Nallamilli Español

Molecular Diagnosis de distrofia muscular UNIDAD 9,25
de Duchenne
Babi Ramesh Reddy Nallamilli, 1 Arunkanth Ankala, 1 y Madhuri Hegde 1
1 Departamento de Genética Humana de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, Georgia
RESUMEN
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno neuromuscular hereditaria ligada al cromosoma X causado por
mutaciones en el gen de la distrofina ( DMD; locus Xp21.2). El espectro de mutaciones de DMD es único en que el 65% de las
mutaciones causales son deleciones intragénicas, con duplicaciones intragenic y mutaciones puntuales (junto con otras
variantes de secuencia) representa el 6% a 10% y 30% a 35%, respectivamente. La estrategia para las pruebas de diagnóstico
molecular para la DMD implica el cribado inicial para deleciones / duplicaciones utilizando microarrays de base hibridación
genómica comparada (CGH-array) seguido de análisis fullsequence de DMD para variantes de secuencia. análisis de genes
Recientemente, secuenciación de próxima generación (NGS) basado dirigida se ha convertido en clínicamente disponibles
para la detección de mutaciones puntuales y otras variantes de secuencia (pequeñas inserciones, deleciones y indeles). Esta
unidad analiza inicialmente el algoritmo estratégico para establecer un diagnóstico molecular de DMD y más tarde proporciona
protocolos detallados de los métodos de diagnóstico molecular actuales para DMD, incluyendo CGH-array, secuenciación de
Sanger basado en la PCR, y ensayo de secuenciación basada en NGS.
Curr. Protoc. Tararear. Gineta. 83: 9.25.1-9.25.29 do © 2014 por John Wiley & Sons, Inc.
Palabras clave: distrofia muscular de Duchenne diagnóstico molecular hibridación genómica comparada
DMD
INTRODUCCIÓN
Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es el trastorno neuromuscular más común, afectando 1 de cada 3.500 varones
nacidos vivos (Mehler, 2000). La distrofia muscular de Becker (BMD) es alélica para la DMD y se presenta con
características clínicas más leves y una menor tasa de progresión de la enfermedad. DMD se presenta típicamente antes
de los 5 años de edad con retraso motor generalizadas y andar di fi cultades. Tanto DMD y BMD son trastornos ligados al
cromosoma X causadas por mutaciones en el gen de la distrofina, que es el gen más grande en el genoma humano, que
consta de 79 exones que abarcan de 2,2 Mb en el cromosoma X. La expresión reducida o completa ausencia de la
proteína distrofina conduce a la necrosis de las células musculares; lo que resulta en debilidad muscular. supresiones
Intragenic son las mutaciones más comunes en el gen de la distrofina, lo que representa> 65% de los casos de DMD.
Estas supresiones y puntos de corte correspondientes se distribuyen a lo largo de la longitud del gen sin hotspots o puntos
de interrupción recurrentes. 6% a 10% de DMD mutaciones. El 30% al 35% restante de mutaciones incluye mutaciones
puntuales, pequeñas deleciones e inserciones. Las mutaciones puntuales y pequeñas deleciones están dispersos por toda
la longitud de la DMD gen sin regiones de punto de acceso obvias.
Los individuos afectados con sospecha de DMD a causa de la creatina quinasa elevada (CK) niveles, o la falta de
distrofina tinción de proteínas en la biopsia muscular y la presencia de rasgos característicos, son considerados para
molecular con fi rmación de diagnóstico. Diagnóstico molecular de la DMD se consigue mediante identificación de
mutaciones patógenas en el DMD
gen, tales como deleciones, duplicaciones, y mutaciones puntuales. estrategias de ensayo de diagnóstico molecular actuales de
DMD incluyen diferentes enfoques, tales como catión multiplex PCR ampli fi, análisis de transferencia Southern, la ligadura de
múltiplex sonda dependiente ampli fi cación (MLPA), secuenciación de Sanger basado en PCR, hibridación genómica
comparativa basada en micromatriz Genética Molecular
clínicos
Current Protocols in Human Genetics 9.25.1-9.25.29, Octubre 2014 Publicado en línea de octubre de 2014 en 9.25.1
Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002 / 0471142905.hg0925s83 Derechos de Autor do
suplemento 83
© 2014 John Wiley & Sons, Inc.
la sospecha clínica de la DMD
comparativos arrays de hibridación genómica
deleciones o deleciones o
duplicaciones duplicaciones no
patógenos detectado
detectados
secuenciación basada en PCR

establecer DMD variantes patógenas o basados en
diagnóstico identificado NGS dirigidos
ensayo
Figura 9.25.1 Algoritmo para el diagnóstico molecular DMD. La estrategia aquí representada se basa en el espectro de mutación DMD y
los rendimientos clínicas de los métodos de diagnóstico clínicamente disponibles para DMD. Se centra en los tres protocolos principales;
CGH-array (ver protocolo básico 1), la secuenciación PCRbased Sanger (ver protocolo básico 2), y ensayo de secuenciación basada en
NGS (ver protocolo básico 3). Como se indica aquí, el diagnóstico molecular para la DMD debe comenzar con el análisis de deleción /
duplicación por CGH-array, seguido por la secuenciación de genes (exón centrado) para mutaciones puntuales u otras variantes de la
secuencia. Los negativos para estos mencionada assaysmay ser referidos para cariotipo o G-bandas para la interrogación de posibles
translocaciones (equilibradas) que implican Xp21.2 ( DMD)
lugar.
(Array-CGH), y la secuenciación de próxima generación dirigida. Algunos de los enfoques tienen limitaciones en la
detección de duplicaciones y mutaciones puntuales. Desde deleciones son el tipo más común de mutaciones en el DMD
gen, una pantalla inicial que detecta las deleciones se debe considerar como el primer paso en el diagnóstico
molecular de la DMD (Fig. 9.25.1).
diagnóstico molecular Integral de mutaciones en el DMD gen es un reto debido a la variedad de tipos de mutación y gran
tamaño del gen. Tres estrategias diagnósticas moleculares importantes se describen en esta unidad para detectar la DMD gen
para todos los tipos de mutaciones copia número variación. Protocolo básico 1 describe de alta resolución CGH-array para la
detección de deleciones y duplicaciones en el DMD gene. Protocolo Básico 2 describe la secuenciación de Sanger PCRbased
de toda la región de codificación de la DMD gen para la detección de mutaciones puntuales y pequeñas deleciones. Protocolo
Básico 3 describe la secuenciación de próxima generación dirigido (NGS) de la DMD gen como parte de un panel de genes
utilizando la biblioteca de sondas de bloqueo disponible comercialmente xGen (disponible de Integrated DNA Technologies).
Sin embargo, es de notar que, mientras que el protocolo basado en NGS tiene el potencial de convertirse en el uno para
todos (para la detección de todos los tipos de variantes) de prueba, en la actualidad debido a los costos involucrados, la
infraestructura requerida y retos analíticos, el protocolo no se utiliza ampliamente.
Molecular
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.2
suplemento 83 Current Protocols in Human Genetics

Hibridación genómica comparativa basado en micromatrices Protocolo básico
1
CGH-array se ha establecido como la herramienta más potente disponible para la detección de variaciones en el número de
copias genómicas (CNV) con alta resolución. El uso de CGH-array, copia pérdidas y ganancias número tan pequeño como 1
Kb en el gen pueden ser detectados (Askree et al.,
2013). gama diseños personalizados son empresas fromvarious disponibles comercialmente como Agilent Technologies y
Oxford Gene Technologies. Una matriz de 60K que consiste en 60.000 sondas únicas en una separación media entre la
sonda de 10 pb de la región codificante y 25 pb en el promotor y intrónicas regiones es su fi ciente para detectar todas las
deleciones y duplicaciones en el
DMD gen (. del Gaudio et al, 2008; Hegde et al., 2008). Este protocolo detallado analiza todos los diferentes pasos
implicados en la detección de CNVs utilizando CGH-array, comenzando con cizallamiento del ADN, diferencial fluorescente
etiquetado de las muestras de ADN para la hibridación en arrays de oligonucleótidos, y el análisis de datos.
materiales
muestra de ADN de individuo afectado sospecha que tienen muestra de ADN de control de DMD de individuo
sano (paciente y controles deben ser iguales
género)
Espiga-ins (BlueGnome)
CytoSure Labeling Kit (OGT) que contiene:
Random primers dCTP mezcla de
marcaje de tampón de Cy5-dCTP
Cy3-dCTP Reacción Klenow de la
polimerasa 1 × Tris-EDTA (Fisher)
Cot-1 humano DNA (Invitrogen)
Oligo CGH-array / Kit de Hibridación chip-on-chip (Agilent Technologies / OGT)

que contiene:
10 × tampón de bloqueo (liofilizado agente de bloqueo, ver receta)) Hi-RPM tampón de

hibridación CGH-array tampón de lavado 2 (ver receta) CGH-array de tampón de lavado 1
(ver receta) acetonitrilo
Estabilización y solución de secado (Agilent Technologies)
NanoDrop espectrofotómetro Branson

soni fi er 450 tiras de tubos PCR
termociclador
tubos de microcentrífuga de 1 ml
MultiScreen HTS PCR placas de 96 pocillos (Millipore) mezclador MultiScreen colector de vacío (Millipore)
de la placa 65 ° C horno de hibridación y personalizada de los rotadores horno HD-CGH Microarray 8 × 60K
diapositivas (tecnologías OGT o Agilent) kit de hibridación junta de deslizamiento (100) -8-plex (Agilent
Technologies / OGT) cámara de hibridación (Agilent SureHyb) 37 ° baño de agua titular tarros Slide-tinción
de cristal-slide C
barras de agitación magnética y placa de agitación

