Professional Documents
Culture Documents
Model
BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxxxxx
daftar Isitersedia di SciVerse ScienceDirect
Journal of Biotechnology
Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba di transgenik tanaman kentang
menganugerahkan peningkatan resistensi terhadap bakteri patogen dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
Penumpukan dari tanaman kentang transgenik di gen antimikroba menganugerahkan
Peningkatan ketahanan terhadap bakteri dan jamur patogen
Mercedes Riveroa, Nicolas Furmana, Nicolas Mencaccia, Pablo Piccac, Laila Toum sebuah, Ezequiel
Lentzb, Fernando BravoAlmonacid b, Alejandro Mentaberry sebuah, *
Laboratorium Agrobiotecnología, Departemen Fisiologi, Biologi Molekuler dan Seluler, Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Buenos Aires. Av. Intendant Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina b INGEBI
CONICET, Vuelta de Obligado 2490, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina c Sistematika Laboratorium Vaskular Tanaman,
Departemen Keanekaragaman Hayati dan Biologi Eksperimental, Fakultas Ilmu Exact alam, Universidad de Buenos Aires. Av
Walikota Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentinasejarah
articleinfo
.Pasal Diterima 13 Juni 2011 Diterima dalam bentuk direvisi 7 Oktober 2011 Diterima 4 November 2011 Tersediaxxx secara
Kata kuncionline:Transgenik Potato Resistance AP24 osmotine lisozim Dermaseptin Erwinia carotovora Streptomyces scabies
Phytophthora infestans Fusarium solani Rhizoctoniasolani
abstrak
tanaman tuberosum SolanumApakah Berubah dengan tiga konstruksi genetik tiana tabacum mengungkapkan osmotine AP24
Nico, Phyllomedusa sauvagii dermaseptin dan Gallus gallus lisozim, dan dengan doubletransgen mengungkapkan pembangunan
AP24 dan urutan lisozim. Retransformasi tanaman dermaseptinBerubah Dengan pemilihan AP24 / lisozim tanaman
diperbolehkan konstruksi simul simultan mengungkapkan tiga transgen. garis kentang mengekspresikan transgentransgen
kombinasi tunggal atau ganda dan tiga diuji untuk ketahanan terhadap Erwinia carotovora menggunakan seluruh tanaman dan tes
infeksi umbi. tingkat resistensi untuk infeksi Kedua tes konsisten untuk PALING garis kentang Dibandingkan dan seleksi
diperbolehkan fenotipe sangat tahan. Adalah tingkat resistensi yang lebih tinggi ditemukan di garis membawa dermaseptin dan
lisozim urutan, menunjukkan Bahwa protein adalah tesis utama tributors con untuk aktivitas antibakteri. Hasil yang sama
diperoleh dalam tes infeksi umbi Dilakukan Dengan Streptomyces scabies. baris tanaman yang menunjukkan resistensi yang
lebih tinggi terhadap infeksi bakteri Apakah Tertantang Dengan Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani dan Fusarium solani.
tingkat signifikan resistensi terhadap masingmasing patogen ini Were semikuantitatif dibuktikan Mempekerjakan tes berbasis di
terpisah dauninokulasi, penghambatan pertumbuhan jamur dan inokulasi tanaman vitro. Atas dasar hasil ini, kami mengusulkan
susun transgen ini Itu adalah pendekatan yang menjanjikan untuk Mencapai resistensi terhadap bakteri patogen dan jamur Kedua.
© 2011 Elsevierundang.
1. Pendahuluan
Kentang Terkena banyak penyakit memproduksi kerugian ekonomi yang besar di seluruh dunia. bakteri patogen, seperti
Erwinia carotovora dan Streptomyces scabies, dan jamur patogen, seperti Phytophthora infestans, Fusarium solani dan
Rhizoctonia solani, sering terjadi di daerah produksi PALING dan memerlukan beberapa langkahlangkah pengendalian untuk
mengurangi kejadian mereka (Stevenson et al, 2001; Termorshuizen 2007 ). Erwinia adalah agen penyebab penipu dan lembut
busuk penyakit, masingmasing Melibatkan gejala parah pada daun dan umbi jaringan (Pérombelon, 2002). Streptomyces,
meskipun tidak serius Mempengaruhi hasil, Anda menghasilkan lesi umbi keropeng sig nificantly Kurangi Itu jual kentang. Di
antara patogen jamur, P. infestans menghasilkan gejala yang sangat merusak Mempengaruhi daun, batang dan umbiumbian
(Erwin dan Ribeiro, 1996), sedangkan F. solani dan R.
Sesuai penulis. Telp:. +54 11 4756 3300x448. alamat Email: mrivero@fbmc.fcen.uba.ar, riveromer@gmail.com (M. Rivero),
amentaberry@fbmc.fcen.uba.ar (A. Mentaberry).
solani diinduksi stolon dan umbi penyakit yang menyebabkan kecambah kematian, pengembangan tanaman miskin, dan
mengurangi jumlah umbi dan ukuran (Gerlach dan Nirenberg, 1982; Sneh et al, 1991). Sedangkan kontrol bakteri saat ini terbatas
pada prosedur profilaksis, penggunaan umbi bibit Termasuk tified cer, Meminimalkan umbi memar dan disinfeksi sebelumnya
untuk penyimpanan, manajemen jamur Mengandalkan terutama padapraktekpraktek budaya dan ekstensif menggunakan
fungisida (Platt dan Petters, 2006; Lebecka et al., 2006). Fungisida Memberikan gelar cukup perlindungan, tetapi aplikasi mereka
masuk biaya produksi yang lebih tinggi, dapat menginduksi resistensi jamur, dan ronmental gus Melibatkan Peningkatan Risiko.
resistensi genetik terhadap penyakit bakteri dan jamur telahsulit karena Melaksanakan kelangkaan gen Alam R dan waktu
yang lama Terlibat dalam pemuliaan kentang. Strategi dieksplorasi untuk menghasilkan resistensi oleh Sarana Pendekatan
Rekayasa Genetika mencakup langkahlangkah yang berbeda dari tuan Mempengaruhipatogen interaksi, memunculkan
dariseperti respon pertahanan tanaman, penghambatan faktor virulensi bakteri atau jamur dan ekspresi pon com antimikroba dari
tanaman dan nontanaman asal (Shah, 1997; Mourgues et al, 1998; Melchers dan kelip, 2000; Osusky et al, 2005). Meskipun
01681656 / $ melihat hal depan © 2011 Elsevierundang. doi: 10,1016 / j.jbiotec.2011.11.005
jou rn ke epage hom: www.elsevier.com/locate/jbiotec
PASAL G Model Biotec5919; Jumlah Halaman 10
DI PRESS
2M Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxxxxx
perlindungan yang signifikanTelah Diperoleh di sejumlah kasus, resistensi simultan ke berbagai patogen telahpernah ficult dif
untuk mencapai. Salah satu cara yang mungkin untuk mencapai tujuan esta adalah piramida dari transgen encoding antibakteri
dan antikegiatan jamur melengkapi gal (Campbell et al, 2002; Datta et al, 2002; Douglas dan Halpin, 2009). strategi transformasi
beragam digunakan untuk gen Telah susun, silang konvensional ing Termasuk seksual, retransformasi, cotransformasi dan
transformasi Dengan transgen terkait (Qi et al, 2004; Halpin, 2005; Lee et al, 2007; Jha dan Chattoo, 2009). Setiap Pendekatan
ini menyajikan kelebihan dan keterbatasan harus hatihati Dianggap Itu MENURUT modus reproduksi dari tanaman dan Tujuan
diproyeksikan.
peptida antimikroba kationik (CAP) yang hadir di alam luas dan Memberikan awal, penghalang pertahanan nonspesifik terhadap
bakteri, jamur dan protozoa. Beberapa ratus CAP char acterized Telah pada organisme Termasuk serangga, krustasea, mamalia
dan tanaman (Zasloff, 2002). Model untuk Jelaskan aktivitas dalil mereka paraf interaksi antara muatan positif di domain
hidrofilik CAP dan muatan negatif pada komponen struktural membran bakteri, diikuti oleh pembentukan pori, fisik dan / atau
gangguan membran fungsional dan lisis sel berikutnya (Yeaman dan Yount 2003 ). CAP diklasifikasikan menjadi Biasanya
Termasuk Mereka peptida helical dermaseptins Seperti, cecropins dan inins Mage dan sheet Termasuk Mereka peptida
defensin Seperti, dan tachyplesins protegrins. Transformasi dari urutan spesies tanaman encoding Dengan CAP dan Analog
mereka mempertimbangkan penggunaan tingkat mampu perlawanan diberikan ke banyak mikroorganisme fitopatogenik (Arce et
al, 1999; Chakrabarti et al, 2003; Alan et al, 2004). maseptins Der adalah CAP asam amino 2834 terisolasi dari katak dari genus
Phyllomedusa menunjukkan aktivitas in vitro terhadap bakteri, jamur protozoa mentous barisdan ragi. Berubah tanaman kentang
Dengan analog dermaseptin MsrA2 pameran luas jangkauan ketahanan terhadap jamur fitopatogenik, Termasuk Cercospora,
Fusarium dan Pythium (Osusky et al., 2005).
