peptida pra­peptida dan nopaline synthase (Tnos) tran­ skripsi pemutusan urutan (Lopez et al., 1996). Ekspresi kaset
dibebaskan dari pHES74 oleh HindIII pencernaan dan sub­kloning ke dalam pPZP200 vektor biner yang membawa bar gen
sebagai penanda dipilih (Romano et al., 2003), SEBAB Berasal pertengahan PDE plasticized. Ayam putih telur urut lisozim yang
Diperoleh dari pUC kontainer plasmid­lyso mengandung lisozim coding urutan menyatu dengan barley ­amylase sinyal peptida
dan diapit oleh dua promotor CaMV 35S dan urutan Tnos (Serrano et al., 2000). Ekspresi kaset adalah sub­kloning ke lain
pZP200 sion ver­ membawa gen HPH sebagai penanda dipilih, plasmid Berasal lapis. Akhirnya, HindIII­fragmen dari plasmid
pHAP17 (lembut pro­ vided oleh Dr Guido Jach, Max Planck Institute) Termasuk 35S promotor panjang, penambah TMV, barley
­amylase sinyal peptida, yang AP24 coding urutan dan urutan Tnos, itu sub­kloning ke situs HindIII dari plasmid lapis untuk
memberikan pApLy. Fragmen yang sama sub­kloning di situs HindIII dari pBIN19 vektor biner yang membawa gen penanda
nptII dipilih untuk Gen erate sebagai plasmid pap.

2.2. bahan tanaman dan transformasi kentang

S. tuberosum Bersertifikat (cv. Spunta) minitubers digunakan sebagai bahan awal Were untuk perbanyakan tanaman dan
transformasi prosedur­prosedur. Transformasi minituber itu Dilakukan cakram seperti yang dijelaskan oleh Stiekema et al. (1988)
co­budidaya   menggunakan  Agrobacterium   tumefaciens  strain   EHA101  Dengan.   Menurut   penanda  selektif   digunakan  dalam
transformasi tor, eksplan Apakah Ditransfer ke media regenerasi Dilengkapi Dengan 10 mg / L higromisin, 50 mg / L kanamisin
dan   /  atau   1,5   mg  /   L  glufosinate.   tanaman   Triple­transgenik  Apakah   Diperoleh  ulang   transformasi  garis   mengekspresikan
dermaseptin­ (De­8) Dengan pembangunan pApLy. Tanaman berkembang di media selektif Apakah Dikalikan ditions con­ di
aseptik selama 2 bulan, Ditransfer ke tanah dan tumbuh selama 3­4 bulan dalam ruang pertumbuhan pada 20 di bawah 16 h  ◦C
penyinaran. bers Minitu­ 2­4 cm dengan diameter dan disimpan pada Apakah dipanen 4 ◦C, 100%

Silahkan mengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba pada tanaman kentang 
transgenik menganugerahkan Peningkatan ketahanan terhadap bakteri patogen dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005
PASAL Biotec Model G­5919; Jumlah Halaman 10

DI PRESS
M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­ xxx 3

kelembaban relatif. tanaman T0 transgenik digunakan dalam tes infeksi Apakah Dikalikan agamically dan disimpan di bawah
seleksi untuk 3­4 tahun secutive con.

2.3. strain bakteri dan jamur

dari E. carotovora ketegangan ECAT spp. atroseptica baik yang disediakan oleh Dr J. Kalazich (INIA­Remehue, Chili). S.
kudis dan F. solani yang diisolasi dari berpenyakit Apakah umbi kentang prosedur­prosedur MENURUT standar (Schaad et al.,
2001) R. solani dan P. infestans strain Apakah Diperoleh dari Dr. C. Rovere (INTA­Castelar, Argentina).

2.4. Southern analisis blot

DNA genom dari daun kentang transgenik diisolasi menggunakan protokol CTAB­ekstraksi (Dellaporta et al., 1983). aliquots
lima g endonuklease restriksi Apakah dicerna Dengan XbaI, EcoRV dan BamHI, dielektroforesis dalam 0,8% gel agarose dan
ditransferuntuk   membran   Nylon.   Fragmen   Sesuai   dengan   gen   trans­   berbeda   Apakah   probe   cDNA   tertentu   hibridisasi
Denganberlabel Dengan

32 P dCTPdan terdeteksi oleh autoradiografi.

2.5. Persiapan ekstrak daun dan protein kuantifikasi

Lima g jaringan daun beku Apakah tanah dalam nitrogen cair dan Ditransfer ke wadah tabung berisi dingin (4  ◦C) TCA di
10% aseton ditambah 0,07% ­mercaptoethanol. Setelah sampel vortexing pra­ cipitated pada ­20 Apakah  ◦C selama 45 menit dan
kemudian disentrifugasi pada 14.000 g selama 15 menit pada 4 ° C. Supernatan dibuang dan membiarkan pel­ dicuci Dengan pra­
dingin 90% aseton kontainer yang mengandung 0,07% ß­mercaptoethanol. Setelah sentrifugasi pada 4 sampai  ◦C baru, 14.000 g
selama 15 menit pelet dicuci tiga kali dan kembali ditangguhkan dalam aseton dan berputar di 14.000 g selama 5 menit pada 4 °
C. Akhir­akhir ini Tein pelet pro adalah udara kering dalam kap aliran laminar dan disimpan pada suhu ­20 ° C. Penentuan total
protein terlarut selesai spec­ trophotometrically MENURUT Bradford (1976) Dengan BSA sebagai standar. AP24, dermaseptin
dan lisozim konsentrasi yang diekstrapolasi dari kurva standar dalam immunoblots Barat. Sam­ prinsip keuangan dari tanaman
transgenik dan standar Pengenceran Control dan dielektroforesis di SDS­Were gel poliakrilamida, dan ditransferuntuk membran
nitroselulosa diinkubasi Dengan antibodi diangkat ke BSA­terkonjugasi dermaseptin (1: 200), lisozim (1: 200) atau AP24 (1:
400) dan sekunder antibodi terkonjugasi dengan horseradish peroksidase antibodi. band tertentu Apakah terdeteksi oleh luminol /
H

Modifikasi. Setiap assay termasuk 15 cakram umbi yang berasal dari garis transgenik tunggal dan kontrol non­Transformed.
Volume maserasi (MV) dari cakram umbi Diinokulasi (10 L dari pensiun mempertahankan satu bakteri dari 2 × 105 cfu) telah
Estimasi oleh penggantian jaringan dimaserasi volume yang sama dengan air. Adalah esti­ dikawinkan titer bakteri dengan
menangguhkan jaringan dimaserasi dalam 20 L air steril dan melakukan plating pengenceran serial media nutrien agar pada. E.
carotovora penghambatan tes: Sekitar 500 mg daun segar tis­ menuntut dari planlet axenically tumbuh Apakah tanah dalam
cairan N

dan disentrifugasi pada 9000 g selama 15 menit pada 4  ° C.
Sembilan puluh lima natant super L Apakah dicampur dengan 1 × kemudian106 sel E. carotovora dan diinkubasi selama 2 jam
pada   22   °   C.   Setelah   8.12   jam   pada   28   ◦C   untuk   pemulihan   di   LB   menengah   setengah   kekuatan,   pertumbuhan   bakteri
dikuantifikasi dengan pengukuran OD pada 550 nm.

E. carotovora tumbuh penghambatan tes: Freshly dipanen umbi dipotong kecil­kecil Apakah kontainer yang berisi umbi mata
tunggal dan pra­diobati dengan asam giberelat 1 mg / L untuk memecahkan dormansi umbi. Dua puluh buah dari setiap baris
transgenik dan non Berubah diinokulasi Kontrol Apakah E. carotovora dengan inokulum segar (1 x 106 cfu) dan ditanam di pot
campuran steril dalam kondisi yang terkendali. Umbi Tumbuh itu DITINJAU setelah 3 minggu. Tes Apakah berulang 3 kali.