Genética Molecular
clínicos
9.25.3
Current Protocols in Human Genetics suplemento 83

microarray escáner de alta resolución (Agilent Technologies) CytoSure
Interpretar el software (Oxford tecnología genética)
muestras de ADN de etiquetas con fluorescencia
concentración de ADN 1. Medida utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Diluir la muestra de ADN para obtener una
concentración final de 30 ng / μ l.
Preparar tanto paciente DMD y controlar soluciones de trabajo de ADN (30 ng / μ l) en tubos separados. Comience con ADN
de buena calidad (A 260/280 relación debe ser> 1,8).
2. Someter a ultrasonidos tanto DMD pacientes y de control de muestras de ADN en tubos separados mediante el uso de los siguientes
ajustes en un Branson Soni fi er 450:
Ciclos de trabajo: constante de
control de salida: tiempo 4
Tratamiento: 30 sec
Si un Branson Soni fi er 450 no está disponible, asegúrese de establecer los ajustes apropiados en cualquier sonicador disponible para
obtener fragmentos de ADN de 200 pb.
3. Antes de etiquetado, incubar cada paciente DNAsamplewith específico espiga-en la forma siguiente. Preparar ADN y espiga-en
mezcla de muestra en tiras de tubos de PCR mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción de muestra:
18 μ l esquilada muestra de ADN de paciente DMD (30 ng / μ l) 1 μ l espiga-en 10 μ l de

cebador aleatorio 10 μ l de tampón de reacción
Cada espiga-en es una combinación de tres de ADN diferente amplicón cada una representando una secuencia cromosómica fi
específico diferente no tiene relevancia clínica conocida. Por ejemplo, uno específico espiga-en contiene amplicones de ADN que
representan 5q14.2, 6q14.3, y 8q23.3 loci. Del mismo modo, varios de tales combinaciones (pico-ins) están disponibles
comercialmente. Cada una de las muestras de los pacientes individuales que se están cargando en una sola diapositiva array se
enriquecerán con una espiga-en único. Básicamente, Spike-ins ayudan a detectar cualquier contaminación cruzada entre las
muestras de los pacientes durante la hibridación y etiquetado pasos-presencia de cualquier amplicón aparte de los tres esperado
de la espiga-en añadirse a la muestra indica la posible contaminación cruzada de esa muestra con una muestra diferente.
Espiga-ins no necesitan ser añadidos para controlar muestras de ADN. Añadir 10 μ l de cebador aleatorio y 10 μ l de tampón de
reacción a 18 μ l de cizallado muestra de ADN de control.
4. tiras de tubos Place de PCR en un termociclador e incubar 20 min a 99 ° C. Después del tratamiento térmico, las muestras se enfríe
durante al menos 5 min a 4 ° DO.
5. Preparar la mezcla maestra de etiquetado en un tubo de microcentrífuga de 1-ml separado mediante la combinación de la fl debido para
cada reacción:
10 μ l dCTP mezcla de marcaje 1 μ l Cy3-dCTP o Cy5-dCTP

(1 mM) 1 μ l polimerasa de Klenow.
muestras de pacientes y controles deben ser etiquetados con diferentes colorantes; el colorante Cy3 se puede utilizar para muestras
de pacientes y el tinte Cy5 para muestras de control. Desde tintes Cy son ligeras, muestras de ADN de etiquetas sensibles y hibridan
diapositivas protegidas de la luz.
6. Transferencia 12 μ l de Cy3 mezcla maestra de etiquetado para tubo de muestra de ADN del paciente y 12 μ l
de Cy5 maestro etiquetado mezclar para controlar tubo de muestra de ADN.
7. Colocar ambos tubos pacientes y de control de muestras en el termociclador y realizar las siguientes
Molecular incubaciones: 2 hr a 37 ° C y 10 min a 65 ° DO.
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.4

Purificar fl productos etiquetados uorescently
8. Cargar el volumen total de cada producto marcado en cada pocillo de una MultiScreen HTS
placa de PCR.
9. Coloque el MultiScreen cargado HTS placa de PCR en la parte superior del vacío MultiScreen
colector.
10. Aplicar vacío a 25 pulg. De Hg durante 5 minutos o hasta que todo el líquido ha filtra fi.
11. Retirar la placa de colector y reconstituir puri muestra fi ed mediante la adición de 22 μ l

de 1 × Tris-EDTA a cada pocillo.
12. muestras mezclar completamente en un mezclador de placas durante 10 min. Recuperar los productos etiquetados final purificado en tiras
de tubos de PCR.
muestras marcadas Pre-bloque
13. Evaluar la incorporación de colorante de muestras marcadas mediante el uso de un espectrofotómetro NanoDrop.
Asegúrese de que se obtienen lecturas de colorante de incorporación similar para ambas muestras de los pacientes y de control. Las
muestras de paciente deben lograr una incorporación de tinte Cy3 de 14 pmol / μ l y de control de muestras deben lograr una
incorporación de tinte Cy5 de 13 pmol / μ l.
14. Antes de proceder a la etapa de pre-bloqueo, combine tanto para el paciente y las correspondientes muestras de control fi cadas
puri.
Mientras que la mezcla de las muestras de pacientes y de control, garantizar que ambas muestras pertenecen al mismo género.
15. Preparar pre-bloqueo de mezcla mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción en tiras de tubos de PCR: 5 μ l
Cot-1 DNA (1 mg / ml) 11 μ l 10 × tampón de bloqueo 55 μ tampón de hibridación l 44 μ l de ADN combinado paciente y
control (marcado y purificado).
16. Lugar de PCR tiras de tubos en un termociclador e incubar 3 min a 95 ° C y 30 min a

37 ° DO.
Hibridar muestras pre-bloqueados
17. Antes de iniciar la hibridación, comprobar que la temperatura de la 65 ° C hibridación

horno es en realidad a los 65 años ° DO.
18. Coloque una diapositiva junta limpio en la base de la cámara Agilent SureHyb con la etiqueta junta hacia arriba y
alineado con la sección rectangular de la base de la cámara.
19. dispensar suavemente 105 μ l de pre-bloqueado muestra sobre el portaobjetos junta que está descansando
en la cámara de deslizamiento.
Evitar burbujas de aire por la dispensación de muestra muy cuidadosamente sobre el portaobjetos junta. Las burbujas de aire afectará
negativamente a la calidad de hibridación y matriz.
20. Coloque suavemente el portaobjetos microarray sobre el portaobjetos junta con el número de código de barras hacia arriba.
microarrays diapositivas deben caer planas en la diapositiva junta con la solución de la muestra. Se ve como un sándwich formado por los
microarrays de diapositivas en la parte superior, tobogán junta en la parte inferior, y la muestra en el medio. colocación inadecuada de los
microarrays de diapositivas puede conducir a fugas de la solución de muestra, en última instancia, causando la contaminación cruzada entre
muestras múltiples.
Genética Molecular
clínicos
9.25.5

Figura 9.25.2 Male paciente DMD datos obtenidos a partir de la CNV experimento CGH-array utilizando customdesigned 60K array de alta
densidad de OGT (ver protocolo básico 1). intensidades de hibridación relativas se midieron y normalizado para determinar las variaciones del
número de copias en la muestra del paciente. La secuencia de referencia con el número de copias normal se normalizó a valor cero. Disminución
de la intensidad se considera generalmente como la supresión y aumento de la intensidad se considera como la duplicación en el genoma del
paciente. ( UNA)
eliminación hemizygous en una muestra de paciente DMD macho se indica por una disminución de desplazar por debajo de cero. ( SEGUNDO) duplicación heterocigótica en
una muestra de paciente DMD macho indica por el aumento de cambio por encima de cero.
21. fijar la porción superior de la cámara Agilent SureHyb y apriete cuidadosamente el tornillo.
22. Inspeccionar cuidadosamente la cámara de deslizamiento mediante la rotación y asegúrese de que el líquido de muestra se fl debido
libremente dentro de la junta.
Golpear suavemente la cámara en el mostrador de garantizar un libre flujo de la muestra.
23. Coloque la cámara de SureHyb en el 65 ° C horno de hibridación. Asegúrese de encender

el rotador en el horno de hibridación.
24. Hibridar desliza durante al menos 16 horas o durante la noche.
Realizar lavado post-hibridación

25. Antes de la etapa de lavado, pre-caliente 500 ml de tampón de lavado 2 a 37 ° DO.
26. Relleno frasco de tinción de portaobjetos con tampón de lavado 1 y también colocar un soporte de vidrio de diapositiva en el mismo frasco
de tinción de portaobjetos.
Molecular 27. Quitar cámara de deslizamiento del horno de hibridación y desmonte la cámara de deslizamiento.
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.6