Lysozymes menghidrolisis asam Nasetildmuramic: Nacetyl linkage Dglukosamin dari peptidoglikan, AKIBAT degradasi
parsial dinding sel bakteri dan lisis bakteri (Höltje, 1996). Enzim Milik keluarga ini terisolasi dari sumber yang berbeda Memiliki
Berkunjung dan kegiatan lisozimseperti yang juga hadir dalam vakuola dari Beberapa spesies tanaman lar cellu. akumulasi
konstitutif lisozim eksogen dalam ruang apoplasmic dapat menjadi penghalang efektif untuk menangkap serangan Kedua
necrotrophic dan biotrophic teria bac. Hen putih telur lisozim di transgenik akumulasi tanaman kentang pertumbuhan Jauh
menghambat spesies bakteri Beberapa, E. carotovora Termasuk dan Pseudomonas syringae (Kato et al., 1998). Demikian pula,
ekspresi T4 dan lisozim manusia dalam tembakau dan kentang tanaman Menghasilkan E. carotovora resistensi parsial untuk P.
syringae dan (selama, 1993; Serrano et al, 2000), dan ekspresi dari T4 lisozim di kultivar apel yang disediakan resistensi yang
signifikan untuk tion terinfeksi oleh E. amylovora (Hanke et al., 1999). Di samping, ekspresi lisozim manusia dalam tanaman
terhambat tembakau pertumbuhan jamur, gesting nyarankan untuk memungkinkan pemanfaatan untuk tanaman lain patogen
Control (Nakajima et al., 1997).
AP24 adalah terkait patogenesis protein taumatinseperti yang merupakan milik keluarga PR5 Yang awal Ditandai sebagai
protein anti jamur (Abad et al., 1996). AP24 menginduksi lisis sel dengan mekanisme Melibatkan pembentukan pori dan disipasi
potensial membran (Selitrennikoff, 2001). tanaman kentang mengungkapkan AP24 transgen menunjukkan peningkatan resistensi
terhadap P. infestans (Liu et al., 1994) dan tanaman tomat Berubah tembakau Dengan transgen AP24 dan kacang kitinase
Menunjukkan peningkatan daya tahan terhadap Fusarium oxysporum (Ouyang et al., 2005).
Tiga protein antimikroba Termasuk dalam pekerjaan penelitian ini Apakah dipilih berdasarkan risiko rendah diduga mereka
untuk konsumsi manusia. Hen lisozim putih telur adalah salah satu enzim protein lebih sively memperpanjang Belajar de este
keluarga dan itu sudah
hadir dalam banyak komponen bahan makanan. Tembakau AP24 adalah homolog protein respon pertahanan Yang Telah
Counterpart pada tanaman yang dapat dimakan dan saham homologi urutan signifikan Dengan taumatin, ral natu untuk diterima
sebagai agen pemanis penyedap aman di Beberapa negara (Singh et al., 1987). Di samping, seperti peptida lainnya antimi crobial
Hewan yang diturunkan, turunan dermaseptin Telah diusulkan berpotensi sebagai makanan tambahan untuk Pengendalian
mikroorganisme resisten (Yaron et al., 2003).
Dalam tulisan ini, kami melaporkan tingkat resistensi tinggi untuk E. carotovora dan S. scabies di Solanum tuberosum
Beberapa baris Berubah Dengan konstruksi yang berbeda mengungkapkan dermaseptin, lisozim dan AP24 coding urutan. Garis
menunjukkan resistensi terhadap bac teria lebih tinggi Juga Menunjukkan Peningkatan resistensi terhadap infeksi infestans P.
Dengan, R. solani dan F. solani, menunjukkan ekspresi gabungan Itu ini transgen antimikroba Bisa menjadi pendekatan yang
cocok untuk Mendapatkan stabil, luas jangkauan perlindungan terhadap berbagai jenis bakteri patogen kentang.
2. Bahan dan metode
2.1. genetik
2.2. bahan tanaman dan transformasi kentang
S. tuberosum Bersertifikat (cv. Spunta) minitubers digunakan sebagai bahan awal Were untuk perbanyakan tanaman dan
transformasi prosedurprosedur. Transformasi minituber itu Dilakukan cakram seperti yang dijelaskan oleh Stiekema et al. (1988)
cobudidaya menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 Dengan. Menurut penanda selektif digunakan dalam
transformasi tor, eksplan Apakah Ditransfer ke media regenerasi Dilengkapi Dengan 10 mg / L higromisin, 50 mg / L kanamisin
dan / atau 1,5 mg / L glufosinate. tanaman Tripletransgenik Apakah Diperoleh ulang transformasi garis mengekspresikan
dermaseptin (De8) Dengan pembangunan pApLy. Tanaman berkembang di media selektif Apakah Dikalikan ditions con di
aseptik selama 2 bulan, Ditransfer ke tanah dan tumbuh selama 34 bulan dalam ruang pertumbuhan pada 20 di bawah 16 h ◦C
penyinaran. bers Minitu 24 cm dengan diameter dan disimpan pada Apakah dipanen 4 ◦C, 100%
Silahkan mengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba pada tanaman kentang
transgenik menganugerahkan Peningkatan ketahanan terhadap bakteri patogen dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
PASAL Biotec Model G5919; Jumlah Halaman 10
DI PRESS
M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx 3
kelembaban relatif. tanaman T0 transgenik digunakan dalam tes infeksi Apakah Dikalikan agamically dan disimpan di bawah
seleksi untuk 34 tahun secutive con.
2.3. strain bakteri dan jamur
dari E. carotovora ketegangan ECAT spp. atroseptica baik yang disediakan oleh Dr J. Kalazich (INIARemehue, Chili). S.
kudis dan F. solani yang diisolasi dari berpenyakit Apakah umbi kentang prosedurprosedur MENURUT standar (Schaad et al.,
2001) R. solani dan P. infestans strain Apakah Diperoleh dari Dr. C. Rovere (INTACastelar, Argentina).
2.4. Southern analisis blot
DNA genom dari daun kentang transgenik diisolasi menggunakan protokol CTABekstraksi (Dellaporta et al., 1983). aliquots
lima g endonuklease restriksi Apakah dicerna Dengan XbaI, EcoRV dan BamHI, dielektroforesis dalam 0,8% gel agarose dan
ditransferuntuk membran Nylon. Fragmen Sesuai dengan gen trans berbeda Apakah probe cDNA tertentu hibridisasi
Denganberlabel Dengan
32 P dCTPdan terdeteksi oleh autoradiografi.
2.5. Persiapan ekstrak daun dan protein kuantifikasi
Lima g jaringan daun beku Apakah tanah dalam nitrogen cair dan Ditransfer ke wadah tabung berisi dingin (4 ◦C) TCA di
10% aseton ditambah 0,07% mercaptoethanol. Setelah sampel vortexing pra cipitated pada 20 Apakah ◦C selama 45 menit dan
kemudian disentrifugasi pada 14.000 g selama 15 menit pada 4 ° C. Supernatan dibuang dan membiarkan pel dicuci Dengan pra
dingin 90% aseton kontainer yang mengandung 0,07% ßmercaptoethanol. Setelah sentrifugasi pada 4 sampai ◦C baru, 14.000 g
selama 15 menit pelet dicuci tiga kali dan kembali ditangguhkan dalam aseton dan berputar di 14.000 g selama 5 menit pada 4 °
C. Akhirakhir ini Tein pelet pro adalah udara kering dalam kap aliran laminar dan disimpan pada suhu 20 ° C. Penentuan total
protein terlarut selesai spec trophotometrically MENURUT Bradford (1976) Dengan BSA sebagai standar. AP24, dermaseptin
dan lisozim konsentrasi yang diekstrapolasi dari kurva standar dalam immunoblots Barat. Sam prinsip keuangan dari tanaman
transgenik dan standar Pengenceran Control dan dielektroforesis di SDSWere gel poliakrilamida, dan ditransferuntuk membran
nitroselulosa diinkubasi Dengan antibodi diangkat ke BSAterkonjugasi dermaseptin (1: 200), lisozim (1: 200) atau AP24 (1:
400) dan sekunder antibodi terkonjugasi dengan horseradish peroksidase antibodi. band tertentu Apakah terdeteksi oleh luminol /
H
Modifikasi. Setiap assay termasuk 15 cakram umbi yang berasal dari garis transgenik tunggal dan kontrol nonTransformed.
Volume maserasi (MV) dari cakram umbi Diinokulasi (10 L dari pensiun mempertahankan satu bakteri dari 2 × 105 cfu) telah
Estimasi oleh penggantian jaringan dimaserasi volume yang sama dengan air. Adalah esti dikawinkan titer bakteri dengan
menangguhkan jaringan dimaserasi dalam 20 L air steril dan melakukan plating pengenceran serial media nutrien agar pada. E.
carotovora penghambatan tes: Sekitar 500 mg daun segar tis menuntut dari planlet axenically tumbuh Apakah tanah dalam
cairan N
dan disentrifugasi pada 9000 g selama 15 menit pada 4 ° C.
Sembilan puluh lima natant super L Apakah dicampur dengan 1 × kemudian106 sel E. carotovora dan diinkubasi selama 2 jam
pada 22 ° C. Setelah 8.12 jam pada 28 ◦C untuk pemulihan di LB menengah setengah kekuatan, pertumbuhan bakteri
dikuantifikasi dengan pengukuran OD pada 550 nm.