S. tes infeksi scabies Tuber: Perlawanan yang dipantau berdasarkan Dijelaskan oleh prosedur Labruyere (1971). Apakah
Tanaman tumbuh sampai pengembangan yang lengkap (9­12 minggu) pada 20  ◦C Dengan irigasi infeksi bakteri minimal untuk
Promosikan. Baru dipanen dan umbi­umbian DIBENTUK dievaluasi untuk penyakit menggunakan skala sewenang­wenang (5
Gambar. Dan Tambahan Tabel 1). Terdiri Tes untuk syn gle acak kelompok tiga ulangan dari 10 sampai 15 tanaman Termasuk
dari setiap baris transgenik.

S. scabies penghambatan assay: Aktivitas antibakteri dari ekstrak tanaman bertekadMenurut Dilaporkan oleh protokol Keinath
dan Loria (1991). Diukur oleh pertumbuhan bakteri adalah pada 600 pengukuran OD nm setelah pemulihan semalam di 24 LB ◦C
menengah.

2.7. tes infeksi jamur

P. infestans tes keseluruhan­tanaman: In vitro tes keseluruhan­tanaman aseptik ditanam di Were Dilakukan 3­4 plantlet minggu­
tua. Blok agar (1 cm2) membawa P. infestans miselium itu Ditempatkan 2 cm dari batang. pengembangan gejala tercatat setiap
hari dan tanaman Apakah Mencetak untuk ketahanan terhadap pengembangan MENURUT sedang atau berat Entah kanker gejala
(daun bercak gelap, batang coklat dan runtuhnya tanaman). Non­Berubah tanaman Kontrol Biasanya O

reaksi. Chemiluminescence terdeteksi pada

runtuh setelah film radiografi dan 3­5 dpi 
dikuantifikasi Band intensitasMempekerjakan

F. solani Tubertes infeksi: Tes dilakukan dengan 
menggunakan program ImageJ dan dimaksud untuk total protein larut. Antibodi

untuk modifikasi prosedur Dijelaskan oleh Herrmann 
et al. untuk dermaseptin dan lisozim Apakah Diperoleh kelinci immuniza­

(1996) dan Osusky et al. (2005). berat segar setiap tion
minituber menggunakan dermaseptin BSA­terkonjugasi (GL Biochem) dandimurnikan

pada awalDitentukan dari assay dan pada 72 jam 
setelah inokulasi ayam lisozim (Sigma) sebagai antigen. Antibodi untuk AP24 Apakah

lation Dengan 20 l dari 1 × 108 konidia untuk suspensi
/ ml. Pada saat ini, dengan lembut disediakan oleh Dr. Rovere (INTA, Castelar, Argentina).

Adalah minitubers dipotong secara longitudinal. Volume jaringan nekrotik adalah menghitung volume Perkiraan oleh rongga
silinder 2,6. Infeksi bakterites

setelah penghapusandibuat Umbi nekrotik dan mati Disebabkan oleh jaringan infeksi jamur. Tes termasuk per baris dan 25 umbi
E. carotovora Were keseluruhan­tanaman tes infeksi: Perlawanan itu dilakukan adalah evaluasi

tiga kali berulang. MENURUT prosedur diciptakan 
Dijelaskan oleh Arce et al. (1999). Setiap
infestans P. dan R. solani terpisah assays­ daun: 
Terpisah­daun assay infeksi termasuk 20 klonal yang berasal dari Individu ke syn

tes infeksi Apakah dilakukan seperti yang dijelaskan 
oleh Osusky et al. Acara gle transgenik dan jumlah setara non­Berubah

(2005). Tanaman yang digunakan dalam tes ini 
Apakah tumbuh selama 3 minggu pada 20 kontrol ° C. Dilakukan inokulasi menyuntikkan 10 L dari bakteri

h penyinaran di bawah 16. Setiap blok eksperimental 
Terdiri 10 suspensi (6 × 107 cfu) di tunas basal ketiak. Gejala opment

sepenuhnya diperluas daunukuran yang sama dan 
kondisi fisiologis ngunan itu Dipantau pada 5, 10, 15 dan 30 hari pasca­infeksi

sampel dari 15 sampai 20 tanaman tunggal Mewakili 
trans tunggal (dpi) dan diukur sewenang­wenang MENURUT Indeks penyakit (DI;

jalur genic atau Daun non­Berubah Kontrol Apakah 
terpisah Gambar5.). uji pendahuluan Apakah sampai 5 kali Diulang selama PALING

Segera sebelum inokulasi jamur. Untuk R. inokulasi 
solani, garis transgenik.

cakram miselium (0,5 cm diameter) di Apakah 
Ditempatkan E. carotovora kiri umbi disc tes maserasi atas: Tes Apakahcon­

industridari setiap daun. Untuk P. infestans inokulasi, 
suspensi con­ menyalurkan seperti yang dijelaskan oleh Lapwood et al. Denganminor(1984)

taining2 x 104 sporangia terlihat di setiap permukaan daun setelah

Harapmengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba pada tanaman kentang transgenik
menganugerahkan Peningkatan ketahanan terhadap patogen jamur dan bakteri . J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005
PASAL Biotec Model G­5919; Jumlah Halaman 10

DI PRESS
4 M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­ xxx

melukai dengan jarum steril. daun non­terinfeksi dari trans­ genic dan kontrol tanaman Apakah termasuk sebagai kontrol negatif.
Apakah Daun dibuang ke dalam wadah tertutup dan diinkubasi dalam gelap pada 24  ◦C selama 4­5 hari. Apakah Daun Hewlett
Packard telah dipindai menggunakan Scanjet G3110 untuk. Daun gambar diuraikan Apakah Dengan Photoshop 6.0 (Adobe
Systems) dan Analisa Dengan Matrox Inspektur 8,0 (Matrox Sistem Elektronik) untuk mengukur daerah lesi nekrotik. Total luas
daun ditentukanmenggunakan Wilayah alat Kepentingan gram pro sama dan melakukan "gumpalan" analisis. daun individu
sebagai nilai­nilai Apakah yang dimaksud daripersentase total luas daun (persentase daerah nekrotik;% NA) dan digunakan untuk
menghitung nilai rata­rata untuk setiap baris kentang.

R.   solani   dan   F.   pertumbuhan   solani   penghambatan   tes:   hambatan   pertumbuhan   jamur   tercatat   menggunakan   uji   difusi
Dilansir Roberts dan Selitrennikoff (1988). Sebuah plug agar kecil (1 cm2) dari wadah masing­masing mengandung spesies
miselium jamur itu Ditempatkan di tengah cawan Petri Mengandung Potato Dextrose Agar menengah dan diinkubasi selama 48
jam   pada   22­24   ◦C   untuk   memungkinkan   spora   dan   pertumbuhan   hifa.   Kemudian,   cakram   saring   steril   radial   Apakah
Ditempatkan pada permukaan agar­agar dan dimuat Dengan 200 L dari ekstrak tumbuhan. Ekstrak dari tanaman non­Berubah
Apakah dimasukkan sebagai kontrol negatif. cawan Petri Apakah diinkubasi selama 5­7 hari pada 24  ◦C dan pertumbuhan jamur
tercatat di Time ini.

2.8. Mikroskopispengamatan

potonganLesi dari Sekitar 25 mm2 Apakah sampel dari cakram umbi Diinokulasi Dengan E. carotovora pada 24, 48 dan 72
jam pasca inokulasi. Spesimen Apakah tetap dan dehidrasi, titik kritis kering, dipasang di bertopik aluminium, metalisasi dengan
emas oleh ion menggerutu­coating (SCD 030, Balzers) dan Diperiksa oleh JSMII scan­ ning mikroskop elektron (JEOL) pada 15
kV. sampel umbi Diinokulasi Dengan S. scabies diamati di bawah mikroskop stereoskopik (Nikon, Optiphot­2). budaya hifa
dewasa S. scabies Apakah mengerami tertahan Dengan 85 L tanaman transgenik dan non­transgenik dari ekstrak seperti yang
dijelaskan untuk Meraih tes penghambatan jamur tumbuh. Setelah 24 jam inkubasi pada 24  ◦C­, efek pada morfologi bakteri
Apakah dicatat oleh mikroskop optik (Nikon).