Figura 9.25.3 Mujer de pacientes DMD datos obtenidos a partir de la CNV experimento CGH-array utilizando array 60K de alta densidad de diseño personalizado de OGT (ver
protocolo básico 1). ( UNA) duplicación heterocigótica en una muestra de paciente DMD hembra indica por el aumento de cambio por encima de cero. ( SEGUNDO) La deleción
heterocigota en una muestra de paciente femenino DMD se indica por una disminución de desplazar por debajo de cero.
28. Colocar todos los sándwiches deslizable junta en el frasco de tinción de portaobjetos que contiene tampón de lavado 1 y microarrays
diapositivas cuidadosamente separados de las juntas.
Trate de evitar los arañazos en las diapositivas mediante la celebración de las diapositivas en sólo la parte de código de barras de las diapositivas.
29. Transferencia todos desliza a lo largo con el soporte de diapositivas en un nuevo frasco de tinción de portaobjetos con tampón de lavado 1.
Colocar una barra de agitación magnética dentro de la jarra y encender la placa de agitación para mezclar muy suavemente durante 5
min en la campana de humos.
30. Llenar un nuevo frasco de tinción de portaobjetos situado en una campana de humos con pre-calentado tampón de lavado 2. Colocar una
barra de agitación magnética dentro de la jarra.
31. Transferencia de todas las diapositivas a la jarra de tinción de portaobjetos con tampón de lavado 2 y Incubar los portaobjetos durante 1 min
con agitación suave.
32. Incubar los portaobjetos en diapositiva cubeta de tinción que contiene acetonitrilo durante 1 min con agitación suave.
33. Colocar los portaobjetos en tinción de diapositivas frasco llenan con la estabilización y la solución de secado. Mezclar suavemente la
solución durante 30 segundos.
34. suavemente y poco a poco eliminar diapositivas junto con la parrilla corrediza para minimizar cualquier gotitas en las diapositivas. Genética Molecular
clínicos
9.25.7

35. Continuar el procedimiento de exploración sin ningún retraso para reducir cualquier impacto de oxidantes externos en intensidades
de señal.
Escanear diapositivas y analizar datos
36. Antes de iniciar la exploración, gire en el escáner de micromatrices de alta resolución (en general, un escáner requiere 15
min para inicializar su programa).
Siga las instrucciones del fabricante para los detalles operativos completos para el escáner de micromatrices de alta
resolución de Agilent.
37. Después de escanear la diapositiva array, una característica extrajo fi l se genera para el análisis utilizando CytoSure Interpretar
software. Siga las instrucciones del software CytoSure Interpretar V4.1.9 del fabricante para obtener más información por
etapas sobre cómo utilizar el software para análisis de datos y la detección de la CNV.
38. La intensidad de la hibridación relativa es proporcional al número de copias relativo de las regiones de destino. Estas
intensidades de hibridación relativas se miden y normalizado para determinar las variaciones del número de copias en la
muestra del paciente. Disminución de la intensidad se considera generalmente como la supresión y aumento de la
intensidad se considera como la duplicación en el genoma del paciente. Una duplicación de copia única se indica
mediante una sonda / sondas que tienen una relación log2 de> 0,3, mientras que una copia única deleción tiene una
relación de log2 de> -0.6. El software CytoSure Interpretar se aproximará el número de copias por dividir el cambio ratios
de registro por el umbral adecuado. Ver Figuras 9.25.2 y 9.25.3.
Protocolo SANGER secuenciación de todo DMD Región que codifica para detectar mutaciones POINT
básico 2
DMD, que se extiende 2200 Kb, es el mayor gen identi fi ed en el genoma humano y se compone de 79 exones. secuenciación
Sanger de productos amplificado por objetivos de PCR convencionales los 79 exones junto con límites intrón-exón para las
mutaciones en sitios de empalme. cebadores Exonspeci fi c se utilizan para amplificar cada uno de los 79 exones. También
dirigidos son la fi c región promotora musclespeci y mutaciones intrónicas conocidos. Tabla 9.25.2 enumera un conjunto
completo de cebadores que han sido clínicamente validados y optimizados para el rendimiento. Para facilitar el uso de
cebadores universales para la secuenciación de ciclo, M13 hacia delante y M13 inverso etiquetas de secuencia se añaden a
cada cebador directo e inverso, respectivamente.
materiales
DMD exón-específico cebador directo (5 μ M) (requerida para los 79 exones) DMD fi cebador c
inverso exón-específico (5 μ M) (requerida para los 79 exones) de ADN de paciente DMD (25 ng / μ l)
10 × tampón de PCR con MgCl 2 ( Roche) mM dNTPs 10 (Roche) Faststart Taq ADN polimerasa
(Roche) 2% de gel de agarosa
BigDye Terminator kit de secuenciación de ciclo v3.1 (Life Technologies) que contiene:
5 × El tampón de secuenciación
BigDye Terminator v3.1 reacción Ready Mix M13 hacia

delante o M13 inverso solución melatonina cebador (Sigma)
Nanodrop espectrofotómetro de 96 pocillos placa de

PCR Thermal Centrifugar ciclador con MultiScreen
Molecular
rotor placa HTS placa de PCR (Millipore)
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
9.25.8

pipeta multicanal
MultiScreen colector de vacío (Millipore) mezclador de
placas
aparato de electroforesis de gel
Edge PCR de 96 pocillos Performa Version 3 placas fi purificación (Egde Biosystems) ABI 3730
secuenciador
La mutación de software Surveyor (SoftGenetics LLC)
Amplificar gen DMD mediante PCR
1. Preparar 5 μ soluciones de trabajo Mprimer para cada uno de los cebadores directo e inverso.
Todo DMD exón-específico, conocido variantes especí intrónicas fi c, y musculares cebadores promotor específico c se enumeran
en la Tabla 9.25.2.
2. Antes de comenzar PCR, medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro Nanodrop. Diluir la muestra
de ADN para obtener una concentración final de 25 ng / μ l.
3. Preparar la mezcla de PCR maestro combinando los siguientes para cada reacción (preparar suficiente mezcla maestra para
amplificar todas las reacciones):
5.0 μ l 10 × tampón de PCR con MgCl 2 ( Roche)

1.0 μ l dNTPs (10 mM)
0.4 μ l Faststart Taq ADN polimerasa (5 U / μ l)
2.0 μ l de ADN de paciente DMD (25 ng / μ l)
37.6 μ l H 2 O.
4. Dispensar 46 μ l de mezcla maestra de PCR a cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR.
5. Añadir 2 μ l de 5 μ M cebador directo y 2 μ l de 5 μ M correspondiente cebador inverso

a cada reacción PCR en la placa de PCR de 96 pocillos. Sellar la placa de PCR bien y girar 30 seg para recoger toda
la solución a fondo de cada pocillo.
6. Colocar la placa de PCR en el termociclador y llevar a cabo el siguiente programa de ciclo de ampli fi cación PCR:
1 ciclo de: 3 min 95 ° C (desnaturalización)
35 ciclos: 15 sec 95 ° C (desnaturalización)
1 minuto 64 ° C (recocido)
75 sec 72 ° C (extensión)
1 ciclo de: 10 minutos 72 ° C (extensión).
Purificar PCR productos ampli fi cación de 79 exones del gen de DMD
7. Después de la PCR ampli fi cación, centrifugar la PCR placa de 30 seg.
8. Transferir el volumen total de cada producto de la reacción de PCR en cada pocillo de una MultiScreen HTS PCR
puri fi placa de cationes utilizando una pipeta multicanal.
9. Coloque el MultiScreen cargado HTS placa de PCR en la parte superior del vacío MultiScreen
colector.
10. Aplicar vacío a 25 pulg. De Hg durante 5 minutos o hasta que todo el líquido ha filtra fi.
11. Retirar la placa de colector y reconstituir la muestra purificó mediante la adición de 50 μ l de agua destilada
a cada pocillo.
12. muestras mezclar completamente en un mezclador de placas durante 10 min. La transferencia de los productos final purificado de PCR en
un nuevo placa de 96 pocillos PCR.
13. Comprobar todas purifica la calidad del producto de PCR y tamaño mediante la ejecución de 5 μ l de cada muestra en Genética Molecular
clínicos
un gel de agarosa al 2%.
9.25.9

Realizar ciclo de secuenciación de productos de PCR purificado
14. Preparar ciclo de secuenciación mezcla maestra de PCR mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción (preparar una mezcla
maestra de PCR su fi ciente para la secuenciación de todos los productos de PCR obtenidos):
1.75 μ l 5 × El tampón de secuenciación
0.5 μ l BigDye Terminator v3.1 mezcla de reacción listo