E. carotovora tumbuh penghambatan tes: Freshly dipanen umbi dipotong kecilkecil Apakah kontainer yang berisi umbi mata
tunggal dan pradiobati dengan asam giberelat 1 mg / L untuk memecahkan dormansi umbi. Dua puluh buah dari setiap baris
transgenik dan non Berubah diinokulasi Kontrol Apakah E. carotovora dengan inokulum segar (1 x 106 cfu) dan ditanam di pot
campuran steril dalam kondisi yang terkendali. Umbi Tumbuh itu DITINJAU setelah 3 minggu. Tes Apakah berulang 3 kali.
S. tes infeksi scabies Tuber: Perlawanan yang dipantau berdasarkan Dijelaskan oleh prosedur Labruyere (1971). Apakah
Tanaman tumbuh sampai pengembangan yang lengkap (912 minggu) pada 20 ◦C Dengan irigasi infeksi bakteri minimal untuk
Promosikan. Baru dipanen dan umbiumbian DIBENTUK dievaluasi untuk penyakit menggunakan skala sewenangwenang (5
Gambar. Dan Tambahan Tabel 1). Terdiri Tes untuk syn gle acak kelompok tiga ulangan dari 10 sampai 15 tanaman Termasuk
dari setiap baris transgenik.
S. scabies penghambatan assay: Aktivitas antibakteri dari ekstrak tanaman bertekadMenurut Dilaporkan oleh protokol Keinath
dan Loria (1991). Diukur oleh pertumbuhan bakteri adalah pada 600 pengukuran OD nm setelah pemulihan semalam di 24 LB ◦C
menengah.
2.7. tes infeksi jamur
P. infestans tes keseluruhantanaman: In vitro tes keseluruhantanaman aseptik ditanam di Were Dilakukan 34 plantlet minggu
tua. Blok agar (1 cm2) membawa P. infestans miselium itu Ditempatkan 2 cm dari batang. pengembangan gejala tercatat setiap
hari dan tanaman Apakah Mencetak untuk ketahanan terhadap pengembangan MENURUT sedang atau berat Entah kanker gejala
(daun bercak gelap, batang coklat dan runtuhnya tanaman). NonBerubah tanaman Kontrol Biasanya O
reaksi. Chemiluminescence terdeteksi pada
runtuh setelah film radiografi dan 35 dpi
dikuantifikasi Band intensitasMempekerjakan
F. solani Tubertes infeksi: Tes dilakukan dengan
menggunakan program ImageJ dan dimaksud untuk total protein larut. Antibodi
untuk modifikasi prosedur Dijelaskan oleh Herrmann
et al. untuk dermaseptin dan lisozim Apakah Diperoleh kelinci immuniza
(1996) dan Osusky et al. (2005). berat segar setiap tion
minituber menggunakan dermaseptin BSAterkonjugasi (GL Biochem) dandimurnikan
pada awalDitentukan dari assay dan pada 72 jam
setelah inokulasi ayam lisozim (Sigma) sebagai antigen. Antibodi untuk AP24 Apakah
lation Dengan 20 l dari 1 × 108 konidia untuk suspensi
/ ml. Pada saat ini, dengan lembut disediakan oleh Dr. Rovere (INTA, Castelar, Argentina).
Adalah minitubers dipotong secara longitudinal. Volume jaringan nekrotik adalah menghitung volume Perkiraan oleh rongga
silinder 2,6. Infeksi bakterites
setelah penghapusandibuat Umbi nekrotik dan mati Disebabkan oleh jaringan infeksi jamur. Tes termasuk per baris dan 25 umbi
E. carotovora Were keseluruhantanaman tes infeksi: Perlawanan itu dilakukan adalah evaluasi
tiga kali berulang. MENURUT prosedur diciptakan
Dijelaskan oleh Arce et al. (1999). Setiap
infestans P. dan R. solani terpisah assays daun:
Terpisahdaun assay infeksi termasuk 20 klonal yang berasal dari Individu ke syn
tes infeksi Apakah dilakukan seperti yang dijelaskan
oleh Osusky et al. Acara gle transgenik dan jumlah setara nonBerubah
(2005). Tanaman yang digunakan dalam tes ini
Apakah tumbuh selama 3 minggu pada 20 kontrol ° C. Dilakukan inokulasi menyuntikkan 10 L dari bakteri
h penyinaran di bawah 16. Setiap blok eksperimental
Terdiri 10 suspensi (6 × 107 cfu) di tunas basal ketiak. Gejala opment
sepenuhnya diperluas daunukuran yang sama dan
kondisi fisiologis ngunan itu Dipantau pada 5, 10, 15 dan 30 hari pascainfeksi
sampel dari 15 sampai 20 tanaman tunggal Mewakili
trans tunggal (dpi) dan diukur sewenangwenang MENURUT Indeks penyakit (DI;
jalur genic atau Daun nonBerubah Kontrol Apakah
terpisah Gambar5.). uji pendahuluan Apakah sampai 5 kali Diulang selama PALING
Segera sebelum inokulasi jamur. Untuk R. inokulasi
solani, garis transgenik.
cakram miselium (0,5 cm diameter) di Apakah
Ditempatkan E. carotovora kiri umbi disc tes maserasi atas: Tes Apakahcon
industridari setiap daun. Untuk P. infestans inokulasi,
suspensi con menyalurkan seperti yang dijelaskan oleh Lapwood et al. Denganminor(1984)
taining2 x 104 sporangia terlihat di setiap permukaan daun setelah
Harapmengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba pada tanaman kentang transgenik
menganugerahkan Peningkatan ketahanan terhadap patogen jamur dan bakteri . J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
PASAL Biotec Model G5919; Jumlah Halaman 10
DI PRESS
4 M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx
melukai dengan jarum steril. daun nonterinfeksi dari trans genic dan kontrol tanaman Apakah termasuk sebagai kontrol negatif.
Apakah Daun dibuang ke dalam wadah tertutup dan diinkubasi dalam gelap pada 24 ◦C selama 45 hari. Apakah Daun Hewlett
Packard telah dipindai menggunakan Scanjet G3110 untuk. Daun gambar diuraikan Apakah Dengan Photoshop 6.0 (Adobe
Systems) dan Analisa Dengan Matrox Inspektur 8,0 (Matrox Sistem Elektronik) untuk mengukur daerah lesi nekrotik. Total luas
daun ditentukanmenggunakan Wilayah alat Kepentingan gram pro sama dan melakukan "gumpalan" analisis. daun individu
sebagai nilainilai Apakah yang dimaksud daripersentase total luas daun (persentase daerah nekrotik;% NA) dan digunakan untuk
menghitung nilai ratarata untuk setiap baris kentang.
R. solani dan F. pertumbuhan solani penghambatan tes: hambatan pertumbuhan jamur tercatat menggunakan uji difusi
Dilansir Roberts dan Selitrennikoff (1988). Sebuah plug agar kecil (1 cm2) dari wadah masingmasing mengandung spesies
miselium jamur itu Ditempatkan di tengah cawan Petri Mengandung Potato Dextrose Agar menengah dan diinkubasi selama 48
jam pada 2224 ◦C untuk memungkinkan spora dan pertumbuhan hifa. Kemudian, cakram saring steril radial Apakah
Ditempatkan pada permukaan agaragar dan dimuat Dengan 200 L dari ekstrak tumbuhan. Ekstrak dari tanaman nonBerubah
Apakah dimasukkan sebagai kontrol negatif. cawan Petri Apakah diinkubasi selama 57 hari pada 24 ◦C dan pertumbuhan jamur
tercatat di Time ini.
2.8. Mikroskopispengamatan
potonganLesi dari Sekitar 25 mm2 Apakah sampel dari cakram umbi Diinokulasi Dengan E. carotovora pada 24, 48 dan 72
jam pasca inokulasi. Spesimen Apakah tetap dan dehidrasi, titik kritis kering, dipasang di bertopik aluminium, metalisasi dengan
emas oleh ion menggerutucoating (SCD 030, Balzers) dan Diperiksa oleh JSMII scan ning mikroskop elektron (JEOL) pada 15
kV. sampel umbi Diinokulasi Dengan S. scabies diamati di bawah mikroskop stereoskopik (Nikon, Optiphot2). budaya hifa
dewasa S. scabies Apakah mengerami tertahan Dengan 85 L tanaman transgenik dan nontransgenik dari ekstrak seperti yang
dijelaskan untuk Meraih tes penghambatan jamur tumbuh. Setelah 24 jam inkubasi pada 24 ◦C, efek pada morfologi bakteri
Apakah dicatat oleh mikroskop optik (Nikon).
2.9. Analisis statistik
Data yang diperoleh dari bakteri dan jamur tes tion menular yang berbeda dievaluasi secara terpisah dengan analisis varians
(ANOVA). prosedur berarti untuk imental exper acak desain blok lengkap dengan menggunakan Statistika dilakukan 6.0
(StatSoft Inc, 19842001) dan BIOMSTAT / STATISTICA. Fisher paling signifikan prosedur perbedaan (LSD) digunakan untuk
membandingkan Sarana Antara DIs.