2.9. Analisis statistik

Data yang diperoleh dari bakteri dan jamur tes tion menular yang berbeda dievaluasi secara terpisah dengan analisis varians
(ANOVA).   prosedur   berarti   untuk   imental   exper­   acak   desain   blok   lengkap   dengan   menggunakan   Statistika   dilakukan   6.0
(StatSoft Inc, 1984­2001) dan BIOMSTAT / STATISTICA. Fisher paling signifikan prosedur perbedaan (LSD) digunakan untuk
membandingkan Sarana Antara DIs.

3. Hasil

3.1. transformasi kentang dan pemilihan tanaman yang tahan

Erwinia­Transformasieksplan   umbi   Dengan   PDE,   lapis,   PAP   dan   konstruksi   genetik   pApLy   (Gambar.   1)   Menghasilkan
tanaman tunggal dan double­transgen mengungkapkan dermaseptin, lisozim, AP24 AP24 ditambah lisozim dan urutan , masing­
masing.   Adalah   tanaman   transgenik   triple   dihasilkan   oleh   re­transformasi   garis   dermaseptin­mengekspresikan   (garis   De­8)
Dengan pApLy tion konstruktif. frekuensi transformasi untuk konstruksi individual bervariasi antara 30 dan 45%. Sebaliknya,
transformasi quency re­fre­ jauh lebih rendah (0,75%) dan hanya tiga baris ApLyDe Bisa Diperoleh. Sebuah analisis Southern
blot dari garis termasuk dalam transgen menyalin tes infeksi PALING berbagai nomor Antara 1 dan 2 (Tambahan Gambar. 1).

Gambar. 1. Skema representasi dari konstruksi genetik yang digunakan dalam pekerjaan esta. (A) ­ (d): kaset Ekspresi pap, BGG,
PLY dan plasmid pApLy. 35S: CaMV 35S promoter; 2 x 35S: Digandakan CaMV 35S promoter; L35S "lama" CaMV 35S
promotor; PNos: nopaline synthase promotor; Tnos: nopaline synthase transkripsi pemutusan urut tion; Lys, Der dan AP24:
Gallus gallus lisozim, Phyllomedusa sauvagii dermaseptin dan Nicotiana tabacum AP24 coding urutan, masing­masing; bar:
phosphinotricin asetil transferase; HPH: higromisin phosphotransferase; nptII: neomicyn phosphotransferase; : TMV translasi
penambah; Hal ini apoplastic espo­ Ramine sinyal peptida; Amy: Barley apoplastic ­amylase sinyal peptida; RB dan LB: kanan
dan batas kiri wilayah Agrobacterium T, masing­masing. Skema tidak untuk skala.

Apakah kandidat transforman dengan analisis PCR DITINJAU. Sev enty dua tanaman R0 menampilkan band­band yang
diharapkan diagnostik Apakah micropropagated dan preliminarily diputar di tes keseluruhan­tanaman menggunakan tion menular
Erwinia inokulum (1 x 105 cfu). Akibatnya, 19

Gambar. 2 (a) skala DI digunakan dalam tes infeksi Erwinia carotovora. Angka dari kiri ke kanan Tunjukkan Peningkatan DIs.
(1) tanaman yang sehat; (2) gejala klorosis ringan; (3) daun klorosis dan nekrotik dewasa; (4) layu dan batang nekrotik; (5)
tanaman mati. (B) Peningkatan ketahanan terhadap E. carotovora. Whole­tanaman tes infeksi Apakah dilakukan seperti yang
dijelaskan dalam Bagian 2 menggunakan inokulum dari 6 × 107 Perwakilan 4­blok cfu untuk jalur tanaman transgenik berbeda
ditunjukkan. Setiap assay termasuk 20 tanaman per baris. (1) Non­Transformed; (2) ApLyDe­12; (3) aply­47; (4) De­8; (5) Ap­2;
(6) Ly­55. Whole­tanaman tes berulang Apakah Setidaknya 3 kali untuk setiap baris transgenik. Gambar diambil empat minggu
setelah inokulasi bakteri.

Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba pada tanaman kentang 
transgenik menganugerahkan Peningkatan ketahanan terhadap patogen jamur dan bakteri. J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005
PASAL DALAM PERS G 
Model
BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10

M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­ xxx 5

Gambar. 3. Peningkatan resistensi terhadap Erwinia carotovora. Umbi tes maserasi Apakah dilakukan seperti yang dijelaskan
dalam Bagian 2 menggunakan inokulum dari 2 x 105 gejala Perwakilan cfu dari uji Termasuk umbi 15 per baris yang akan
ditampilkan. (A) Diinokulasi non­Berubah; (B) diinokulasi Ly­55; (C) De­diinokulasi 8; (D) diinokulasi aply­47; (E) Diinokulasi
ApLyDe­12; (F) non­Diinokulasi non­Transformed.

Berperilaku garis sebagai sangat tahan Apakah Dipilih untuk analisis lebih lanjut (Tambahan Tabel 1). arsitektur umum tanaman,
ukuran umbi dan nomor, dan waktu perkembangan tanaman ini konsisten dengan fenotip non­Transformed. pengobatan statistik
menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan (p = 0,08777) antara Ap dan Ly garis transgenik tunggal, tetapi menemukan
perbedaan yang signifikan yang pengupas com­ Ketika Ap dan Ly baris dengan ekspresi dermaseptin (De) baris (p = 0,02777 p =
0,02899 dan masing­masing ). Juga, perbedaan yang mendasar Ap dan garis ini Ly ditemukan Were Ketika Dibandingkan Untuk
double­(aply) dan garis triple­transgenik (ApLyDe) (p = 0,03399 p = 0,04122 dan, masing­masing). Perbedaan signifikan yang
ditemukan dalam semua kasus Ketika Membandingkan garis tanaman transgenik untuk kontrol non­transgenik (p ≤ 0,05).

Dalam putaran sekunder tes infeksi, garis­garis yang dipilih Apakah PERINGKAT untuk ketahanan menggunakan indeks
penyakit semi­kuantitatif (DI; Gambar2a). Untuk lebih membedakan antara baris sangat tahan, bac­ inokulum terial adalah 6 ×
107 untuk Peningkatan cfu Dalam kondisi ini, tanaman Pengendalian meninggal di sekitar persiapan 15 dpi Sebaliknya, tanaman
transgenik Tetap gejala sehat atau hanya minor ditampilkan sampai 30­60 dpi (Gambar. 2b). Garis mengungkapkan tiga transgen
(garis ApLyDe­ 7 ApLyDe­8 dan ApLyDe­12; DIs: 1,0­1,4) dilakukan lebih baik dari garis mengekspresikan dua transgen (garis
aply­35, aply­47, ApLy­ 48, aply­52 dan aply­60; DIs: 1,7­2,1) atau transgen tunggal (garis Ap­1, Ap­2, AP­3, In­2, In­8, De­10,
In­19, In­23, Ly­55 , Ly­59 dan Ly­80; DIs: 1,6­2,8) (Tambahan Tabel 1). Dermaseptin­ garis Berubah (garis De­2 dan In­8; DIs:
1,6 dan 1,9) ditampilkan perlawanan antibakteri terkuat antara garis tunggal transgen. Mengevaluasi ketekunan gejala busuk
lunak, semua lini transgenik Apakah tumbuh sampai jatuh tempo dan umbi­umbian mereka Dikumpulkan. Tidak ada tanda­tanda

infeksi setelah Mungkinkah Diamati 18 bulan umbi penyimpanan; pada gilirannya, menghasilkan umbi ini tanaman yang sehat
dan umbi­umbian yang ditanam dalam tanah Ketika steril (hasil tidak ditunjukkan).