1.0 μ l M13 hacia delante o M13 cebador inverso (3,2 μ METRO)
4.75 μ l de agua destilada.
Siempre mantenga BigDye Terminator v3.1 Ready Mix protegido de la luz.
15. Pipetear 8 μ l de la secuenciación del ciclo de mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 96 pocillos PCR.
16. Añadir 2 μ l de cada purificado producto de PCR en cada reacción de PCR bien en el de 96 pocillos
placa de PCR. Sellar la placa PCR herméticamente y girar 30 seg para recoger todos los contenidos en la parte inferior del pozo.
17. Coloque la placa de PCR en el termociclador y realizar el siguiente programa de ciclo de ampli fi cación
PCR:
24 ciclos: 10 sec 96 ° do
5 sec 50 ° do
4 min 60 ° DO.
Eliminar terminador de colorante de las muestras de reacción de secuenciación de ciclo
Antes de cargar las muestras en el secuenciador capilar, el exceso de cebadores y dNTPs se deben retirar de la reacción de
secuenciación mediante el uso de Edge de PCR de 96 pocillos Performa Versión placas fi cación 3 puri.
18. Transferencia 10 μ l de cada reacción de secuenciación a cada pocillo de la Edge PCR de 96 pocillos
Performa Versión placas fi cación 3 de Puri.
Cargar la muestra en el centro del pozo sin tocar los pocillos con las puntas de pipeta.
19. Colocar una placa de 96 pocillos de purificación cargado sobre una nueva placa de recolección y colocar las placas intercaladas en
una centrifugadora. Centrifugar durante 5 minutos a 850 × sol.
Realizar secuenciación capilar
20. Añadir 40 μ l de solución de melatonina para cada fi ed muestra de secuenciación de ciclo puri.
La melatonina mejora la calidad de secuenciación mediante la estabilización de la reacción de secuenciación.
21. Cubrir los pocillos con un tabique. Vórtice brevemente y de girar todo el contenido 30 seg.
22. Ejecutar las reacciones de secuenciación en un secuenciador ABI 3730, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Analizar datos
23. Importar secuencia de muestras fi les (formato ABI) y una secuencia de referencia fi le, DMD.NM_004006.2
(GBK fi l de NCBI), y se alinean las secuencias utilizando el software Mutación Surveyor. Después de análisis
de datos, crear un informe mutación que contiene las variantes detectadas (Fig. 9.25.4).
Consulte el manual del fabricante para obtener detalles completos de análisis de datos (http: // www
. softgenetics.com/MutationSurveyor_UsersManual.pdf).
Molecular
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
09.25.10

Figura 9.25.4 secuenciación de Sanger (véase el Protocolo Básico 2) resultados para un paciente de sexo masculino DMD tal como se ve en el software Mutación Surveyor.
Aquí se muestra una mutación sin sentido hemizygous (c.3776 G> T) en el exón 26 que se prevé que cambiar el codón que codifica GAA para el glutamato aminoácido en la
posición 1178 a un codón prematuro de terminación TAA (p.E1178 ×). secuencia Paciente (S) está alineada con la secuencia de referencia (R) para la detección de variantes de
secuencia y ambas orientaciones de secuencia directo e inverso se muestran aquí.
APUNTADO PRÓXIMA GENERACIÓN DE SECUENCIACIÓN DMD Utilizando sondas LOCKDOWN IDT Protocolo básico
xGen 3
Desde su introducción hace casi una década, NGS tiene revolutionizedmolecular diagnóstico de trastornos genéticos. En
contraste con la secuenciación de amplicón individual por el método de Sanger, NGS permite la secuenciación paralela de
múltiples amplicones de interés. La tecnología en constante avance de enriquecimiento de destino y la química de secuenciación
proporciona aumento de la sensibilidad para la detección de la variante y la disminución de coste al permitir el interrogatorio
paralelo de no uno, sino varios genes. la secuenciación simultánea de múltiples genes, todos los cuales están asociados con un
único trastorno genéticamente heterogéneo se conoce como prueba de panel. Este protocolo describe la detección de
mutaciones puntuales en el DMD gen usando sondas de encierro Xgen, una biblioteca de enriquecimiento de diseño
personalizado por y comprado de Tecnologías de ADN integrado (IDT). Xgen sondas de encierro para la secuenciación de
próxima generación específica se sintetizan individualmente oligonucleótidos que son complementarios a la región genómica de
interés. Las sondas se biotina etiquetados para permitir la captura por estreptavidina perlas después de la hibridación. Las sondas
para los genes especí fi cos de interés pueden ser diseñados y adquiridos directamente de IDT. La biblioteca de enriquecimiento
de destino utilizado aquí se orienta al 50 genes de enfermedades neuromusculares incluyendo DMD. Se seleccionaron estos
genes basado en la revisión exhaustiva de las pruebas para la asociación con una enfermedad neuromuscular. Sobre la base de
requisición de prueba, ya sea un solo gen (tal como DMD) o un conjunto de genes se puede analizar usando este protocolo.
Actualmente, el ensayo basado en NGS para el diagnóstico DMD es aplicable para la detección de mutaciones puntuales o
variantes de la secuencia (SVS) solo.
materiales
muestras de ADN
El agua destilada, grado HPLC 1 × bajo TE tampón (Life

Technologies) Kit Agilent alta sensibilidad (Agilent) que contiene:
Genética Molecular
escalera de ADN
clínicos
BIOO Cientí adaptadores fi c y el cebador kit Mix contiene:
09.25.11

BIOO científica adaptadores indexadas de 1 a 48 BIOO la
Ciencia Primer Mix
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA) Agencourt Beads
Ampure (Beckman Coulter) 70% de etanol (Sigma) Cot-1
humano DNA (Invitrogen) xGen universal bloqueo Oligo
TS-p5 (IDT) xGen universal bloqueo Oligo TS-p7 (IDT)
SeqCap EZ hibridación y Kits de lavado (Nimblegen) que contiene:

10 × Tampón de lavado I (Nimblegen) 10 × Tampón de
lavado II (Nimblegen) 10 × Tampón de lavado III
(Nimblegen) Tampón de lavado astringente (Nimblegen) 2 ×
Tampón de Hibridación (Nimblegen) Hibridación
Componente A (Nimblegen)
2.5 × Bead Wash Buffer (Nimblegen) xGen mezcla

de sondas de bloqueo (IDT)
Dynabeads M-270 de estreptavidina (Life Technologies) de
hidróxido de sodio 10 M (NaOH, Sigma) 1 M Tris · Cl, pH 8,8
(Sigma) 10 μ cebador M Illumina P5 (IDT) 10 μ M Illumina P7
cebador (IDT) tampón HT1 (Illumina), control Illumina PhiX fría
(Illumina)
Espectrofotómetro (NanoDrop)
Covaris E serie de ultrasonidos (Covaris) conectada a un ordenador con SonoLab
software
Covaris microtubos y soporte de tubo (Covaris)
tubos LoBind de 1,5 ml (Eppendorf)
Microcentrífuga
chips de alta sensibilidad Bioanalyzer (Agilent) 2100
Bioanalyzer (Agilent)
SPRI-TE Acid Extractor nucleico (Beckman Coulter) SPRIworks Card
Método Illumina (Beckman Coulter) SPRIworks 2,0 ml tubos (Beckman
Coulter) SPRIworks Reactivo cartucho (Beckman Coulter) SPRIworks
tubos adaptadores (Beckman Coulter) SPRIworks puntas de
perforación (Beckman Coulter) SPRIworks 1 consejos -ML (Beckman
Coulter) dynamag soporte magnético (Life Technologies) placas
HardShell PCR tapas (Biorad) Snap (Biorad) centrífuga con rotor placa
cicladores térmicos (Biorad T-100) qubit fl uorometer (Life
Technologies) Vacufuge Papel de aluminio Vortexer 47 ° C incubadora
(SciGene, Fisher) HiSeq2500 (Illumina)
Molecular
Diagnosis de
Distrofia NextGENe v2.3.4 software (SoftGenetics LLC)
muscular de
Duchenne
09.25.12

ADN Shear
concentración de ADN 1. Medida con un espectrofotómetro. diluir 3 μ g de cada ADN
muestra para obtener un volumen final de 50 μ l con agua destilada de grado HPLC.
Por conveniencia en general, siempre que sea aplicable, preparación de la muestra puede ser reunidos en grupos de nueve
muestras. Dos lotes de (9 + 9) Las muestras se pueden preparar de forma simultánea, como 18 muestras se llenar celular ow uno fl
de la HiSeq2500.
2. Encienda la serie de ultrasonidos Covaris E y el ordenador conectado. Llenar el depósito de agua con agua
desionizada.
3. Encienda el botón de desgasificación y allowwater para desgasificar durante 45 minutos. Establecer la temperatura más fría unido a 1.5 ° DO.
4. Colocar los tubos micro Covaris en la estación de carga y suavemente transferir cada 50- μ l
muestra de ADN en micro tubos Covaris separadas.
5. Colocar cada tubo micro cargado en el soporte del tubo y cizallar el DNAwith los siguientes ajustes en el software
SonoLab (el pico de destino para el tamaño de par base es 170 a 275 pb):
factor de trabajo: 10%
El pico de potencia incidente (PIP): 175