3. Hasil
3.1. transformasi kentang dan pemilihan tanaman yang tahan
ErwiniaTransformasieksplan umbi Dengan PDE, lapis, PAP dan konstruksi genetik pApLy (Gambar. 1) Menghasilkan
tanaman tunggal dan doubletransgen mengungkapkan dermaseptin, lisozim, AP24 AP24 ditambah lisozim dan urutan , masing
masing. Adalah tanaman transgenik triple dihasilkan oleh retransformasi garis dermaseptinmengekspresikan (garis De8)
Dengan pApLy tion konstruktif. frekuensi transformasi untuk konstruksi individual bervariasi antara 30 dan 45%. Sebaliknya,
transformasi quency refre jauh lebih rendah (0,75%) dan hanya tiga baris ApLyDe Bisa Diperoleh. Sebuah analisis Southern
blot dari garis termasuk dalam transgen menyalin tes infeksi PALING berbagai nomor Antara 1 dan 2 (Tambahan Gambar. 1).
Gambar. 1. Skema representasi dari konstruksi genetik yang digunakan dalam pekerjaan esta. (A) (d): kaset Ekspresi pap, BGG,
PLY dan plasmid pApLy. 35S: CaMV 35S promoter; 2 x 35S: Digandakan CaMV 35S promoter; L35S "lama" CaMV 35S
promotor; PNos: nopaline synthase promotor; Tnos: nopaline synthase transkripsi pemutusan urut tion; Lys, Der dan AP24:
Gallus gallus lisozim, Phyllomedusa sauvagii dermaseptin dan Nicotiana tabacum AP24 coding urutan, masingmasing; bar:
phosphinotricin asetil transferase; HPH: higromisin phosphotransferase; nptII: neomicyn phosphotransferase; : TMV translasi
penambah; Hal ini apoplastic espo Ramine sinyal peptida; Amy: Barley apoplastic amylase sinyal peptida; RB dan LB: kanan
dan batas kiri wilayah Agrobacterium T, masingmasing. Skema tidak untuk skala.
Apakah kandidat transforman dengan analisis PCR DITINJAU. Sev enty dua tanaman R0 menampilkan bandband yang
diharapkan diagnostik Apakah micropropagated dan preliminarily diputar di tes keseluruhantanaman menggunakan tion menular
Erwinia inokulum (1 x 105 cfu). Akibatnya, 19
Gambar. 2 (a) skala DI digunakan dalam tes infeksi Erwinia carotovora. Angka dari kiri ke kanan Tunjukkan Peningkatan DIs.
(1) tanaman yang sehat; (2) gejala klorosis ringan; (3) daun klorosis dan nekrotik dewasa; (4) layu dan batang nekrotik; (5)
tanaman mati. (B) Peningkatan ketahanan terhadap E. carotovora. Wholetanaman tes infeksi Apakah dilakukan seperti yang
dijelaskan dalam Bagian 2 menggunakan inokulum dari 6 × 107 Perwakilan 4blok cfu untuk jalur tanaman transgenik berbeda
ditunjukkan. Setiap assay termasuk 20 tanaman per baris. (1) NonTransformed; (2) ApLyDe12; (3) aply47; (4) De8; (5) Ap2;
(6) Ly55. Wholetanaman tes berulang Apakah Setidaknya 3 kali untuk setiap baris transgenik. Gambar diambil empat minggu
setelah inokulasi bakteri.
Silakan mengutip artikel ini dalam pers sebagai :. Rivero, M., et al, Penumpukan gen antimikroba pada tanaman kentang
transgenik menganugerahkan Peningkatan ketahanan terhadap patogen jamur dan bakteri. J. Biotechnol. (2011), doi: 10,1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
PASAL DALAM PERS G
Model
BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx 5
Gambar. 3. Peningkatan resistensi terhadap Erwinia carotovora. Umbi tes maserasi Apakah dilakukan seperti yang dijelaskan
dalam Bagian 2 menggunakan inokulum dari 2 x 105 gejala Perwakilan cfu dari uji Termasuk umbi 15 per baris yang akan
ditampilkan. (A) Diinokulasi nonBerubah; (B) diinokulasi Ly55; (C) Dediinokulasi 8; (D) diinokulasi aply47; (E) Diinokulasi
ApLyDe12; (F) nonDiinokulasi nonTransformed.
Berperilaku garis sebagai sangat tahan Apakah Dipilih untuk analisis lebih lanjut (Tambahan Tabel 1). arsitektur umum tanaman,
ukuran umbi dan nomor, dan waktu perkembangan tanaman ini konsisten dengan fenotip nonTransformed. pengobatan statistik
menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan (p = 0,08777) antara Ap dan Ly garis transgenik tunggal, tetapi menemukan
perbedaan yang signifikan yang pengupas com Ketika Ap dan Ly baris dengan ekspresi dermaseptin (De) baris (p = 0,02777 p =
0,02899 dan masingmasing ). Juga, perbedaan yang mendasar Ap dan garis ini Ly ditemukan Were Ketika Dibandingkan Untuk
double(aply) dan garis tripletransgenik (ApLyDe) (p = 0,03399 p = 0,04122 dan, masingmasing). Perbedaan signifikan yang
ditemukan dalam semua kasus Ketika Membandingkan garis tanaman transgenik untuk kontrol nontransgenik (p ≤ 0,05).
Dalam putaran sekunder tes infeksi, garisgaris yang dipilih Apakah PERINGKAT untuk ketahanan menggunakan indeks
penyakit semikuantitatif (DI; Gambar2a). Untuk lebih membedakan antara baris sangat tahan, bac inokulum terial adalah 6 ×
107 untuk Peningkatan cfu Dalam kondisi ini, tanaman Pengendalian meninggal di sekitar persiapan 15 dpi Sebaliknya, tanaman
transgenik Tetap gejala sehat atau hanya minor ditampilkan sampai 3060 dpi (Gambar. 2b). Garis mengungkapkan tiga transgen
(garis ApLyDe 7 ApLyDe8 dan ApLyDe12; DIs: 1,01,4) dilakukan lebih baik dari garis mengekspresikan dua transgen (garis
aply35, aply47, ApLy 48, aply52 dan aply60; DIs: 1,72,1) atau transgen tunggal (garis Ap1, Ap2, AP3, In2, In8, De10,
In19, In23, Ly55 , Ly59 dan Ly80; DIs: 1,62,8) (Tambahan Tabel 1). Dermaseptin garis Berubah (garis De2 dan In8; DIs:
1,6 dan 1,9) ditampilkan perlawanan antibakteri terkuat antara garis tunggal transgen. Mengevaluasi ketekunan gejala busuk
lunak, semua lini transgenik Apakah tumbuh sampai jatuh tempo dan umbiumbian mereka Dikumpulkan. Tidak ada tandatanda
infeksi setelah Mungkinkah Diamati 18 bulan umbi penyimpanan; pada gilirannya, menghasilkan umbi ini tanaman yang sehat
dan umbiumbian yang ditanam dalam tanah Ketika steril (hasil tidak ditunjukkan).
19 garis diuji dalam tes keseluruhantanaman yang diuji dalam maserasi assay umbi disc (Gambar. 3af). tion pelindung
hampir lengkap ditemukan di umbi dari garis mengungkapkan tiga transgen (ApLyDe7 ApLyDe8 dan12 jalur ApLyDe; MV:
0,130,23 mL). Umbi mengungkapkan dua transgen (aply35, aply47, aply48, aply52, aply60; MV: 0,240,29 mL) atau
transgen tunggal (De 2 De8, De10, De 19, In23; MV: 0,260,48 mL dan Ly55, Ly59, Ly80; MV: 0,310,39 mL, masing
masing) Menunjukkan Juga tingkat signifikan resistensi. Sebaliknya, umbiumbian nonBerubah Menunjukkan maserasi yang
luas (MV: 4 mL) (Tambahan Tabel 1). Lesi pada umbi tripletransgen Were Tentang 10 kali lipat lebih kecil dari orangorang
dari kontrol, tidak Meningkatkan setelah infeksi awal dan Tampak kering dan periang. Sebaliknya, lesi pada cakram umbi Terdiri
Kontrol atas 80100% dari permukaan, terinfeksi Peningkatan Selama Terus tion, dan aspek berair ADH. Penghambatan pada
pertumbuhan Erwinia juga diperkirakan oleh pengukuran langsung dari beban bakteri pada 3 dpi. Dibandingkan dengan kontrol,
penurunan hingga 6 pesanan dalam akumulasi bakteri ditemukan dalam tigatransgene umbi (garis ApLyDe7 dan ApLyDe12;
Tabel Tambahan 1). Selain itu, penampilan sel bakteri diperiksa dengan pemindaian mikroskop elektron. Sampel dari tanaman
transgenik mengandung sel Erwinia yang tersebar yang menunjukkan permukaan yang keriput dan ukurannya berkurang.
Sebaliknya, sampel dari tanaman yang tidak bertransformasi mengandung sel yang menunjukkan fenotip normal (Gambar
Tambahan 2a dan b).