19 garis diuji dalam tes keseluruhan­tanaman yang diuji dalam maserasi assay umbi disc (Gambar. 3a­f). tion pelindung
hampir lengkap ditemukan di umbi dari garis mengungkapkan tiga transgen (ApLyDe­7 ApLyDe­8 dan­12 jalur ApLyDe; MV:
0,13­0,23   mL).   Umbi  mengungkapkan   dua  transgen   (aply­35,   aply­47,   aply­48,   aply­52,   aply­60;  MV:   0,24­0,29  mL)   atau
transgen tunggal (De­ 2 De­8, De­10, De­ 19, In­23; MV: 0,26­0,48 mL dan Ly­55, Ly­59, Ly­80; MV: 0,31­0,39 mL, masing­
masing) Menunjukkan Juga tingkat signifikan resistensi. Sebaliknya, umbi­umbian non­Berubah Menunjukkan maserasi yang
luas (MV: 4 mL) (Tambahan Tabel 1). Lesi pada umbi triple­transgen Were Tentang 10 kali lipat lebih kecil dari orang­orang
dari kontrol, tidak Meningkatkan setelah infeksi awal dan Tampak kering dan periang. Sebaliknya, lesi pada cakram umbi Terdiri
Kontrol atas 80­100% dari permukaan, terinfeksi Peningkatan Selama Terus tion, dan aspek berair ADH.   Penghambatan pada
pertumbuhan Erwinia juga diperkirakan oleh pengukuran langsung dari beban bakteri pada 3 dpi. Dibandingkan dengan kontrol,
penurunan hingga 6 pesanan dalam akumulasi bakteri ditemukan dalam tiga­transgene umbi (garis ApLyDe­7 dan ApLyDe­12;
Tabel Tambahan 1). Selain itu, penampilan sel bakteri diperiksa dengan pemindaian mikroskop elektron. Sampel dari tanaman
transgenik   mengandung   sel   Erwinia   yang   tersebar   yang   menunjukkan   permukaan   yang   keriput   dan   ukurannya   berkurang.
Sebaliknya,   sampel   dari   tanaman   yang   tidak   bertransformasi   mengandung   sel   yang   menunjukkan   fenotip   normal   (Gambar
Tambahan 2a dan b).

Selain itu, beberapa garis yang dipilih menjadi sasaran tuber sprout ing­tes untuk mengevaluasi kinerja mereka dalam konteks 
yang menyerupai
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang 
memberikan peningkatan resistensi untuk bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE G Model BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10

DALAM PRESS
6 M. Rivero dkk. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­ xxx