Cycles por ráfaga: tiempo 200 Tratamiento:
temperatura 230 sec Bath: 4 ° a 9 ° DO.
6. Transferencia suavemente toda la 50 μ l de cada muestra de ADN esquilada de la micro Covaris

tubos en nuevos tubos LoBind 1,5 ml.
Evaluar la calidad de ADN cizallado
7. Dispensar 2 μ l de ADN cizallado en un nuevo tubo de 1,5 ml y se diluye con 18 μ l de

agua de calidad de HPLC.
Almacenar el restante 48 μ l de ADN cizallado en 4 ° C para su uso posterior en la preparación de la biblioteca.
8. Preparar chip de Bioanalyzer de alta sensibilidad con 1 μ l de ADN cizallado diluido y

escalera de ADN.
9. Colocar el chip preparada en el 2100 Bioanalyzer y ejecutar dentro de 5 min después de la preparación para comprobar el
tamaño de fragmentos de ADN cizallados.
El pico de destino debe estar entre 170 y 275 pb.
preparar la biblioteca
Cuatro importantes pasos de preparación de la biblioteca, como la reparación final, la adición de Como, ligadura de
adaptador y selección del tamaño se pueden realizar mediante el uso de SPRIworks robot de Beckman Coulter. Usando el
robot SPRIworks (SPRI-TENucleicAcidExtractor) es muy conveniente y elimina varios pasos de procesamiento manual en la
preparación de la biblioteca. El SPRIworks Card Método Illumina se requiere para operar el robot SPRIworks.
10. Añadir 102 μ l de agua de calidad de HPLC al 48 restante μ l de ADN cizallado y

transferir toda 150 μ l de la muestra a una SPRIworks etiquetados tubo de 2.0 ml.
11. Retire el cartucho de Reactivo SPRIworks - 20 ° C y permita que se asiente en el

mesa de trabajo para 1 hr se descongele por completo.
12. Preparar tubos de adaptador mediante la adición de lo siguiente en un nuevo tubo adaptador SPRIworks marcados: 2 μ l BIOO la
Ciencia adaptador Indexed 8 μ l de agua de grado HPLC.

Genética Molecular
clínicos
09.25.13

Cuarenta y ocho BIOO científica adaptadores indizadas diferentes etiquetados 1 a 48 están disponibles; utilizar un adaptador
indexada diferente para cada muestra.
13. Encienda SPRIworks de ácido nucleico Extractor y asegúrese de que la tarjeta Método Illumina SPRIworks está en
la máquina.
14. Retire el soporte del cartucho de reactivo y el tubo y la cremallera punta de la máquina SPRIworks y el lugar en la
mesa de trabajo.
15. Añadir cartuchos de reactivos SPRIworks al soporte de cartucho. Colocar el tubo de la muestra correspondiente en el
cartucho de reactivo SPRIworks.
Presiona hacia abajo el cartucho de reactivos SPRIworks para eliminar cualquier burbuja de aire en las soluciones. Cada tubo de
muestra debe contener un volumen total de 150 μ l esquilada de ADN.
16. Añadir consejos y tubos en el siguiente orden en el bastidor tubo SPRIworks y la punta. Fila 1: SPRIworks puntas de
perforación Fila 2: SPRIworks 1 ml Recomendaciones Fila 3: SPRIworks consejos de fila 1 ml 4: Tubos SPRIworks
adaptador
Fila 5: tubos etiquetados SPRIworks vacíos 2,0 ml para recoger salida nal fi.
Asegúrese de que la orden de tubo de muestra en el cartucho de reactivos coincide con los tubos de salida nal fi en la fila 5 de tubo y la
cremallera punta.
17. Coloque el soporte del cartucho de reactivo SPRIworks y bastidor de tubo y la punta en la máquina SPRIworks.
Cierre la puerta y encender el botón de inicio.
La máquina ahora realizar la reparación final, la adición de una bases, la ligadura de adaptador, y selección de tamaño en 5 hr.
18. Después de la terminación de la carrera, retire los tubos fi de salida final de la fila 5 de tubo y la punta de cremallera y coloque
sobre el soporte magnético Dynamag. Permitir que repose durante 5 min en el soporte magnético y transferir la solución de
muestra clara en nuevos tubos LoBind 1,5 ml etiquetados. Descarte cualquier perlas residuales que quedan en el fondo de
los tubos de salida de la final.
Las muestras se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C o 7 días a - 20 ° DO.
Amplificar la biblioteca
19. Preparar mezcla maestra mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción. 8 μ l de agua
de calidad de HPLC 25 μ l 2 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix 2 μ l BIOO la Ciencia Primer Mix.
20. Añadir 35 μ l de mezcla maestra y 15 μ l de purificados muestra SPRIworks-preparado a cada

pocillo en una placa HardShell PCR y sellar la placa con los casquillos de SNAP.
Tienda resto de la muestra en la fi cada unampli - 20 ° DO.
placa 21. Place PCR en un ciclador térmico y realizar el siguiente programa de ciclos ampli catión PCR fi:
1 ciclo de: 45 sec 98 ° C (desnaturalización)
30 segundos 60 ° C (recocido)
30 segundos 72 ° C (extensión)
1 ciclo de: 60 sec 72 ° C (extensión).
Molecular
Diagnosis de
Purificar ampli fi muestra biblioteca ed
Distrofia
muscular de 22. Mezclar suavemente la botella Cuentas Ampure y añadir 90 μ l de los granos del Ampure a cada
Duchenne
ampli muestra biblioteca fi ed bien en la placa de PCR.
09.25.14

23. Mezclar la muestra completamente la pipeta hacia arriba y abajo diez veces. Dejar que la muestra mixta a reposar por 5 min
a temperatura ambiente.
24. Colocar los tubos de muestra sobre la placa magnética y esperar a 2 min. Retirar y desechar la solución de
aclarado a partir de perlas.
25. Añadir 200 μ l recién preparada 70% de etanol a cada muestra de cordón e incubar 30 sec
a temperatura ambiente. Retirar y desechar el etanol. Repetir el lavado con etanol una vez adicional.
26. perlas secas de 5 min a temperatura ambiente (perlas deben pasar de un aspecto brillante a un aspecto
mate).
27. Quitar los tubos de la placa magnética y añadir 32 μ l bajo TE tampón. Mezclar con la pipeta
arriba y hacia abajo y se incuba durante 3 min a temperatura ambiente.
placa 28. Resto en la placa magnética durante 1 min y transferir cada 30 μ solución de muestra clara l
a un nuevo tubo de 1 ml.
Evaluar la calidad del amplificador muestra de la biblioteca ed
29. Dispensar 2 μ l de puri muestra fi ed en un nuevo tubo y se diluye con 38 μ l de HPLC-

agua de calidad.
Almacenar los 28 restantes μ l de amplificador Ed muestra de biblioteca durante 7 días a - 20 ° DO.
30. Preparar chip de Bioanalyzer de alta sensibilidad con 1 μ l de muestra diluida y DNA
escalera.
31. Place el chip preparada en el 2100 Bioanalyzer y ejecutar dentro de 5 min después de la preparación.
El pico de destino debe oscilar desde 275 hasta 350 pb.
32. Medir la concentración de cada muestra usando un fl uorometer Qubit.
Asegúrese de usar la muestra diluida anteriormente para el paso fi cación en la cuanti fi urometer Qubit.
realizar la hibridación
33. Piscina un total de nueve amplificadores muestras biblioteca fi ed juntos en un nuevo tubo de LoBind 1,5-ml. Mientras que la
agrupación de las nueve muestras, asegúrese de incluir 222 ng de cada muestra de ADN.
A partir de este paso, el proceso de todo agruparon (nueve) muestras como una única muestra en un tubo.
34. Agregue el siguiente para cada grupo de nueve muestras: 5 μ l

Cot-1 humano DNA 1 μ l xGen universal bloqueo oligo-TS-p5
1 μ l xGen bloqueo Universal oligo-TS-P7.
35. Ajustar el volumen final de la muestra a 100 μ l con agua de grado HPLC y mezclar suavemente
los contenidos.
36. Colocar el tubo en el Vacufuge y liofilizar la muestra durante 30 min a 45 ° DO.
37. Añadir lo siguiente a la muestra liofilizada.

7.5 μ l Nimblegen Tampón de Hibridación 3 μ l Nimblegen
hibridación Componente A
2.5 μ l de agua de grado HPLC.
38. Mezclar suavemente el contenido y el tubo de centrifugado brevemente. Incubar la muestra 10 min a temperatura ambiente. Genética Molecular
clínicos
09.25.15

inspeccionar visualmente el fondo del tubo para asegurar que la muestra se ha hidratado completamente y ha entrado en
solución.
39. Transferencia de las muestras a una placa de PCR rígido y Cubrir la placa con una tapa a presión.
40. Incubar la PCR placa de 10 min a 95 ° C en un termociclador. Mientras se incuba,