Selain itu, beberapa garis yang dipilih menjadi sasaran tuber sprout ingtes untuk mengevaluasi kinerja mereka dalam konteks
yang menyerupai
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang
memberikan peningkatan resistensi untuk bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE G Model BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
DALAM PRESS
6 M. Rivero dkk. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx
a
b
4. (a) akumulasi ProteinGambar. Pada tanaman kentang transgenik. Tingkat akumulasi dermaseptine, AP24 osmotine dan lisozim
dalam garis transgenik diukur seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2. Nilai akumulasi protein dinyatakan dalam L / g. Nilai
dalam kurung menyatakan jumlah protein masingmasing sebagai persentase total protein daun (% TLP). (b) Nilainilai
pengurangan DI dan MV untuk jalur transgenik dan nontransformasi. Nilai reduksi DI dihitung berdasarkan persamaan DI ×
100/5 di mana nilai 5 sesuai dengan DI dari kontrol yang terinfeksi (infeksi 100%). Hasil mewakili nilai ratarata dari 5 tes
independen (n = 1520). NT: tanaman yang tidak berubah.
Tanah yang terinfeksi Erwinia. Dalam kondisi ketat yang digunakan dalam pengujian ini, hanya 010% umbi yang tidak berubah
menghasilkan tunas setelah 3 minggu penanaman. Sebaliknya, tunas umbi dalam galur yang membawa dua dan tiga transgen
(garis ApLy47 dan ApLyDe12) mencapai 75 dan 90% masingmasing. Garis yang ditransformasikan dengan transgen tunggal
menunjukkan persentase pertumbuhan yang lebih rendah (garis De8, 60%; garis Ly55, 28%; garis Ap2, 16%) (Tabel
Tambahan 1). Konsisten dengan hasil ini, ekstrak daun dari garis ApLyDe12 menghambat pertumbuhan bakteri sebesar 85%,
sedangkan ekstrak dari garis ApLy47, De8, Ly55, dan Ap2 menginduksi penghambatan pertumbuhan yang lebih rendah (72,
68). , 60 dan 52%, masingmasing) (data tidak ditampilkan).
3.2. Aktivitas antibakteri relatif dari transgen individu
Lima jalur transgenik menunjukkan tingkat yang sebanding dari tiga protein antimikroba (garis Ap2, De8, Ly55, ApLy47
dan ApLyDe12; Gambar. 4a) dipilih untuk mengevaluasi kontribusi transgen individu untuk perlindungan antibakteri, yang
disimpulkan dari pengurangan DI masingmasing dan nilai MV, dalam pengujian infeksi seluruh tanaman dan tuber. Garis triple
transgene ApLyDe12 berperilaku lebih baik (pengurangan DI: 76%; MV: 0,13 mL) daripada garis transgen ganda atau tunggal
(Gambar 4b). Namun, tingkat resistensi tinggi ditunjukkan oleh garis transgen tunggal De8 (pengurangan DI: 62%; MV: 0,26
mL), mengekspresikan sekitar setengah tingkat dermaseptin daripada garis ApLyDe12, menunjukkan aktivitas antibakteri yang
kuat untuk pro tein. Demikian pula, resistensi yang ditemukan sejalan Ly55 (pengurangan DI: 58%; MV: 0,31 mL) menunjuk
lisozim sebagai sumber utama kedua resistensi. Di sisi lain, perbedaan tingkat resistensi antara garis ApLy47 (pengurangan DI:
64%; MV: 0,24 mL) dan Ly 55 (pengurangan DI: 58%, MV: 0,31 mL), mengekspresikan tingkat lisozim yang sama, hanya
disarankan kontribusi kecil AP24 terhadap resistensi bakteri. Ini dikonfirmasi dalam tes infeksi di mana garis Ap2
(menunjukkan akumulasi AP24 yang sama daripada garis ApLy47) tidak mampu mengatasi serangan bakteri (pengurangan DI:
16%).
3.3. Uji Streptomyces Infeksi
Untuk memverifikasi apakah garis yang dipilih tahan terhadap bakteri patogen lainnya, tes tuber infeksi tambahan dilakukan
dengan S. scabies sebagai agen infeksi. Hanya garisgaris yang menunjukkan
resistensi yang tinggi terhadap E. carotovora (garis De8, Ly55, ApLy47 dan ApLyDe12) termasuk dalam pengujian ini.
Sementara 100% umbi yang tidak bertransformasi mengalami lesi, sebagian besar umbi ApLyDe12 tetap tidak terpengaruh dan
hanya 2% menunjukkan gejala keropeng minor. Demikian juga, hanya 10% dari ApLy47 dan 3–15% dari De8 dan Ly55 umbi
yang mengalami lesi (Tabel 2 Tambahan). Kerangkacangan garis transgenik hanya dangkal dan terlibat tidak lebih dari 15% dari
permukaan umbi. Sebaliknya, scab di kontrol nontransformasi terdiri 7080% dari permukaan umbi dan termasuk lesi hingga 5
mm dalam (Gambar. 5a). Resistensi terhadap S. kudis juga diukur dalam uji pertumbuhan nutrisi dengan ekstrak daun transgenik
(Gambar 5b). Ekstrak dari garis ApLyDe12, ApLy47, De8 dan Ly55 menghasilkan penghambatan 70, 55, 60 dan 45%,
masingmasing. Tidak ada penghambatan pertumbuhan yang diamati ekstrak dari tanaman yang tidak berubah.
3.4. Uji infeksi jamur
Diharapkan bahwa, selain efek antibakteri mereka, beberapa kombinasi transgen dapat memberikan perlindungan terhadap
penyakit jamur. Untuk mengevaluasi ini, beberapa garis yang diuji untuk resistensi antibakteri ditantang dengan tiga patogen
jamur insiden tinggi dalam produksi kentang. Tes semikuantitatif yang berbeda digunakan untuk mengevaluasi efek dari setiap
spesies jamur.
Dua tes yang berbeda dilakukan dengan menggunakan P. infestans sebagai agen menginfeksi. Pada tes pertama, planlet dari
garis Ap2, De8, Ly 55, ApLy47 dan ApLyDe12 dan kontrol nontransformasi in vitro diinokulasi dan dievaluasi untuk
keterlambatan dalam perkembangan gejala dan kelangsungan hidup tanaman (Gambar 6a – e). Kinerja terbaik diamati pada garis
Ap2, Aply47 dan ApLyDe12, di mana sebagian besar individu tetap tidak terpengaruh atau menunjukkan gejala hawar kecil
pada 710 dpi Di sisi lain, lebih dari 50% dari De8 , Ly55 dan planlet kontrol menunjukkan pembusukan lengkap atau
menunjukkan gejala berat. Dalam kondisi uji ini, tanaman yang tidak berubah mati sekitar 3–5 dpi.
Pada uji infeksi Phytophthora kedua, daun yang terlepas dari garis yang sama diinokulasi dengan suspensi yang mengandung
1 × 105 sporangia. Derajat infeksi jamur diperkirakan mengukur lesi luas persentase pada 5 dpi (Tambahan Tabel 3). Daun dari
garis ApLy47 dan ApLyDe12 menunjukkan kinerja terbaik menampilkan persentase nekrotik dari 11,2 dan 9,3, masingmasing,
sedangkan daun dari garis Ap2, menunjukkan tingkat resistensi menengah (Gambar. 6f dan 8). Dengan pengecualian garis Ly
55, yang sangat terpengaruh, semua jalur transgenik lainnya menunjukkan perbedaan signifikan mengenai tanaman yang tidak
berubah.
Sebuah tes infeksi daun serupa diimplementasikan untuk R. solani (Gambar 7a). Pada 5 dpi, persentase daerah nekrotik
meliputi hampir 90% dari daun yang tidak berubah. Semua garis transgenik menunjukkan perbedaan yang signifikan mengenai
tanaman yang tidak berubah. Garis ApLyDe12 dilakukan sebagai sangat tahan hanya menunjukkan 10,5% dari kerusakan
nekrotik. Garis Ap2, De8, Ly55 dan ApLy47 peringkat dalam nilainilai menengah yang menunjukkan area lesi dari 27,2%,
29,5%, 41,1% dan 23,7%, masingmasing (Tambahan Tabel 3). Garis De8, Ly55, ApLy47 dan ApLyDe12 juga diuji dalam
uji penghambatan pertumbuhan yang dilakukan dengan total ekstrak daun. Efek penghambatan tertinggi diamati dengan ekstrak
garis ApLyDe12. Ekstrak dari garis Ly55 dan ApLy47 menginduksi tingkat penghambatan antara, sedangkan ekstrak dari garis
De8 dan tanaman yang tidak berubah menunjukkan tidak ada tandatanda retardasi pertumbuhan (Gambar Tambahan 3a).