a
b
4. (a) akumulasi ProteinGambar. Pada tanaman kentang transgenik. Tingkat akumulasi dermaseptine, AP24 osmotine dan lisozim
dalam garis transgenik diukur seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2. Nilai akumulasi protein dinyatakan dalam L / g. Nilai
dalam   kurung   menyatakan   jumlah   protein   masing­masing   sebagai   persentase   total   protein   daun   (%   TLP).   (b)   Nilai­nilai
pengurangan DI dan MV untuk jalur transgenik dan non­transformasi. Nilai reduksi DI dihitung berdasarkan persamaan DI ×
100/5 di mana nilai 5 sesuai dengan DI dari kontrol yang terinfeksi (infeksi 100%). Hasil mewakili nilai rata­rata dari 5 tes
independen (n = 15­20). NT: tanaman yang tidak berubah.
Tanah yang terinfeksi Erwinia. Dalam kondisi ketat yang digunakan dalam pengujian ini, hanya 0­10% umbi yang tidak berubah
menghasilkan tunas setelah 3 minggu penanaman. Sebaliknya, tunas umbi dalam galur yang membawa dua dan tiga transgen
(garis ApLy­47 dan ApLyDe­12) mencapai 75 dan 90% masing­masing. Garis yang ditransformasikan dengan transgen tunggal
menunjukkan   persentase   pertumbuhan   yang   lebih   rendah   (garis   De­8,   60%;   garis   Ly­55,   28%;   garis   Ap­2,   16%)   (Tabel
Tambahan 1). Konsisten dengan hasil ini, ekstrak daun dari garis ApLyDe­12 menghambat pertumbuhan bakteri sebesar 85%,
sedangkan ekstrak dari garis ApLy­47, De­8, Ly­55, dan Ap­2 menginduksi penghambatan pertumbuhan yang lebih rendah (72,
68). , 60 dan 52%, masing­masing) (data tidak ditampilkan).
3.2. Aktivitas antibakteri relatif dari transgen individu
Lima jalur transgenik menunjukkan tingkat yang sebanding dari tiga protein antimikroba (garis Ap­2, De­8, Ly­55, ApLy­47
dan ApLyDe­12; Gambar. 4a) dipilih untuk mengevaluasi kontribusi transgen individu untuk perlindungan antibakteri, yang
disimpulkan dari pengurangan DI masing­masing dan nilai MV, dalam pengujian infeksi seluruh tanaman dan tuber. Garis triple­
transgene ApLyDe­12 berperilaku lebih baik (pengurangan DI: 76%; MV: 0,13 mL) daripada garis transgen ganda atau tunggal
(Gambar 4b). Namun, tingkat resistensi tinggi ditunjukkan oleh garis transgen tunggal De­8 (pengurangan DI: 62%; MV: 0,26
mL), mengekspresikan sekitar setengah tingkat dermaseptin daripada garis ApLyDe­12, menunjukkan aktivitas antibakteri yang
kuat untuk pro tein. Demikian pula, resistensi yang ditemukan sejalan Ly­55 (pengurangan DI: 58%; MV: 0,31 mL) menunjuk
lisozim sebagai sumber utama kedua resistensi. Di sisi lain, perbedaan tingkat resistensi antara garis ApLy­47 (pengurangan DI:
64%; MV: 0,24 mL) dan Ly­ 55 (pengurangan DI: 58%, MV: 0,31 mL), mengekspresikan tingkat lisozim yang sama, hanya
disarankan   kontribusi   kecil   AP24   terhadap   resistensi   bakteri.   Ini   dikonfirmasi   dalam   tes   infeksi   di   mana   garis   Ap­2  
(menunjukkan akumulasi AP24 yang sama daripada garis ApLy­47) tidak mampu mengatasi serangan bakteri (pengurangan DI:
16%).
3.3. Uji Streptomyces Infeksi
Untuk memverifikasi apakah garis yang dipilih tahan terhadap bakteri patogen lainnya, tes tuber infeksi tambahan dilakukan
dengan S. scabies sebagai agen infeksi. Hanya garis­garis yang menunjukkan
resistensi yang tinggi terhadap E. carotovora (garis De­8, Ly­55, ApLy­47 dan ApLyDe­12) termasuk dalam pengujian ini.
Sementara 100% umbi yang tidak bertransformasi mengalami lesi, sebagian besar umbi ApLyDe­12 tetap tidak terpengaruh dan
hanya 2% menunjukkan gejala keropeng minor. Demikian juga, hanya 10% dari ApLy­47 dan 3–15% dari De­8 dan Ly­55 umbi
yang mengalami lesi (Tabel 2 Tambahan). Kerang­kacangan garis transgenik hanya dangkal dan terlibat tidak lebih dari 15% dari
permukaan umbi. Sebaliknya, scab di kontrol non­transformasi terdiri 70­80% dari permukaan umbi dan termasuk lesi hingga 5
mm dalam (Gambar. 5a). Resistensi terhadap S. kudis juga diukur dalam uji pertumbuhan nutrisi dengan ekstrak daun transgenik
(Gambar 5b). Ekstrak dari garis ApLyDe­12, ApLy­47, De­8 dan Ly­55 menghasilkan penghambatan 70, 55, 60 dan 45%,
masing­masing. Tidak ada penghambatan pertumbuhan yang diamati ekstrak dari tanaman yang tidak berubah.
3.4. Uji infeksi jamur
Diharapkan bahwa, selain efek antibakteri mereka, beberapa kombinasi transgen dapat memberikan perlindungan terhadap
penyakit jamur. Untuk mengevaluasi ini, beberapa garis yang diuji untuk resistensi antibakteri ditantang dengan tiga patogen
jamur insiden tinggi dalam produksi kentang. Tes semi­kuantitatif yang berbeda digunakan untuk mengevaluasi efek dari setiap
spesies jamur.
Dua tes yang berbeda dilakukan dengan menggunakan P. infestans sebagai agen menginfeksi. Pada tes pertama, planlet dari
garis Ap­2, De­8, Ly­ 55, ApLy­47 dan ApLyDe­12 dan kontrol non­transformasi in vitro diinokulasi dan dievaluasi untuk
keterlambatan dalam perkembangan gejala dan kelangsungan hidup tanaman (Gambar 6a – e). Kinerja terbaik diamati pada garis
Ap­2, Aply­47 dan ApLyDe­12, di mana sebagian besar individu tetap tidak terpengaruh atau menunjukkan gejala hawar kecil
pada   7­10   dpi   Di   sisi   lain,   lebih  dari  50%  dari  De­8  ,   Ly­55   dan   planlet   kontrol   menunjukkan   pembusukan   lengkap   atau
menunjukkan gejala berat. Dalam kondisi uji ini, tanaman yang tidak berubah mati sekitar 3–5 dpi.
Pada uji infeksi Phytophthora kedua, daun yang terlepas dari garis yang sama diinokulasi dengan suspensi yang mengandung
1 × 105 sporangia. Derajat infeksi jamur diperkirakan mengukur lesi luas persentase pada 5 dpi (Tambahan Tabel 3). Daun dari
garis ApLy­47 dan ApLyDe­12 menunjukkan kinerja terbaik menampilkan persentase nekrotik dari 11,2 dan 9,3, masing­masing,
sedangkan daun dari garis Ap­2, menunjukkan tingkat resistensi menengah (Gambar. 6f dan 8). Dengan pengecualian garis Ly­