mantener la temperatura tapa ciclador térmico a 105 ° DO.
41. girar rápidamente hacia abajo la placa de PCR y la transferencia de la placa a otra ciclador térmico a 47 ° C. Ajuste la
temperatura tapa en 57 ° DO.
42. Agregar 4 μ l xGen mezcla de sondas de bloqueo y mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo.
Evitar burbujas de aire mientras se mezcla.
43. Cierre la placa de PCR con los casquillos de resorte frescos y cubrir con papel de aluminio para evitar la evaporación.
44. Cerrar la tapa del termociclador e incubar las muestras de 24 h a 47 ° DO.
Capturar y lavar las muestras hibridadas
45. AllowDynabeads M-270 Streptavidin se equilibren a temperatura ambiente durante 30 min antes de usar.
En alrededor de al menos 2 h antes de los extremos etapa de hibridación de 24 horas, comenzar preparingDynabeads.
46. Mezclar suavemente las perlas mediante agitación en vórtex y dispensar 100 μ l de Dynabeads M-270
Estreptavidina a un nuevo tubo LoBind 1,5-ml.
47. Colocar el tubo en un soporte magnético Dynamag y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire
suavemente y descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el
tubo.
48. Añadir 200 μ l de 1 × Bead tampón de lavado y se mezcla suavemente la solución de perlas.
Nimblegen proporciona un 2,5 × BeadWash Buffer, que debe ser diluido a 1 × con agua HPLCgrade. Preparar un total de
300 μ l de 1 × tampón de lavado de talón que se requiere para el lavado de perlas.
tubo.
50. Repetir esta etapa de lavado una vez adicional. Añadir 100 μ l de 1 × Bead tampón de lavado y
resuspender las perlas completamente.
51. Transferencia 100 μ l de perlas resuspendidas en un nuevo tubo de 1,5 ml LoBind para cada
reacción.
tubo.
53. Transferencia de la muestra de hibridación de la placa rígida al tubo que contiene preparado DynabeadsM-270
estreptavidina. Mezclar completamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo.
El volumen de la muestra de hibridación debe ser 17 μ l. Si este volumen reduce significativamente debido a la evaporación,
la hibridación e fi ciencia puede verse comprometida.
54. Incubar el tubo 45 min en un 47 ° C incubadora (SciGene) para unir el ADN completamente a
Molecular
las perlas. Suavemente tubo de vórtice durante 3 segundos cada 15 minutos durante la incubación.
Diagnosis de
Distrofia
muscular de
Duchenne
09.25.16

Nimblegen proporciona 10 × Lavar Buffers I, II, y III. Durante el tiempo de incubación anterior, asegúrese de diluir el 10 × tampones
a 1 × agua withHPLC grado. Si las soluciones tampón de lavado aparecen nublado, calentar los tampones a 47 ° C hasta que la
solución se vuelve clara.
55. Añadir 100 μ l de precalentado 1 × Tampón de lavado I al tubo y mezclar suavemente.
56. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente
y descartar la solución sobrenadante claro, asegurando que todos los granos permanecen en el tubo.
57. Añadir 200 μ l de 1 × Tampón de lavado astringente y mezclar suavemente. Incubar tubo 5 min a
47 ° DO.
58. Colocar el tubo en un soporte magnético y permitir que las perlas se separan del sobrenadante. Retire suavemente y
descartar la solución sobrenadante transparente asegurar que todos los granos permanecen en el tubo.
59. Repetir un lavado adicional con 1 × Tampón de lavado astringente y desechar la clara
solución sobrenadante.
60. Añadir 200 μ l de temperatura ambiente 1 × Tampón de lavado I y suavemente de vórtice durante 2 min.
62. Añadir 200 μ l de temperatura ambiente 1 × Tampón de lavado II y suavemente vórtice 1 min.
64. Añadir 200 μ l de temperatura ambiente 1 × Tampón de lavado III y suavemente vórtice 30 seg.
66. Retire el tubo de soporte magnético y añadir 50 μ l de NaOH 0,125 N. pipetear hacia arriba
y abajo para mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente. vórtice suavemente cada 2 min para mantener las
perlas en la solución.
67. Colocar el tubo en un soporte magnético durante 1 min. Permitir que los granos se separen del sobrenadante.
Transferir el sobrenadante claro a un nuevo tubo que contiene 50 μ l de 1 M Tris · Cl, pH 8,8, para neutralizar la
solución.
Purificar muestra capturada
68. Añadir 150 μ l de los granos del Ampure a muestra. Mezclar la muestra completamente la pipeta hacia arriba
y abajo diez veces. Dejar que la muestra mixta a reposar por 5 min a temperatura ambiente.
69. Coloque los tubos de muestra sobre el soporte magnético y esperar 2 minutos. Retirar y desechar la solución de aclarado a partir de
perlas.
70. Añadir 1 ml de etanol recién preparada 70% a cada muestra de perlas y se incuba 30 segundos a temperatura
ambiente. Retire y deseche el etanol. Repetir el lavado con etanol una vez adicional.
71. Se secan las perlas de 5 min a temperatura ambiente y eliminar tubos placa frommagnetic y añadir 32 μ l de tampón de baja
TE. Mezclar suavemente y se incuba 3 min a temperatura ambiente.
Genética Molecular
clínicos
09.25.17

72. Resto de la placa en un soporte magnético durante 1 min y la transferencia de 30 μ l de la muestra clara
solución a un tubo nuevo.
Amplificar muestras purificó capturados
73. Preparar mezcla maestra mediante la combinación de lo siguiente para cada reacción: 5 μ agua de
grado HPLC l 25 μ l KAPA HiFi Mix HotStart Ready
2.5 μ l 10 μ imprimación M Illumina P5

2.5 μ l 10 μ imprimación M Illumina P7.
74. Añadir 35 μ l de mezcla maestra y 15 μ l de muestra capturada a la nueva placa de PCR rígido
y sellar la placa con los casquillos de SNAP.
Tienda resto del purifica la muestra capturada en - 20 ° DO.
75. Colocar la placa de PCR en el termociclador y realizar el siguiente programa de amplificación fi PCR:
1 ciclo de: 45 sec 98 ° C (desnaturalización)
30 segundos 60 ° C (recocido)
30 segundos 72 ° C (extensión)
1 ciclo de: 60 sec 72 ° C (extensión).
Purificar muestras amplificado capturados
76. Añadir 75 μ l de los granos del Ampure a la muestra bien en la placa de PCR. Mezclar bien la muestra
pipeteando arriba y abajo diez veces. Dejar que la muestra mixta a reposar por 5 min a temperatura ambiente.
77. Colocar los tubos de muestra a la placa magnética y esperar 2 min. Retirar y desechar la solución de aclarado a partir
de perlas.
78. Añadir 200 μ l de recién preparada de etanol al 70% a cada muestra de perlas e incubar
30 seg a temperatura ambiente. Retire y deseche el etanol. Repetir el lavado con etanol una vez
adicional.
79. Secar las perlas durante 5 min a temperatura ambiente. Retire la placa frommagnetic tubos y añadir 22 μ l de 1 × tampón
TE. Mezclar suavemente y se incuba durante 3 min.
80. Resto de la placa en una placa magnética para 1 min y transferencia 20 μ solución de muestra clara l
a un nuevo tubo.
Evaluar la calidad de amplificador Ed muestra capturado
81. Dispensar 2 μ l de puri muestra fi ed en un nuevo tubo y se diluye con 38 μ l de HPLC-

agua de calidad.
Almacenar los 18 restantes μ l de amplificador muestra biblioteca ed a - 20 ° DO.
82. Preparar chip de Bioanalyzer de alta sensibilidad con 1 μ l de muestra diluida y DNA
escalera.
83. Place el chip preparada en el 2100 Bioanalyzer y ejecutar dentro de 5 min después de la preparación.
El pico de destino debe oscilar desde 275 hasta 350 pb.
Molecular 84. Medir la concentración de cada muestra usando un fl uorometer Qubit. Asegúrese de utilizar la misma muestra
Diagnosis de
diluida como anteriormente para la cuanti fi cación de cada muestra en la fi urometer Qubit. Diluir la muestra
Distrofia
muscular de para obtener una concentración final de 10 nM con agua grado HPLC.
Duchenne
09.25.18

Figura 9.25.5 análisis de secuenciación de nueva generación utilizando software NextGENe. El panel superior muestra la alineación de secuencias, donde secuencia individual se
lee de muestra de paciente están alineados a la secuencia de referencia para detectar variantes. Cualquier variante presentes en la muestra se lee se registran y se muestran
resaltados por el software como se muestra en la figura. El panel inferior muestra una captura de pantalla del informe variante generó posteriormente por el software. Como se
muestra en la figura, todas las variantes detectadas en la muestra del paciente se anotan y se enumeran junto con la información extensa, que incluye la posición genómica de la
variante, su cambio de nivel de ADNc (en la llamada columna de mutación), el cambio del nivel de proteína (en la columna de ácido Amino ), la calidad (puntuación), lee la
profundidad (de cobertura), y los porcentajes de los alelos (representado como A%, C%, G%, T%).
muestras de secuencia preparada
85. dos lotes de muestras combinadas (9 + 9, total de 18 muestras) se puede secuenciar juntos en una celda de
flujo de la HiSeq2500.
86. Agregar la siguiente en un nuevo tubo etiquetado para obtener 2 nM de muestra agrupada: 10 μ l 10 nM diluyó
la muestra de un lote agrupado (9 muestras combinadas) 10 μ l 10 nM diluyó la muestra de segundo lote
agrupado (9 muestras combinadas) 80 μ l de agua de grado HPLC.
87. Añadir 10 μ l de 2 nM muestra agrupada y 10 μ l de NaOH 0,1 N a un nuevo tubo etiquetado.