Ketahanan terhadap F. solani diuji menggunakan tes semikuantitatif yang mengukur volume nekrotik yang disebabkan oleh
infeksi jamur pada minituber kentang. Infeksi dengan patogen ini termasuk garis yang diubah dengan transgen tunggal dan
kombinasi dua dan tigatransgen (Tambahan Tabel 3 dan Gambar 7b). Lesi nekrotik pada baris ApLyDe12 terutama terbatas
pada situs inokulasi pada 5 dpi, sementara mereka termasuk
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang
memberikan peningkatan resistensi terhadap patogen bakteri dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE DALAM PRESS
G Model
BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
M. Rivero dkk. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx 7
Gambar. 5. (a) Peningkatan resistensi terhadap kudis Streptomyces. Skala DI yang digunakan untuk menentukan perkembangan
gejala dirinci dalam legenda Tabel III. Perwakilan gejala dalam umbi transgenik dan nontransformasi ditampilkan. (1) Umbi
nontransformasi diinokulasi (DI = 3); (2) umbi nondiinokulasi nondiinokulasi (DI = 0); (3) diinokulasi ApLyDe 12 umbi (DI
= 1); (4) diinokulasi ApLy47 umbi (DI = 1); (5) diinokulasi De8 umbi (DI = 1); (6) diinokulasi Ly55 umbi (DI = 2). (B) S.
inhibisi penghambatan pertumbuhan scabies oleh ekstrak daun dari garis kentang yang berbeda. Pertumbuhan bakteri
diekspresikan sebagai nilai OD. Persentase penghambatan mengacu pada ekstrak yang tidak berubah. Batang mewakili ratarata
tiga tes independen. Sisipan: pengamatan mikroskopis di ruang Neubauer dari kultur scabies S. diobati dengan ekstrak daun yang
tidak berubah (1) dan ekstrak daun ApLyDe12 (2) setelah 48 jam inkubasi. Sel bakteri yang ditunjukkan pada gambar sesuai
dengan volume sampel 0,1 mm3. Batang Photomicrographs: 10 m.
sebagian besar volume minituber di kontrol yang tidak diubah. Seperti yang diamati dalam tes Phytophthora dan Rhizoctonia,
garis ApLy47 menunjukkan lesi antara, dan garis Ap2, De8 dan Ly55 menunjukkan kerusakan menengah / parah. Semua garis
transgenik yang diuji menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan tanaman yang tidak
bertransformasi. Selain itu, ekstrak daun dari garis De8, Ly55, ApLy47 dan ApLyDe12 dipekerjakan untuk melakukan uji
pertumbuhaninhibisi Fusarium. Konsisten dengan hasil yang diperoleh dalam tes minituber, ekstrak dari garis ApLyDe12
menunjukkan tingkat penghambatan pertumbuhan tertinggi, diikuti oleh ekstrak dari garis ApLy47, Ly55 dan De8 (Gambar
Tambahan. 3b). Tidak ada penghambatan pertumbuhan jamur yang diamati dengan ekstrak daun yang tidak berubah.
Nilai yang diperoleh untuk jalur transgenik single, double, dan tripletransgenik terbaik (Ap2, De8, Ly55, ApLy47 dan
ApLyDe12) dalam beberapa tes infeksi yang dijelaskan sebelumnya dibandingkan dalam hal tingkat resistensi terhadap bakteri
dan jamur patogen (Gambar 8a dan b). Setelah normalisasi data, tingkat resistensi maksimum 1 dihitung (1 X
baru
) untuk jalur tripletransgenik ApLyDe 12 menunjukkan kinerja terbaik dalam kondisi infeksi ketat
dan tingkat resistensi minimum 0 dihitung untuk nontransgenik kontrol. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 8b, garis transgenik
tunggal De8 dan Ly55 dan garis transgenik ganda ApLy47 menunjukkan tingkat resistensi yang sangat tinggi ketika diuji
terhadap bakteri patogen. Sebaliknya, resistensi terhadap jamur patogen pada jalur transgenik tunggal dan ganda adalah variabel
dan tampaknya lebih.
Silakan mengutip artikel ini di media: Rivero, M., dkk., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang
memberikan peningkatan resistensi terhadap patogen bakteri dan jamur. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE DALAM PRESS
G Model
BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
8 M. Rivero dkk. / Journal of Biotechnology xxx (2011) xxx– xxx
Gambar 6. Meningkatkan resistensi terhadap Phytophthora infestans. Infeksi planlet in vitro dilakukan seperti yang dijelaskan
dalam Bagian 2. (a) ApLyDe12; (b) ApLy47; (c) Ap2; (D) De8; (e) Ly55; (f) NT, kontrol nontransgenik. Plantlet yang
ditunjukkan pada gambar mewakili blok termasuk 15 individu. Perkembangan gejala tercatat pada 10 dpi Semua tanaman non
transgenik benarbenar nekrotisasi pada 35 dpi (g) Detacheddaun assay di jalur kentang transgenik dan nontransformasi.
Sepenuhnya daun diperluas diinokulasi dengan 60 L dari suspensi yang mengandung 2 × 104 sporangia. Lesi yang ditunjukkan
mewakili satu blok termasuk 20 daun dari setiap garis kentang. Gambar diambil pada 5 dpi
tergantung pada kehadiran transgentransgen spesifik atau gabungan gengen transgen.
4. Diskusi
Upaya untuk memperkenalkan resistensi simultan terhadap penyakit bakteri dan jamur di S. tuberosum telah langka dan
sebagian besar
tidak meyakinkan. Untuk mencapai tujuan ini, kami memilih tiga protein yang secara individual menunjukkan aktivitas
antimikroba yang luas. Salah satu protein ini, lisozim ayam, adalah enzim yang dipelajari dengan baik yang mempengaruhi
bakteri Grampositif dan Gramnegatif (Serrano et al., 2000). Lain dari mereka, AP24 osmotine, memberikan perlindungan yang
kuat untuk P. infestans dan jamur patogen lainnya (Liu et al., 1994; Ouyang et al., 2005). Melengkapi aktivitas dua protein ini,
Gambar. 7. Peningkatan resistensi terhadap Rhizoctonia solani dan Fusarium solani. (A) Terpisah daun uji dengan Rhizoctonia
solani. Sepenuhnya daun diperluas diinokulasi di sektor kanan atas dengan sumbat hial diameter 0,5 cm. Lesi yang ditunjukkan
pada gambar mewakili satu blok termasuk 20 daun dari setiap garis kentang. (B) Tuber infeksi assay dengan Fusarium solani.
Blok eksperimental termasuk 2530 minituber dari setiap baris kentang. Setiap minituber diinokulasi dengan suspensi yang
mengandung 1 × 108 conidia / mL. Perwakilan daun dan tuber lesi di nontransformasi (NT), ApLyDe12, ApLy47, De8, Ap2
dan garis Ly55 ditampilkan. Gambar diambil pada 7 dpi di kedua (a) dan (b).
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang
memberikan peningkatan resistensi terhadap bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 /
j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE DALAM PRESS
G Model
BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
M. Rivero dkk. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx 9
Gambar 8. (a) Data dari Tabel Tambahan 1–3 sesuai dengan garis transgenik Ap2, Ly55, De8, ApLy47 dan ApLyDe12 dan
NT, kontrol nontransgenik dinormalisasi sehingga dapat membandingkan nilai yang diperoleh dalam unit dan skala yang
berbeda. Normalisasi dicapai dengan menggunakan persamaan X
baru
. Level
resistance dihitung sebagai 1 X
baru.
= X – X
min
/ X
max
–Xmin
Menurut ini, nilai
resistansi maksimum 1 dihitung untuk jalur tanaman transgenik ApLyDe12 sedangkan nilai minimum (0) adalah hasil untuk
tanaman kontrol NT. (b) Bagan kolom tiga dimensi yang dinormalisasi mewakili tingkat resistensi relatif dari garis transgenik
yang dipilih untuk patogen bakteri dan jamur yang termasuk dalam pekerjaan ini, sebagaimana dicatat dalam uji infeksi yang
berbeda. Erwinia: alat tes maserasi disk tuber; Streptomyces: uji infeksi tuber; Phytophthora: uji daun yang terlepas; Rhizoctonia:
uji daun yang terlepas; Fusarium: infeksi tuber assay. NT: kontrol nontransgenik.
dermaseptin memasok perlindungan antibakteri dan antijamur untuk berbagai patogen tanaman (Osusky et al., 2005). Empat
konstruksi genetik, mengandung AP24 osmotin, dermaseptin, lysozyme dan AP24 plus urutan pengkodean lysozyme digunakan
untuk mengubah eksplan tuber. Ekspresi simultan dari dermaseptin, lisozim dan AP24 dicapai dengan transformasi ulang garis
dermaseptindiubah. Strategi transformasi ulang dipilih alihalih transformasi bersama karena memungkinkan perbandingan
langsung tingkat dermaseptin antara transforman primer dan garis yang diubah kembali.
Kombinasi yang lebih efektif dari protein antimikroba, serta tingkat akumulasi yang sesuai, tidak dapat diprediksi secara a priori.
Karena tujuan utama kami adalah mengisolasi garis kentang yang menunjukkan resistensi simultan terhadap beberapa patogen,
kami mengadopsi skema seleksi berdasarkan kinerja tanaman yang ditransformasikan dalam kondisi infeksi yang ketat. Tujuh
puluh dua kandidat tanaman pembawa transgen tunggal atau kombinasi double dan tripletransgen disaring untuk ketahanan
terhadap E. carotovora menggunakan inokulum bakteri yang tinggi. Mereka yang menunjukkan tingkat resistensi yang lebih
tinggi untuk infeksi Erwinia dan fenotipe normal dipilih untuk karakterisasi rinci dan tambahan inokulasi dengan patogen
kentang lainnya. Dengan demikian, 19 garis yang menunjukkan resistensi yang kuat dipilih untuk pemeriksaan tambahan
(Tambahan Tabel 1). Seperti yang diharapkan dari laporan sebelumnya, garis yang menunjukkan akumulasi protein rekombinan
yang lebih tinggi menunjukkan tingkat resistensi yang lebih kuat. Garis yang berubah dengan kombinasi dua dan tigatransgen
(garis ApLy47 dan ApLyDe12) berkinerja lebih baik terhadap infeksi bakteri, menunjukkan penurunan DI 65 dan 75% pada
infeksi seluruh tanaman (Gambar 4). Namun, beberapa baris yang menyatakan transgen individu (garis Ap2, De8 dan Ly55)
juga menunjukkan levellevel resistensi yang penting (pengurangan DI dari 40, 62 dan 57%, masingmasing). Hasil dari tes
infeksi lainnya (tuber maserasi, tubo sprouting terinfeksi, jumlah bakteri, penghambatan pertumbuhan bakteri dengan ekstrak
tumbuhan) mendukung kecenderungan yang diamati pada infeksi seluruh tanaman. Di sisi lain, serangkaian tes infeksi yang
dilakukan dengan scary S., menunjukkan pengurangan gejala tuber scab hingga 80% (Gambar. 5a dan Tambahan Tabel 2).