55, yang sangat terpengaruh, semua jalur transgenik lainnya menunjukkan perbedaan signifikan mengenai tanaman yang tidak
berubah.
Sebuah tes infeksi daun serupa diimplementasikan untuk R. solani (Gambar 7a). Pada 5 dpi, persentase daerah nekrotik
meliputi hampir 90% dari daun yang tidak berubah. Semua garis transgenik menunjukkan perbedaan yang signifikan mengenai
tanaman   yang  tidak   berubah.   Garis  ApLyDe­12   dilakukan  sebagai   sangat  tahan   hanya  menunjukkan   10,5%   dari  kerusakan
nekrotik. Garis Ap­2, De­8, Ly­55 dan ApLy­47 peringkat dalam nilai­nilai menengah yang menunjukkan area lesi dari 27,2%,
29,5%, 41,1% dan 23,7%, masing­masing (Tambahan Tabel 3). Garis De­8, Ly­55, ApLy­47 dan ApLyDe­12 juga diuji dalam
uji penghambatan pertumbuhan yang dilakukan dengan total ekstrak daun. Efek penghambatan tertinggi diamati dengan ekstrak
garis ApLyDe­12. Ekstrak dari garis Ly­55 dan ApLy­47 menginduksi tingkat penghambatan antara, sedangkan ekstrak dari garis
De­8 dan tanaman yang tidak berubah menunjukkan tidak ada tanda­tanda retardasi pertumbuhan (Gambar Tambahan 3a).
Ketahanan terhadap F. solani diuji menggunakan tes semi­kuantitatif yang mengukur volume nekrotik yang disebabkan oleh
infeksi jamur pada minituber kentang. Infeksi dengan patogen ini termasuk garis yang diubah dengan transgen tunggal dan
kombinasi dua dan tiga­transgen (Tambahan Tabel 3 dan Gambar 7b). Lesi nekrotik pada baris ApLyDe­12 terutama terbatas
pada situs inokulasi pada 5 dpi, sementara mereka termasuk
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang 
memberikan peningkatan resistensi terhadap patogen bakteri dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE DALAM PRESS 
G Model
BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10
M. Rivero dkk. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­ xxx 7
Gambar. 5. (a) Peningkatan resistensi terhadap kudis Streptomyces. Skala DI yang digunakan untuk menentukan perkembangan
gejala dirinci dalam legenda Tabel III. Perwakilan gejala dalam umbi transgenik dan non­transformasi ditampilkan. (1) Umbi
non­transformasi diinokulasi (DI = 3); (2) umbi non­diinokulasi non­diinokulasi (DI = 0); (3) diinokulasi ApLyDe­ 12 umbi (DI
= 1); (4) diinokulasi ApLy­47 umbi (DI = 1); (5) diinokulasi De­8 umbi (DI = 1); (6) diinokulasi Ly­55 umbi (DI = 2). (B) S.
inhibisi   penghambatan   pertumbuhan   scabies   oleh   ekstrak   daun   dari   garis   kentang   yang   berbeda.   Pertumbuhan   bakteri
diekspresikan sebagai nilai OD. Persentase penghambatan mengacu pada ekstrak yang tidak berubah. Batang mewakili rata­rata
tiga tes independen. Sisipan: pengamatan mikroskopis di ruang Neubauer dari kultur scabies S. diobati dengan ekstrak daun yang
tidak berubah (1) dan ekstrak daun ApLyDe­12 (2) setelah 48 jam inkubasi. Sel bakteri yang ditunjukkan pada gambar sesuai
dengan volume sampel 0,1 mm3. Batang Photomicrographs: 10 m.
sebagian besar volume minituber di kontrol yang tidak diubah. Seperti yang diamati dalam tes Phytophthora dan Rhizoctonia,
garis ApLy­47 menunjukkan lesi antara, dan garis Ap­2, De­8 dan Ly­55 menunjukkan kerusakan menengah / parah. Semua garis
transgenik   yang   diuji   menunjukkan   perbedaan   yang   signifikan   secara   statistik   dibandingkan   dengan   tanaman   yang   tidak
bertransformasi. Selain itu, ekstrak daun dari garis De­8, Ly­55, ApLy­47 dan ApLyDe­12 dipekerjakan untuk melakukan uji
pertumbuhan­inhibisi Fusar­ium. Konsisten dengan hasil yang diperoleh dalam tes minituber, ekstrak dari garis ApLyDe­12
menunjukkan tingkat penghambatan pertumbuhan tertinggi, diikuti oleh ekstrak dari garis ApLy­47, Ly­55 dan De­8 (Gambar
Tambahan. 3b). Tidak ada penghambatan pertumbuhan jamur yang diamati dengan ekstrak daun yang tidak berubah.
Nilai yang diperoleh untuk jalur transgenik single, double, dan triple­transgenik terbaik (Ap­2, De­8, Ly­55, ApLy­47 dan
ApLyDe­12) dalam beberapa tes infeksi yang dijelaskan sebelumnya dibandingkan dalam hal tingkat resistensi terhadap bakteri
dan jamur patogen (Gambar 8a dan b). Setelah normalisasi data, tingkat resistensi maksimum 1 dihitung (1 ­ X
baru
) untuk jalur triple­transgenik ApLyDe­ 12 ­ menunjukkan kinerja terbaik dalam kondisi infeksi ketat
­ dan tingkat resistensi minimum 0 dihitung untuk non­transgenik kontrol. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 8b, garis transgenik
tunggal De­8 dan Ly­55 dan garis transgenik ganda ApLy­47 menunjukkan tingkat resistensi yang sangat tinggi ketika diuji
terhadap bakteri patogen. Sebaliknya, resistensi terhadap jamur patogen pada jalur transgenik tunggal dan ganda adalah variabel
dan tampaknya lebih.
Silakan mengutip artikel ini di media: Rivero, M., dkk., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang 
memberikan peningkatan resistensi terhadap patogen bakteri dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE DALAM PRESS 
G Model
BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10
8 M. Rivero dkk. / Journal of Biotechnology xxx (2011) xxx– xxx
Gambar 6. Meningkatkan resistensi terhadap Phytophthora infestans. Infeksi planlet in vitro dilakukan seperti yang dijelaskan
dalam Bagian 2. (a) ApLyDe­12; (b) ApLy­47; (c) Ap­2; (D) De­8; (e) Ly­55; (f) NT, kontrol non­transgenik. Plantlet yang
ditunjukkan pada gambar mewakili blok termasuk 15 individu. Perkembangan gejala tercatat pada 10 dpi Semua tanaman non­
transgenik  benar­benar nekrotisasi  pada 3­5  dpi (g)  Detached­daun assay  di jalur  kentang transgenik  dan non­transformasi.
Sepenuhnya daun diperluas diinokulasi dengan 60 L dari suspensi yang mengandung 2 × 104 sporangia. Lesi yang ditunjukkan
mewakili satu blok termasuk 20 daun dari setiap garis kentang. Gambar diambil pada 5 dpi
tergantung pada kehadiran transgen­transgen spesifik atau gabungan gen­gen transgen.