Incubar durante 5 min para desnaturalizar la muestra por completo.
88. Añadir 980 μ l de tampón HT1 frío para detener la reacción de desnaturalización. Guarde este 20 pM
muestra en hielo.
89. Añadir 375 μ l de 20 pM muestra combinada y 615 μ l de tampón HT1 a una nueva etiqueta
tubo para obtener 19:05 fi muestra combinada nal.
90. Añadir 10 μ l de 20:00 solución de control Illumina PhiX a la fi muestra combinada nal a
obtener el volumen final de 1000 μ l. Vortex y centrifugado brevemente.
El control PhiX es una biblioteca de adaptador se ligó usado como control para los funcionamientos de secuenciación. Se utiliza como un
Genética Molecular
control de la hora de solucionar los problemas de alineación y problemas de generación de clúster.
clínicos
09.25.19

91. Alícuota 500 μ l de la muestra fi piscina nal a nuevo tubo y se incuba a 96 ° C durante 3 min a
asegurar la desnaturalización completa. transferir rápidamente tubo de muestra en hielo y se incuba durante 5 min en hielo.
92. Después de calentar y etapa de enfriamiento, cargar inmediatamente la fi muestra biblioteca nal en la máquina
HiSeq2500 e inicio de la secuenciación.
93. Siga las instrucciones del fabricante para las pautas de funcionamiento de la máquina HiSeq2500.
Analizar datos
94. Obtención de archivos RAW desde el secuenciador y procesarlos para eliminar las lecturas duplicadas.
95. Uso NextGENe v2.3.4 software para alinear la secuencia lee en contra de la secuencia de referencia.
96. Usando el software NextGENe, crear un informe mutación que contiene las variantes detectadas (Fig. 9.25.5).
Reactivos y soluciones
Use agua desionizada, destilada en todas las recetas y los pasos de protocolo. Para soluciones madre comunes, consulte
2D APÉNDICE ; Para proveedores, consulte PROVEEDORES APÉNDICE .
tampón de lavado CGH-array 1
25 ml 20 × solución salina-fosfato de sodio-EDTA (Fisher)

0.25 ml 20% de N-lauroilsarcosina (Sigma) 975 ml
purifica agua destilada almacenar hasta 6 meses a
temperatura ambiente
tampón de lavado CGH-array 2
5 ml 20 × solución salina-fosfato de sodio-EDTA (Fisher)

0.25 ml 20% de N-lauroilsarcosina (Sigma) 995 ml
purifica agua destilada almacenar hasta 6 meses a
temperatura ambiente
tampón de bloqueo, 10 ×
Añadir 1350 μ l de purifica el agua destilada al vial que contiene liofilizó 10 ×

agente liofilizado desde el Oligo CGH-array Kit de Hibridación / chip-on-chip (Agilent
Technologies / OGT) de bloqueo. Almacenar a - 20 ° DO.
Información de Antecedentes
COMENTARIO causa común de la enfermedad a lo largo SNVS (White et al.,

Duchenne y Becker distrofias musculares (DMD y BMD, 2006). supresiones Intragenic contribuyen a 65% de las
respectivamente) se Xlinked trastornos musculares, causadas mutaciones mientras duplicaciones representan el 6% a 10%
por mutaciones en el gen de la distrofina humana (Worton y (Beggs et al, 1990;.. Flanigan et al, 2009). Las mutaciones
Thompson, 1988). DMD se presenta generalmente en la puntuales, pequeñas supresiones e inserciones en conjunto
primera infancia con anormalidades debilidad muscular y de la representan el 30% y el 35% restante de las mutaciones
marcha proximales, mientras que la densidad mineral ósea se (Mendell et al., 2001). Hasta la fecha,> 5000 mutaciones han
caracteriza por un fenotipo más suave que implica debilidad sido identificados en personas con DMD o BMD, lo que indica
muscular de aparición tardía. La afectación cardíaca en forma su alta heterogeneidad alélica (Flanigan et al., 2009).
de cardiomiopatía es la causa clínica de la muerte de la
mayoría de los pacientes de más de veinte años para la DMD y
mediados de los años 40 de la DMO. DMD, que es el único gen DMD, se sospecha en un niño, ya sea por niveles
Molecular asociado con DMD / BMD, tiene un espectro de mutación única elevados de CK por cribado neonatal o debido a la
Diagnosis de con CNVs siendo el más presentación clínica de la DMD, siempre debe ser
Distrofia
muscular de confirmada por análisis molecular. Molecular
Duchenne confirmación no sólo
09.25.20

establece el diagnóstico de la enfermedad en el paciente, sino no es óptima para la detección de CNVs. Incluso para el análisis
que también permite la prueba de portador y la planificación de los SV, laboratorios optan por NGS requieren un fuerte apoyo
familiar para futuros embarazos. Diversas metodologías de bioinformática para el análisis de datos. Con potencial completo
pruebas moleculares se han desarrollado y puesto a disposición a de la tecnología aún no se ha capitalizado, NGS se ha
través de los años, que incluyen multiplex PCR de amplificación demostrado con éxito para servir como una prueba de
fi, análisis de transferencia Southern (Stockley et al., diagnóstico molecular integral para DMD (Wei et al., 2014). Sin
embargo, aún no se ha establecido la fiabilidad para la detección
2006), multiplex amplificador capaz sonda de hibridación CNV mediante ensayos de NGS. Por lo tanto, los laboratorios
(MAPH) (Armor et al., 2000), sonda multiplex dependiente clínicos que se están ofreciendo pruebas basadas en NGS para DMD
de ligación ampli fi cación (MLPA) (Janssen et al., 2005), hacerlo para la detección de SVs solo. Esta unidad describe los
la secuenciación de Sanger (Hamed y Hoffman, 2006), tres principales métodos de ensayo actualmente en uso para el
arrayCGH (del Gaudio et al, 2008;. Hegde et al,. diagnóstico molecular de la DMD, es decir, CGH-array,
secuenciación Sanger, y dirigido ensayo NGS.
2008), y los ensayos de NGS dirigidos (Chin et al, 2013;. Wei et
al, 2014).. Los métodos convencionales, como el análisis de
transferencia de Southern y métodos de PCR múltiplex tienen
varias limitaciones. análisis de transferencia Southern es
técnicamente difícil y consume mucho tiempo, ya que requiere
Parámetros Críticos y solución de
múltiples hibridaciones individuales para el análisis de los 79
problemas
exones del gen. Multiplex PCR, por otra parte, puede ser utilizado
para detectar deleciones especıficamente en los hombres, pero Protocolo básico 1
no es aplicable para la detección de duplicaciones y deleciones Para agilizar el procesamiento de la muestra el día a día fácil
pequeñas o para el caso, para la prueba de portador en las y más racional, laboratorios clínicos prefieren un protocolo
mujeres. MLPA ser un ensayo cuantitativo, se puede usar para unificado y un ensayo de Singleton que puede ser ampliamente
detectar tanto deleciones y duplicaciones dentro de la región de aplicable. La tecnología actual CGH-array permite esto y como
codificación del gen de la distrofina, pero de nuevo puede verse resultado la mayoría de los laboratorios realizan pruebas de
comprometida en el rendimiento en la presencia de polimorfismos supresión / duplicación en una matriz de genoma completo en
raros (SNP). Los polimorfismos (SNPs) en el sitio de destino de la lugar de en una matriz orientada de un solo gen (Hegde et al.,
sonda pueden dar lugar a resultados falsos positivos. 2008). El protocolo en esta unidad se refiere a un genoma entero
array 60K pero se puede aplicar a cualquier matrices similares con
menor o mayor densidad de la sonda. Es extremadamente crítica,
especialmente para un gen del cromosoma X como
CGH-array, que es altamente adaptable con respecto

a la densidad de la cobertura y el número de genes DMD, que las muestras de paciente y control de ADN son
interrogados, facilita el análisis de alta resolución de del mismo género. Debido a la diferencia en el número
aberraciones genómicas (Hegde et al., 2008). La alta de copias del gen en machos y hembras (una X frente a
resolución de CNVs detectado (tan pequeñas como de 1 dos cromosomas X), las intensidades de señal y por lo
kb o menos) (Askree et al., 2013) y la aproximación de tanto la cuantificación de sondas hibridadas pueden estar
los puntos de interrupción supresión / duplicación (tan sesgadas si el sexo desajuste sucede. La espiga-en
cerca como 50 a 500 pb) (Ankala et al., 2012) elogia al utilizada para cada muestra debe ser único entre
utilidad clínica y la fiabilidad de la metodología. Con muestras dentro de una única prueba para permitir la
deleciones y duplicaciones siendo las más comunes (> evaluación exhaustiva de cualquier contaminación
70%), pruebas de genética molecular para la DMD a cruzada. Aunque detectable por Spike-ins, sangrar a
menudo implica el análisis de deleción / duplicación través de una muestra en una muestra adyacente puede
preferencial por arrayCGH antes del análisis de dar lugar a resultados falsos positivos y debe ser evitado.
secuenciación para mutaciones puntuales (Flanigan et Se debe tener precaución mientras que el etiquetado de
al., 2009). Con el avance de la tecnología llegó el ensayo las muestras de pacientes y de control con dyes- Cy3
de NGS, que tiene el potencial para la detección de tinte para muestras de pacientes y el tinte Cy5 para
ambas mutaciones puntuales y CNV en un solo ensayo. muestras de control. Es crítico que las concentraciones
NGS dirigidas, equimolares de paciente etiquetados y las muestras de
control se agruparon. El agrupamiento se realiza antes
de la etapa de pre-bloqueo.
2014). A pesar de ser un enfoque altamente sensible y

rentable para el diagnóstico molecular, las capacidades de Genética Molecular
clínicos
bioinformática actuales son
09.25.21