Hebatnya, sementara aktivitas lisozim mempengaruhi terutama bakteri Gramnegatif, itu juga efektif terhadap S. kudis bakteri
Grampositif sebagaimana dibuktikan dalam tuberinfeksi dan penghambatan pertumbuhan tes dilakukan dengan garis Ly55.
Kontribusi relatif dari masingmasing protein antibakteri terhadap E. resistensi karotovora diperkirakan dengan membandingkan
pengurangan DI dan MV tuber dalam jalur yang mengekspresikan jumlah protein transgenik yang sama. Dengan demikian,
perbandingan antara garis ApLyDe12 dan De8 menyarankan bahwa dermaseptin adalah kontributor individu utama terhadap
infeksi antibakteri. Perbandingan serupa antara garis
ApLy47 dan Ly55 menunjukkan kontribusi lisozim yang besar dan kontribusi kecil AP24 terhadap fenotip resistensi.
Mendukung ini, tanaman yang secara individual mengekspresikan konstruksi AP24 berperilaku buruk terhadap infeksi Erwinia.
Pengamatan ini mengkonfirmasi pekerjaan sebelumnya yang menunjukkan tingkat perlindungan yang tinggi pada tanaman yang
diubah dengan urutan dermaseptin atau lisozim (Düring, 1993; Liu et al., 1994; Nakajima et al., 1997; Osusky et al., 2005).
Garis transgenik yang sama diuji dengan E. carotovora dan S. kudis yang diinokulasi dengan P. infestans, R. solani dan F.
solani, tiga jamur phy tophatogenic memprovokasi hilangnya kentang penting. Seperti yang ditemukan untuk infeksi bakteri,
garisgaris yang mengekspresikan kombinasi double dan tripletransgene dilakukan lebih baik daripada yang mengekspresikan
protein individu. Detachedleaf assays dengan garisgaris yang mengekspresikan urutan AP24 menunjukkan tingkat resistensi
yang lebih tinggi terhadap P. infestans dan R. solani, mencapai pengurangan lesi hingga 90% (Tambahan Tabel 2 dan Gambar. 6f
dan 7a). Efek yang sebanding terlihat dalam tes infeksi tuber yang dilakukan dengan F. solani (Tambahan Tabel 2 dan Gambar
7b). Secara khusus, aktivitas antijamur yang kuat dibuktikan sejalan Ap2. Hasil ini menguatkan laporan awal yang
menggambarkan aktivitas AP24 sebagai antijamur dominan (Liu et al., 1994; Yun et al., 1998).
Perlu dicatat bahwa ketahanan transgenik terhadap patogen yang berbeda dapat sangat dipengaruhi oleh latar belakang genetik
dari kultivar orangtua (Arbogast et al., 1999; Ryan et al., 2004). Dalam kasus Spunta, sebagian besar laporan mengkategorikan
kultivar ini sebagai rentan terhadap E. carotovora, dan R. solani dan sebagai cukup toleran terhadap S. sca bies, P. infestans dan
Fusarium spp. Implementasi strategi transgenik yang diadopsi di sini pada kultivar kentang lainnya harus mempertimbangkan
respon spesifik mereka terhadap patogen kentang yang paling penting.
Karena kombinasi tripletransgen yang digunakan dalam pekerjaan ini memberikan perlindungan terhadap lima patogen
kentang yang berbeda, dapat dibayangkan bahwa pengaturan transgen yang sama juga akan efektif terhadap patogen bakteri dan
jamur lain yang mempengaruhi tanaman ini. Di sisi lain, hasil yang diperoleh dalam pekerjaan ini tidak dapat secara langsung
diekstrapolasikan ke kondisi pertanian yang sebenarnya, di mana kombinasi beberapa biotik dan abiotik efektor dapat
menghasilkan berbagai hasil yang tidak terduga. Dengan mempertimbangkan hal ini, buktibukti yang disajikan di sini harus
didukung lebih lanjut dengan melakukan uji coba lapangan dalam konteks agroekosistem dan manajemen yang berbeda.
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada Dr. J. Calcagno atas saran ahlinya dalam perawatan statistik. Pekerjaan ini sebagian didukung
oleh hibah PICT 08 06801 dari Badan Nasional untuk Promosi Sains dan
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba di tanaman transgenik kentang
memberikan peningkatan resistensi untuk bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.11.005
ARTICLE G Model BIOTEC5919; Jumlah Halaman 10
DALAM PRESS
10 M. Rivero et al. / Jurnal Bioteknologi xxx (2011) xxx xxx
Teknologi Argentina dan hibah perjanjian penelitian antara Goyaike SA dan Fundación Ciencias Exactas y Naturales. AM dan
FBA adalah Peneliti Penelitian dari CONICET (Argentina). NF dan EL adalah rekan dari ANPCyT (Argentina) dan CONICET,
masingmasing. MR dan PP mengajar asisten di FCENUBA.
Lampiran A. Data tambahan Data
tambahan yang terkait dengan artikel ini dapat ditemukan, dalam versi online, di doi: 10.1016 / j.jbiotec.2011.11.005.
Referensi
Abad, LR, D'Urzo, MP, Liu, D., Narasimhan, ML, Reuveni, M., Zhu, JK, Niu, X., Singh, NK, Hasegawa, PM, Bressan, RA,
1996. Aktivitas antijamur tembakau osmotin memiliki spesifitas dan melibatkan permeabilisasi membran plasma. Menanam sci.
118, 11–23. Alan, AR, Blower, A., Earle, ED, 2004. Ekspresi gen peptida antimikroba tipemagainin (MSI99) dalam tomat
meningkatkan ketahanan terhadap penyakit bercak bakteri. Plant Cell Rep. 22, 388396. Arbogast, M., Powelson, ML, Cappaert,
MR, Watrud, LS, 1999. Respon enam kultivar kentang terhadap jumlah air yang digunakan dan Verticillium dahliae. Fitopatologi
89, 782788. Arce, P., Moreno, M., Gutierrez, M., Gebauer, M., Dell'Orto, P., Torres, H., Acu na, I., Oliger, P., Venegas, A.,
Jordana, X., Kalazich, J., Holuigue, L., 1999. Resistensi ditingkatkan untuk infeksi bakteri oleh Erwinia carotovora subsp.
atroseptica pada tanaman kentang transgenik yang mengekspresikan attacin atau cecropin SB37 gen. Saya. J. Potato Res. 76,
169–177. Bradford, MM, 1976. Metode cepat dan sensitif untuk kuantifikasi jumlah mikro protein menggunakan prinsip
pengikatan proteindye. Anal. Biochem. 72, 248–254. Campbell, MA, Fitzgerald, HA, Ronald, PC, 2002. Ketahanan patogen
pada tanaman tanaman. Res Transgenik. 11, 599–613. Chakrabarti, A., Ganapathi, TR, Mukherjee, PK, Bapat, VA, 2003.
MSI99, analog magneinin, menanamkan ketahanan terhadap penyakit yang meningkat pada tembakau dan pisang transgenik.
Planta 216, 587–596. Datta, K., Baisakh, N., Maung Thet, K., Tu, J., Datta, S., 2002. Piramida transgen untuk resistensi ganda
dalam beras terhadap penyakit bakteri, penggerek batang kuning dan penyakit hawar. Theor. Appl. Genet. 106, 1–8. Dellaporta,
SL, Wood, J., Hicks, JB, 1983. Sebuah minipreparation DNA tanaman: versi II.
Tanam Mol. Biol. Rep. 1, 19–21. Douglas, R., Halpin, C., 2009. Gen menumpuk. Dalam: Jain, SM, Brar, DS (Eds.), Teknik
Molekuler dalam Peningkatan Tanaman. Springer, Belanda, hal. 613–629. Düring, K., 1993. Dapatkah lysozymes memediasi
resistensi antibakteri pada tanaman? Tanam
Mol. Biol. 23, 209–214. Erwin, DC, Ribeiro, OK, 1996. Penyakit Phytophthora Seluruh Dunia. American Phy
topathological Society Press, St Paul, NN, USA. Gao, H., Tao, S., Wang, D., Zhang, C., Ma, X., Cheng, J., Zhou, Y., 2003.
Perbandingan metode yang berbeda untuk menyiapkan DNA beruntai tunggal untuk oligonukleotida microarray. Anal. Lett. 36,
2849–2863. Gerlach, W., Nirenberg, H., 1982. Genus Fusarium: atlas bergambar. Sarung tangan. Biol.