4. Diskusi
Upaya untuk memperkenalkan resistensi simultan terhadap penyakit bakteri dan jamur di S. tuberosum telah langka dan 
sebagian besar
tidak   meyakinkan.   Untuk   mencapai   tujuan   ini,   kami   memilih   tiga   protein   yang   secara   individual   menunjukkan   aktivitas
antimikroba yang luas. Salah satu protein ini, lisozim ayam, adalah enzim yang dipelajari dengan baik yang mempengaruhi
bakteri Gram­positif dan Gram­negatif (Serrano et al., 2000). Lain dari mereka, AP24 osmotine, memberikan perlindungan yang
kuat untuk P. infestans dan jamur patogen lainnya (Liu et al., 1994; Ouyang et al., 2005). Melengkapi aktivitas dua protein ini,
Gambar. 7. Peningkatan resistensi terhadap Rhizoctonia solani dan Fusarium solani. (A) Terpisah daun uji dengan Rhizoctonia
solani. Sepenuhnya daun diperluas diinokulasi di sektor kanan atas dengan sumbat hial diameter 0,5 cm. Lesi yang ditunjukkan
pada gambar mewakili satu blok termasuk 20 daun dari setiap garis kentang. (B) Tuber infeksi assay dengan Fusarium solani.
Blok eksperimental termasuk 25­30 minituber dari setiap baris kentang.  Setiap  minituber  diinokulasi  dengan  suspensi  yang
mengandung 1 × 108 conidia / mL. Perwakilan daun dan tuber lesi di non­transformasi (NT), ApLyDe­12, ApLy­47, De­8, Ap­2 
dan garis Ly­55 ditampilkan. Gambar diambil pada 7 dpi di kedua (a) dan (b).
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang 
memberikan peningkatan resistensi terhadap bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE DALAM PRESS 
G Model
BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10
M. Rivero dkk. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx 9
Gambar 8. (a) Data dari Tabel Tambahan 1–3 sesuai dengan garis transgenik Ap­2, Ly­55, De­8, ApLy­47 dan ApLyDe­12 dan 
NT, kontrol non­transgenik dinormalisasi sehingga dapat membandingkan nilai yang diperoleh dalam unit dan skala yang 
berbeda. Normalisasi dicapai dengan menggunakan persamaan X
baru
. Level 
resistance dihitung sebagai 1 ­ X
baru.
= X – X
min
/ X
max
–Xmin
Menurut ini, nilai 
resistansi maksimum 1 dihitung untuk jalur tanaman transgenik ApLyDe­12 sedangkan nilai minimum (0) adalah hasil untuk 
tanaman kontrol NT. (b) Bagan kolom tiga dimensi yang dinormalisasi mewakili tingkat resistensi relatif dari garis transgenik 
yang dipilih untuk patogen bakteri dan jamur yang termasuk dalam pekerjaan ini, sebagaimana dicatat dalam uji infeksi yang 
berbeda. Erwinia: alat tes maserasi disk tuber; Streptomyces: uji infeksi tuber; Phytophthora: uji daun yang terlepas; Rhizoctonia:
uji daun yang terlepas; Fusarium: infeksi tuber assay. NT: kontrol non­transgenik.
dermaseptin memasok perlindungan antibakteri dan antijamur untuk berbagai patogen tanaman (Osusky et al., 2005). Empat
konstruksi genetik, mengandung AP24 osmotin, dermaseptin, lysozyme dan AP24 plus urutan pengkodean lysozyme digunakan
untuk mengubah eksplan tuber. Ekspresi simultan dari der­maseptin, lisozim dan AP24 dicapai dengan transformasi ulang garis
dermaseptin­diubah.   Strategi   transformasi   ulang   dipilih   alih­alih   transformasi   bersama   karena   memungkinkan   perbandingan
langsung tingkat dermaseptin antara transforman primer dan garis yang diubah kembali.
Kombinasi yang lebih efektif dari protein antimikroba, serta tingkat akumulasi yang sesuai, tidak dapat diprediksi secara a priori.
Karena tujuan utama kami adalah mengisolasi garis kentang yang menunjukkan resistensi simultan terhadap beberapa patogen,
kami mengadopsi skema seleksi berdasarkan kinerja tanaman yang ditransformasikan dalam kondisi infeksi yang ketat. Tujuh
puluh dua kandidat tanaman pembawa transgen tunggal atau kombinasi double dan triple­transgen disaring untuk ketahanan
terhadap E. carotovora menggunakan inokulum bakteri yang tinggi. Mereka yang menunjukkan tingkat resistensi yang lebih
tinggi untuk infeksi Erwinia dan fenotipe normal dipilih untuk karakterisasi rinci dan tambahan inokulasi dengan patogen
kentang lainnya. Dengan demikian, 19 garis yang menunjukkan resistensi yang kuat dipilih untuk pemeriksaan tambahan
(Tambahan Tabel 1). Seperti yang diharapkan dari laporan sebelumnya, garis yang menunjukkan akumulasi protein rekombinan
yang lebih tinggi menunjukkan tingkat resistensi yang lebih kuat. Garis yang berubah dengan kombinasi dua dan tiga­transgen
(garis ApLy­47 dan ApLyDe­12) berkinerja lebih baik terhadap infeksi bakteri, menunjukkan penurunan DI 65 dan 75% pada
infeksi seluruh tanaman (Gambar 4). Namun, beberapa baris yang menyatakan transgen individu (garis Ap­2, De­8 dan Ly­55)
juga menunjukkan level­level resistensi yang penting (pengurangan DI dari 40, 62 dan 57%, masing­masing). Hasil dari tes
infeksi lainnya (tuber maserasi, tubo sprouting terinfeksi, jumlah bakteri, penghambatan pertumbuhan bakteri dengan ekstrak
tumbuhan) mendukung kecenderungan yang diamati pada infeksi seluruh tanaman. Di sisi lain, serangkaian tes infeksi yang
dilakukan dengan scary S., menunjukkan pengurangan gejala tuber scab hingga 80% (Gambar. 5a dan Tambahan Tabel 2).
Hebatnya, sementara aktivitas lisozim mempengaruhi terutama bakteri Gram­negatif, itu juga efektif terhadap S. kudis ­ bakteri
Gram­positif ­ sebagaimana dibuktikan dalam tuber­infeksi dan penghambatan pertumbuhan tes dilakukan dengan garis Ly­55.
Kontribusi relatif dari masing­masing protein antibakteri terhadap E. resistensi karotovora diperkirakan dengan membandingkan
pengurangan DI dan MV tuber dalam jalur yang mengekspresikan jumlah protein transgenik yang sama. Dengan demikian,
perbandingan antara garis ApLyDe­12 dan De­8 menyarankan bahwa dermaseptin adalah kontributor individu utama terhadap
infeksi antibakteri. Perbandingan serupa antara garis
ApLy­47   dan   Ly­55   menunjukkan   kontribusi   lisozim   yang   besar   dan   kontribusi   kecil   AP24   terhadap   fenotip   resistensi.
Mendukung ini, tanaman yang secara individual mengekspresikan konstruksi AP24 berperilaku buruk terhadap infeksi Erwinia.
Pengamatan ini mengkonfirmasi pekerjaan sebelumnya yang menunjukkan tingkat perlindungan yang tinggi pada tanaman yang
diubah dengan urutan dermaseptin atau lisozim (Düring, 1993; Liu et al., 1994; Nakajima et al., 1997; Osusky et al., 2005).
Garis transgenik yang sama diuji dengan E. carotovora dan S. kudis yang diinokulasi dengan P. infestans, R. solani dan F.
solani, tiga jamur phy­ tophatogenic memprovokasi hilangnya kentang penting. Seperti yang ditemukan untuk infeksi bakteri,
garis­garis yang mengekspresikan kombinasi double dan triple­transgene dilakukan lebih baik daripada yang mengekspresikan
protein individu. Detached­leaf assays dengan garis­garis yang mengekspresikan urutan AP24 menunjukkan tingkat resistensi
yang lebih tinggi terhadap P. infestans dan R. solani, mencapai pengurangan lesi hingga 90% (Tambahan Tabel 2 dan Gambar. 6f
dan 7a). Efek yang sebanding terlihat dalam tes infeksi tuber yang dilakukan dengan F. solani (Tambahan Tabel 2 dan Gambar
7b).   Secara   khusus,   aktivitas   antijamur   yang   kuat   dibuktikan   sejalan   Ap­2.   Hasil   ini   menguatkan   laporan   awal   yang
menggambarkan aktivitas AP24 sebagai antijamur dominan (Liu et al., 1994; Yun et al., 1998).
Perlu dicatat bahwa ketahanan transgenik terhadap patogen yang berbeda dapat sangat dipengaruhi oleh latar belakang genetik
dari kultivar orangtua (Arbogast et al., 1999; Ryan et al., 2004). Dalam kasus Spunta, sebagian besar laporan mengkategorikan
kultivar ini sebagai rentan terhadap E. carotovora, dan R. solani dan sebagai cukup toleran terhadap S. sca­ bies, P. infestans dan
Fusarium spp. Implementasi strategi transgenik yang diadopsi di sini pada kultivar kentang lainnya harus mempertimbangkan
respon spesifik mereka terhadap patogen kentang yang paling penting.
Karena   kombinasi   triple­transgen   yang   digunakan   dalam   pekerjaan   ini   memberikan   perlindungan   terhadap   lima   patogen
kentang yang berbeda, dapat dibayangkan bahwa pengaturan transgen yang sama juga akan efektif terhadap patogen bakteri dan
jamur lain yang mempengaruhi tanaman ini. Di sisi lain, hasil yang diperoleh dalam pekerjaan ini tidak dapat secara langsung
diekstrapolasikan   ke   kondisi   pertanian   yang   sebenarnya,   di   mana   kombinasi   beberapa   biotik   dan   abiotik   efektor   dapat
menghasilkan berbagai hasil yang tidak terduga. Dengan mempertimbangkan hal ini, bukti­bukti yang disajikan di sini harus
didukung lebih lanjut dengan melakukan uji coba lapangan dalam konteks agro­ekosistem dan manajemen yang berbeda.

Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada Dr. J. Calcagno atas saran ahlinya dalam perawatan statistik. Pekerjaan ini sebagian didukung
oleh hibah PICT 08­ 06801 dari Badan Nasional untuk Promosi Sains dan
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba di tanaman transgenik kentang 
memberikan peningkatan resistensi untuk bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE G Model BIOTEC­5919; Jumlah Halaman 10

DALAM PRESS
10 M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx­ xxx
Teknologi Argentina dan hibah perjanjian penelitian antara Goyaike SA dan Fundación Ciencias Exactas y Naturales. AM dan
FBA adalah Peneliti Penelitian dari CONICET (Argentina). NF dan EL adalah rekan dari ANPCyT (Argentina) dan CONICET,
masing­masing. MR dan PP mengajar asisten di FCEN­UBA.

Lampiran A. Data tambahan Data
tambahan yang terkait dengan artikel ini dapat ditemukan, dalam versi online, di doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.11.005.

Referensi
Abad, LR, D'Urzo, MP, Liu, D., Narasimhan, ML, Reuveni, M., Zhu, JK, Niu, X., Singh, NK, Hasegawa, PM, Bressan, RA, 
1996. Aktivitas antijamur tembakau osmotin memiliki spesifitas dan melibatkan permeabilisasi membran plasma. Menanam sci. 
118, 11–23. Alan, AR, Blower, A., Earle, ED, 2004. Ekspresi gen peptida antimikroba tipe­magainin (MSI­99) dalam tomat 
meningkatkan ketahanan terhadap penyakit bercak bakteri. Plant Cell Rep. 22, 388­396. Arbogast, M., Powelson, ML, Cappaert, 
MR, Watrud, LS, 1999. Respon enam kultivar kentang terhadap jumlah air yang digunakan dan Verticillium dahliae. Fitopatologi
89, 782­788. Arce, P., Moreno, M., Gutierrez, M., Gebauer, M., Dell'Orto, P., Torres, H., Acu na, I., Oliger, P., Venegas, A., 
Jordana, X., Kalazich, J., Holuigue, L., 1999. Resistensi ditingkatkan untuk infeksi bakteri oleh Erwinia carotovora subsp. 
atroseptica pada tanaman kentang transgenik yang mengekspresikan attacin atau cecropin SB­37 gen. Saya. J. Potato Res. 76, 
169–177. Bradford, MM, 1976. Metode cepat dan sensitif untuk kuantifikasi jumlah mikro protein menggunakan prinsip 
pengikatan protein­dye. Anal. Biochem. 72, 248–254. Campbell, MA, Fitzgerald, HA, Ronald, PC, 2002. Ketahanan patogen
pada tanaman tanaman. Res Transgenik. 11, 599–613. Chakrabarti, A., Ganapathi, TR, Mukherjee, PK, Bapat, VA, 2003. 
MSI­99, analog magneinin, menanamkan ketahanan terhadap penyakit yang meningkat pada tembakau dan pisang transgenik. 
Planta 216, 587–596. Datta, K., Baisakh, N., Maung Thet, K., Tu, J., Datta, S., 2002. Piramida transgen untuk resistensi ganda 
dalam beras terhadap penyakit bakteri, penggerek batang kuning dan penyakit hawar. Theor. Appl. Genet. 106, 1–8. Dellaporta, 
SL, Wood, J., Hicks, JB, 1983. Sebuah minipreparation DNA tanaman: versi II.
Tanam Mol. Biol. Rep. 1, 19–21. Douglas, R., Halpin, C., 2009. Gen menumpuk. Dalam: Jain, SM, Brar, DS (Eds.), Teknik 
Molekuler dalam Peningkatan Tanaman. Springer, Belanda, hal. 613–629. Düring, K., 1993. Dapatkah lysozymes memediasi 
resistensi antibakteri pada tanaman? Tanam
Mol. Biol. 23, 209–214. Erwin, DC, Ribeiro, OK, 1996. Penyakit Phytophthora Seluruh Dunia. American Phy­
topathological Society Press, St Paul, NN, USA. Gao, H., Tao, S., Wang, D., Zhang, C., Ma, X., Cheng, J., Zhou, Y., 2003. 
Perbandingan metode yang berbeda untuk menyiapkan DNA beruntai tunggal untuk oligonukleotida microarray. Anal. Lett. 36, 
2849–2863. Gerlach, W., Nirenberg, H., 1982. Genus Fusarium: atlas bergambar. Sarung tangan. Biol.
Bundesanst. Land­Furstwirstsch. Berlin­Dahlen 209, 1–406. Halpin, C., 2005. Gen menumpuk di tanaman transgenik ­ 
tantangan untukabad ke­21
bioteknologi tanaman. Tanam Biotechnol. J. 3, 141–155. Hanke, V., Düring, K., Norelli, JL, Aldwinckle, HS, 1999. 
Transformasi kultivar apel dengan gen T4­lysozyme untuk meningkatkan ketahanan terhadap penyakit. Acta Hortic. 489, 253–
256. Herrmann, M., Zocher, R., Haese, A., 1996. Pengaruh gangguan gen sintase enniatin pada virulensi Fusarium avenaceum. 
Mol. Plant Microbe Int. 9, 226–232. Höltje, JV, 1996. substrat lisozim. Dalam: Jollès, P. (Ed.), Lysozymes: Model Enzim dalam 
Biokimia dan Biologi. Birkhäuser Verlag, Basel­Boston­Berlin, hal. 105–110. Jha, S., Chattoo, BB, 2009. Transgene 
penumpukan dan ekspresi terkoordinasitanaman
defensinmemberi resistensi jamur pada nasi. Beras 2, 143–154. Kato, A., Nakamura, S., Ibrahim, H., Matsumi, T., 
Tsumiyama, C., Kato, M., 1998. Produksi lisozim yang dimodifikasi secara genetik memiliki stabilitas panas yang ekstrim dan 
aktivitas antimikroba terhadap bakteri Gram negatif dalam ragi dan tumbuhan. Mol. Nutr. Res makanan. 42, 128–130. Keinath, 
AP, Loria, R., 1991. Pengaruh kepadatan inokulum dan resistensi kultivar pada keropeng kentang dan dinamika populasi 
Streptomyces scabies. Saya. J. Potato Res. 68, 515–524. Labruyere, RE, 1971. Keropeng Umum dan Kontrolnya pada Tanaman 
Benih­kentang. Pusat Penerbitan dan Dokumentasi Pertanian, Wageningen, Belanda. Lapwood, DH, Baca, PJ, Spokes, J., 1984. 
Metode untuk menilai kerentanan kentang umbi dari kultivar yang berbeda untuk membusuk oleh Erwinia carotovora subspesies 
atroseptica dan carotovora. Plant Pathol. 33, 13–20.
Lebecka, R., Zimnoch­Guzowska, E., Lojkowska, E., 2006. Penyakit bakteri. Dalam: Gopal, J., Khurana, SMP (Eds.), Handbook 
of Potato Production, Improvement and Pascapanen Manajemen. The Haworth Press, Binghamton, NY, AS, hal. 359–386. Lee, 
YP, Kim, SH, Bang, JW, Lee, HS, Kwak, SS, Kwon, SY, 2007. Meningkatkan toleransi terhadap stres oksidatif pada tanaman 
tembakau transgenik yang mengekspresikan tiga enzim antioksidan dalam kloroplas. Plant Cell Rep. 26, 591­598. Liu, D., 
Raghothama, KG, Hasegawa, PM, Bressan, RA, 1994. Osmotin overexpresion dalam kentang menunda perkembangan gejala 
penyakit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1888–1892. López, A., Zaldúa, Z., Pimentel, E., García, M., García, R., Mena, J., 
Morán, R., Selman, G., 1996. Modificación del gen de la esporamina de boniato con un fragmento de DAN sintético, Secuencia 
nucleotídica y expresión en Escherichia coli. Biotecnol. Apl. 13, 265­270. Melchers, LS, Stuiver, MH, 2000. Gen baru untuk 
penangkaran penyakit­resistensi. Curr.
Opin. Biol tanaman. 3, 147–152. Mourgues, F., Brisset, MN, Chevreau, E., 1998. Strategi untuk meningkatkan ketahanan 
tanaman terhadap penyakit bakteri melalui rekayasa genetika. Tren Biotechnol. 16, 203­210. Nakajima, H., Muranaka, T., Ishige,
F., Akutsu, K., Oeda, K., 1997. Resistensi penyakit jamur dan bakteri pada tanaman transgenik yang mengekspresikan lisozim 
manusia. Plant Cell Rep. 16, 674–679. Osusky, M., Osuska, L., Kay, W., Misra, S., 2005. Modifikasi genetik kentang terhadap 
penyakit mikroba: in vitro dan aktivitas planta derivatif B1 dermaseptin, MsrA2. Theor. Appl. Genet. 111, 711–722. Ouyang, B., 
Chen, YH, Li, HX, Qian, CJ, Huang, SL, Ye, ZB, 2005. Transformasi tomat dengan gen osmotin dan chitinase dan ketahanan 
mereka terhadap layu Fusarium. J. Hortik. Sci. Biotechnol. 80, 517–522. Pérombelon, MCM, 2002. Penyakit kentang yang 
disebabkan oleh erwinias busuk lunak: ikhtisar
patogenesis. Plant Pathol. 51, 1–12. Platt, HW, Petters, RD, 2006. Penyakit jamur dan oomycete. Dalam: Gopal, J., Khurana, 
SMP (Eds.), Handbook of Potato Production, Improvement and Pascapanen Manajemen. The Haworth Press, Binghamton, NY, 
AS, hal. 315–358. Qi, B., Fraser, T., Mugford, S., Dobson, G., Sayanova, O., Butler, J., Napier, JA, Stobart, AK, Lazarus, CM, 
2004. Produksi rantai panjang tak jenuh ganda asam lemak omega­3 dan omega­6 pada tumbuhan. Nat. Biotechnol. 22, 739–745. 
Roberts, WK, Selitrennikoff, CP, 1988. Chitinase tanaman dan bakteri berbeda dalam
aktivitas antijamur. J. Gen. Microbiol. 134, 169–176. Romano, A., Raemakers, K., Bernardi, J., Visser, R., Mooibroek, H., 
2003. Organisasi transgenik dalam kentang setelah transformasi bombardment­mediated (co­) menggunakan plasmid dan kaset 
gen. Res Transgenik. 12, 461–473. Ryan, AD, Kinkel, LL, Schottel, JL, 2004. Pengaruh isolat patogen, kultivar kentang, dan 
strain antagonis pada keparahan keropeng kentang dan kontrol biologis. Biocontrol Sci. Technol. 14, 301–311. Schaad, NW, 
Jones, JB, Chun, W., 2001. Panduan laboratorium untuk identifikasi bakteri patogen tanaman, ed ketiga. APS Press, The 
American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, USA. Selitrennikoff, CP, 2001. Protein antijamur. Appl. Env. 
Mikrobiol. 67, 2883–2894. Serrano, C., Arce­Johnson, P., Torres, H., Gebauer, M., Gutiérrez, M., Moreno, M., Jor­ dana, X., 
Venegas, A., Kalazich, J., Holuigue , L., 2000. Ekspresi gen lisozim ayam di kentang meningkatkan resistensi terhadap infeksi 
oleh Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Saya. J. Potato Res. 77, 191–194. Shah, DM, 1997. Rekayasa genetika untuk penyakit
jamur dan bakteri. Curr. Opin.
Biotechnol. 8, 208–214. Singh, NK, Bracker, CA, Hasegawa, PM, Handa, AK, Buckel, S., Hermodson, MA, Pfankoch, E., 
Regnier, FE, Bressan, RA, 1987. Karakterisasi osmotin: protein seperti thaumatin yang terkait dengan adaptasi osmotik di sel 
tumbuhan. Plant Physiol. 85, 529–536. Sneh, B., Burpee, L., Ogoshi, A., 1991. Kunci Cytomorphical ke Rhizoctonia spp. 
Identifikasi spesies Rhizoctonia. APS Press, The American Phytopathological Society, NY, USA, hlm. 39–42. Stevenson, WR, 
Loria, R., Franc, GD, Weingartner, DP, 2001. Kompendium
Penyakit Kentang, edisi kedua. APS Press, NY, USA. Stiekema, WJ, Heidekamp, F., Louwerse, JD, Verhoeven, HA, 
Dijkhuis, P., 1988. Pengenalan gen asing ke dalam kultivar kentang Bintje dan Désirée menggunakan vektor biner 
Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 7, 47–50. Termorshuizen, AJ, 2007. Patogen jamur dan jamur seperti kentang. 
Dalam: Vreugdenfield, D. (Ed.), Biologi Kentang dan Bioteknologi: Kemajuan dan Perspektif. Elsevier, Belanda, hal. 643–650. 
Yaron, S., Rydlo, T., Shachar, D., Mor, A., 2003. Aktivitas dermaseptin K
4
­4 terhadap patogen bawaan makanan. Peptida 24, 1815–1821. Yeaman,
MR, Yount, NY, 2003. Mekanisme aksi danpeptida antimikroba
resistensi. Pharmacol. Pny. 55, 27–55. Yun, DJ, Ibeas, JI, Lee, H., Coca, MA, Narasimhan, ML, Uesono, Y., Hasegawa, PM, 
Pardo, JM, Bressan, RA, 1998. Osmotin, protein antijamur tanaman, transduksi sinyal subvert untuk meningkatkan kerentanan 
sel jamur. Mol. Sel 1, 807–812. Zasloff, M., 2002. Peptida antimikroba organisme multisel. Nature 415,
389–395.
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang 
memberikan peningkatan resistensi terhadap bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / 
j.jbiotec.2011.11.005

You might also like