Bundesanst. LandFurstwirstsch. BerlinDahlen 209, 1–406. Halpin, C., 2005. Gen menumpuk di tanaman transgenik
tantangan untukabad ke21
bioteknologi tanaman. Tanam Biotechnol. J. 3, 141–155. Hanke, V., Düring, K., Norelli, JL, Aldwinckle, HS, 1999.
Transformasi kultivar apel dengan gen T4lysozyme untuk meningkatkan ketahanan terhadap penyakit. Acta Hortic. 489, 253–
256. Herrmann, M., Zocher, R., Haese, A., 1996. Pengaruh gangguan gen sintase enniatin pada virulensi Fusarium avenaceum.
Mol. Plant Microbe Int. 9, 226–232. Höltje, JV, 1996. substrat lisozim. Dalam: Jollès, P. (Ed.), Lysozymes: Model Enzim dalam
Biokimia dan Biologi. Birkhäuser Verlag, BaselBostonBerlin, hal. 105–110. Jha, S., Chattoo, BB, 2009. Transgene
penumpukan dan ekspresi terkoordinasitanaman
defensinmemberi resistensi jamur pada nasi. Beras 2, 143–154. Kato, A., Nakamura, S., Ibrahim, H., Matsumi, T.,
Tsumiyama, C., Kato, M., 1998. Produksi lisozim yang dimodifikasi secara genetik memiliki stabilitas panas yang ekstrim dan
aktivitas antimikroba terhadap bakteri Gram negatif dalam ragi dan tumbuhan. Mol. Nutr. Res makanan. 42, 128–130. Keinath,
AP, Loria, R., 1991. Pengaruh kepadatan inokulum dan resistensi kultivar pada keropeng kentang dan dinamika populasi
Streptomyces scabies. Saya. J. Potato Res. 68, 515–524. Labruyere, RE, 1971. Keropeng Umum dan Kontrolnya pada Tanaman
Benihkentang. Pusat Penerbitan dan Dokumentasi Pertanian, Wageningen, Belanda. Lapwood, DH, Baca, PJ, Spokes, J., 1984.
Metode untuk menilai kerentanan kentang umbi dari kultivar yang berbeda untuk membusuk oleh Erwinia carotovora subspesies
atroseptica dan carotovora. Plant Pathol. 33, 13–20.
Lebecka, R., ZimnochGuzowska, E., Lojkowska, E., 2006. Penyakit bakteri. Dalam: Gopal, J., Khurana, SMP (Eds.), Handbook
of Potato Production, Improvement and Pascapanen Manajemen. The Haworth Press, Binghamton, NY, AS, hal. 359–386. Lee,
YP, Kim, SH, Bang, JW, Lee, HS, Kwak, SS, Kwon, SY, 2007. Meningkatkan toleransi terhadap stres oksidatif pada tanaman
tembakau transgenik yang mengekspresikan tiga enzim antioksidan dalam kloroplas. Plant Cell Rep. 26, 591598. Liu, D.,
Raghothama, KG, Hasegawa, PM, Bressan, RA, 1994. Osmotin overexpresion dalam kentang menunda perkembangan gejala
penyakit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1888–1892. López, A., Zaldúa, Z., Pimentel, E., García, M., García, R., Mena, J.,
Morán, R., Selman, G., 1996. Modificación del gen de la esporamina de boniato con un fragmento de DAN sintético, Secuencia
nucleotídica y expresión en Escherichia coli. Biotecnol. Apl. 13, 265270. Melchers, LS, Stuiver, MH, 2000. Gen baru untuk
penangkaran penyakitresistensi. Curr.
Opin. Biol tanaman. 3, 147–152. Mourgues, F., Brisset, MN, Chevreau, E., 1998. Strategi untuk meningkatkan ketahanan
tanaman terhadap penyakit bakteri melalui rekayasa genetika. Tren Biotechnol. 16, 203210. Nakajima, H., Muranaka, T., Ishige,
F., Akutsu, K., Oeda, K., 1997. Resistensi penyakit jamur dan bakteri pada tanaman transgenik yang mengekspresikan lisozim
manusia. Plant Cell Rep. 16, 674–679. Osusky, M., Osuska, L., Kay, W., Misra, S., 2005. Modifikasi genetik kentang terhadap
penyakit mikroba: in vitro dan aktivitas planta derivatif B1 dermaseptin, MsrA2. Theor. Appl. Genet. 111, 711–722. Ouyang, B.,
Chen, YH, Li, HX, Qian, CJ, Huang, SL, Ye, ZB, 2005. Transformasi tomat dengan gen osmotin dan chitinase dan ketahanan
mereka terhadap layu Fusarium. J. Hortik. Sci. Biotechnol. 80, 517–522. Pérombelon, MCM, 2002. Penyakit kentang yang
disebabkan oleh erwinias busuk lunak: ikhtisar
patogenesis. Plant Pathol. 51, 1–12. Platt, HW, Petters, RD, 2006. Penyakit jamur dan oomycete. Dalam: Gopal, J., Khurana,
SMP (Eds.), Handbook of Potato Production, Improvement and Pascapanen Manajemen. The Haworth Press, Binghamton, NY,
AS, hal. 315–358. Qi, B., Fraser, T., Mugford, S., Dobson, G., Sayanova, O., Butler, J., Napier, JA, Stobart, AK, Lazarus, CM,
2004. Produksi rantai panjang tak jenuh ganda asam lemak omega3 dan omega6 pada tumbuhan. Nat. Biotechnol. 22, 739–745.
Roberts, WK, Selitrennikoff, CP, 1988. Chitinase tanaman dan bakteri berbeda dalam
aktivitas antijamur. J. Gen. Microbiol. 134, 169–176. Romano, A., Raemakers, K., Bernardi, J., Visser, R., Mooibroek, H.,
2003. Organisasi transgenik dalam kentang setelah transformasi bombardmentmediated (co) menggunakan plasmid dan kaset
gen. Res Transgenik. 12, 461–473. Ryan, AD, Kinkel, LL, Schottel, JL, 2004. Pengaruh isolat patogen, kultivar kentang, dan
strain antagonis pada keparahan keropeng kentang dan kontrol biologis. Biocontrol Sci. Technol. 14, 301–311. Schaad, NW,
Jones, JB, Chun, W., 2001. Panduan laboratorium untuk identifikasi bakteri patogen tanaman, ed ketiga. APS Press, The
American Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, USA. Selitrennikoff, CP, 2001. Protein antijamur. Appl. Env.
Mikrobiol. 67, 2883–2894. Serrano, C., ArceJohnson, P., Torres, H., Gebauer, M., Gutiérrez, M., Moreno, M., Jor dana, X.,
Venegas, A., Kalazich, J., Holuigue , L., 2000. Ekspresi gen lisozim ayam di kentang meningkatkan resistensi terhadap infeksi
oleh Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Saya. J. Potato Res. 77, 191–194. Shah, DM, 1997. Rekayasa genetika untuk penyakit
jamur dan bakteri. Curr. Opin.
Biotechnol. 8, 208–214. Singh, NK, Bracker, CA, Hasegawa, PM, Handa, AK, Buckel, S., Hermodson, MA, Pfankoch, E.,
Regnier, FE, Bressan, RA, 1987. Karakterisasi osmotin: protein seperti thaumatin yang terkait dengan adaptasi osmotik di sel
tumbuhan. Plant Physiol. 85, 529–536. Sneh, B., Burpee, L., Ogoshi, A., 1991. Kunci Cytomorphical ke Rhizoctonia spp.
Identifikasi spesies Rhizoctonia. APS Press, The American Phytopathological Society, NY, USA, hlm. 39–42. Stevenson, WR,
Loria, R., Franc, GD, Weingartner, DP, 2001. Kompendium
Penyakit Kentang, edisi kedua. APS Press, NY, USA. Stiekema, WJ, Heidekamp, F., Louwerse, JD, Verhoeven, HA,
Dijkhuis, P., 1988. Pengenalan gen asing ke dalam kultivar kentang Bintje dan Désirée menggunakan vektor biner
Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 7, 47–50. Termorshuizen, AJ, 2007. Patogen jamur dan jamur seperti kentang.
Dalam: Vreugdenfield, D. (Ed.), Biologi Kentang dan Bioteknologi: Kemajuan dan Perspektif. Elsevier, Belanda, hal. 643–650.
Yaron, S., Rydlo, T., Shachar, D., Mor, A., 2003. Aktivitas dermaseptin K
4
4 terhadap patogen bawaan makanan. Peptida 24, 1815–1821. Yeaman,
MR, Yount, NY, 2003. Mekanisme aksi danpeptida antimikroba
resistensi. Pharmacol. Pny. 55, 27–55. Yun, DJ, Ibeas, JI, Lee, H., Coca, MA, Narasimhan, ML, Uesono, Y., Hasegawa, PM,
Pardo, JM, Bressan, RA, 1998. Osmotin, protein antijamur tanaman, transduksi sinyal subvert untuk meningkatkan kerentanan
sel jamur. Mol. Sel 1, 807–812. Zasloff, M., 2002. Peptida antimikroba organisme multisel. Nature 415,
389–395.
Silakan mengutip artikel ini di tekan sebagai: Rivero, M., et al., Penumpukan gen antimikroba pada tanaman transgenik kentang
memberikan peningkatan resistensi terhadap bakteri dan jamur patogen. J. Biotechnol. (2011), doi: 10.1016 /
j.jbiotec.2011.11.005