Protocolo Básico 2 Protocolo Básico 3
Sanger de secuenciación de productos de PCR es el estándar NGS prueba es relativamente mucha mano de obra en
de oro para la detección de variantes de la secuencia. Esta unidad comparación con los otros métodos discutidos en esta unidad o
ofrece una lista completa de avance y retroceso conjuntos de en otro lugar. La sensibilidad y la versatilidad del ensayo hace
cebadores que pueden usarse para amplificar los 79 exones de que valga la pena y con un protocolo de planeado y organizado
codificación de la DMD gen junto con una región promotora y como el que se discute en esta unidad, se prevé para
mutaciones intrónicas conocidos (Tabla 9.25.2). Todos los convertirse en el ensayo más prometedor en el futuro cercano.
cebadores enumerados aquí han sido cuidadosamente diseñados Ciertas consideraciones críticas durante la manipulación de las
para evitar SNPs y se han validado a fondo para el rendimiento. Al muestras pueden asegurar rendimientos óptimos y los
igual que cualquier otra PCR, múltiples conjuntos de cebadores resultados del ensayo. En primer lugar, teniendo en cuenta el
pueden ser diseñados y utilizados para la PCR ampli fi catión; Sin número de lavados y los pasos de purificación que intervienen
embargo, se debe tener cuidado en el diseño de cebadores en la preparación de muestras, se recomienda que al menos 3 μ g
alternativo establece para garantizar que las secuencias de los de ADN de la muestra inicial se utiliza para cada muestra. Para
cebadores no tienen SNPs. Ocasionalmente, debido a la presencia evitar extensa procesamiento manual de las muestras y para
de algunos SNPs raras o variantes en un individuo, los cebadores reducir inter-run e inter-personal de variabilidad en la
pueden causar el catión amplificador falle. Esta fi catión no ampli de preparación de muestras, se recomienda el uso de robot
un exón presenta como un falso positivo para una deleción. Por lo SPRIworks de Beckman Coulter. Las burbujas de aire en el
tanto, múltiples conjuntos de cebadores se pueden usar para la cartucho de reactivos SPRIworks deben eliminarse tocando el
amplificación fi en tales casos. Alternativamente, si el laboratorio cartucho en la parte superior del banco antes de cargarlo.
tiene acceso a arrayCGH, o resultados arrayCGH anteriores, estos
hallazgos pueden ser comparados y confirmada. Aunque la adición
de M13 hacia delante (TGTAAAACGACGGCCAGT) e inverso M13
(CAGGAAACAGCTATGACC) etiquetas de secuencias de
cebadores de PCR no es crítico para el rendimiento de la PCR o Para reducir el coste asociado a la prueba y para permitir la
ensayo de secuenciación, se simpli fi ca el protocolo de opción para la interrogación en paralelo de múltiples genes,
secuenciación al permitir el uso de un único conjunto de cebadores todos con fenotipo superposición, NGS se realiza a menudo
de secuenciación para todos productos de PCR. Esto ahorra el como una prueba de panel de en vez de una única prueba de
tiempo de pipeteo, mientras que al mismo tiempo reduce las genes. DMD las pruebas se incluye a menudo en un panel
posibilidades de errores. solución TheGCbuffer es crítico para la enfermedad neuromuscular o un panel gen de la distrofia
óptima de amplificación de regiones de secuencia GCrich como el muscular. Además de la biblioteca de captura de la diana, que
exón 9 de DMD. concentraciones de cebador impropias y ADN de la incluye las sondas de encierro Xgen personalizados diseñado
muestra ciente insu fi pueden causar mala catión amplificador de (fabricado por IDT), el protocolo básico, la estrategia de análisis
productos objetivo en PCR. e interpretación variante todo siguen siendo los mismos.
Cualquier panel de NGS se debe a fondo validado y optimizado
antes de su aplicación clínica (Chin et al, 2013;. Valencia et al,
2013).. Como parte de la validación, los exones que tienen baja o
ninguna cobertura por NGS
Tabla 9.25.1 Log2 ratios esperados para la interpretación de los resultados CGH-array
Género Copiar número variante cigocidad log2 ratio
Masculino Supresión hemizygous < - 4 una
Duplicación heterocigóticos 1
Ninguna varón normal 0
Hembra Supresión heterocigóticos -1
Duplicación heterocigóticos 0.59
Supresión homocigotos < - 4 una
Duplicación homocigotos 1
Molecular
Diagnosis de Ninguna femenino normal 0
Distrofia
muscular de una deleciones hemizygous en los machos y deleciones homocigóticas en las hembras tienen una relación de log2 resultante de infinito en el lado negativo. Esto se debe a
Duchenne
log2 (0) es el infinito.
09.25.22

Tabla 9.25.2 Lista de cebadores para secuenciar los exones relacionados con DMD Gene una
exón nombre de imprimación Secuencia Tamaño (pb)
1 DMD_Ex1_F [M13F] TAAAGTTTGAAGAACTTTTACCAGGTTTT 184
DMD_Ex1_R [M13R] GTCACAAACTAAACGTTATGCCAC
2 DMD_Ex2_F [M13F] GTAAAATATGAATTATATTTAAAGTTGCTTCCTAAC 186
DMD_Ex2_R [M13R] ATAGTCCATTTTGAAAATTTCACAACTTAG
3 DMD_Ex3a_F [M13F] TAATTATGCACACTAATTATCCTTAAATATAGCT 274
DMD_Ex3a_R [M13R] GTCAGTTTCTGGTCTGAAATTCTACTAAGT
3 DMD_Ex3b_F [M13F] TAATTTCAGTTTGGGAAGCAGC 201
DMD_Ex3b_R [M13R] GTCAGTTTCTGGTCTGAAATTCTACTAAGT
4 DMD_Ex4_F [M13F] GGTTTCATTTCTAGTAGATTGTCGGTCT 215
DMD_Ex4_R [M13R] CCAAAGCCCTCACTCAAACAT
5 DMD_Ex5_F [M13F] TATTATTGCAACTAGGCATTTGGTCT 233
DMD_Ex5_R [M13R] TTGTTTCACACGTCAAGGGTAA
6 DMD_Ex6_F [M13F] CACTGAAGATCAAGGACATTCATATTTA 322
DMD_Ex6_R [M13R] GTCATCAGAGTCTAAATCACCACTTTTACA
7 DMD_Ex7_F [M13F] GCATGGAAGTAAATCTCATGGAAC 287
DMD_Ex7_R [M13R] TTGTATTTTGTGTAGAAATGACAAGTCTCA
8 DMD_Ex8_F [M13F] CCTTTAACTTTGATTTGTTCATTATCCTT 340
DMD_Ex8_R [M13R] GTGCACGTAATACCTAAAAATGCATATA
9 DMD_Ex9_F [M13F] C AGT GTAGTCCTTTCGGGTTACTTATGGTT 288
DMD_Ex9_R [M13R] G ACC ACTGAAAAATTCAAGCAAGTAAAAGCA
9 DMD_Ex9a_F [M13F] TCACCATTTCCATTTAATGTTCTG 297
DMD_Ex9a_R [M13R] AAACAAACCAGCTCTTCACGA
10 DMD_Ex10_F [M13F] CCAGTGGACAGTCCTAGCATTTTAA 374
DMD_Ex10_R [M13R] AATTGAGGAAAAAGGATGACTTGC
11 DMD_Ex11_F [M13F] CAAAACCACACCGATTTACCTAGA 357
DMD_Ex11_R [M13R] ATCAAAATAATCACAAGCTTCCAAAA
12 DMD_Ex12_F [M13F] TACATTGTGATGTTCAGTAATAAGTTGCTT 308
DMD_Ex12_R [M13R] CATCAACCATGTCATCTGTGTTACTG
13 DMD_Ex13_F [M13F] GAGATGTAGCAGAAATAAATTTCACCAT 282
DMD_Ex13_R [M13R] TACTTTTCAAGTTATAGTTCTTTTAAAGGACATAT
14 y 15 DMD_Ex14_15_F [M13F] TTTAATAAAACGTAGTTACCAATTGTTTGCTGATGC 438
DMD_Ex14_15_R [M13R] AATAGTGATAATATACAGTACTGGGTTTTTATAAGA
dieciséis DMD_Ex16_F [M13F] CTATAGTGGTGTATGGAATGCAACC 299
DMD_Ex16_R [M13R] TTAATGCAGGTTTAAAAAATCTCTGAGA
17 DMD_Ex17_F [M13F] AGCAGTCTTTACTGAAGTCTTTCTAGCA 294
DMD_Ex17_R [M13R] CTGCTGTAAATGAGTTTTCTCCACTT
18 DMD_Ex18_F [M13F] AATATAGAAGAAAGAGATAATCAAGAAATAATGACT 240
DMD_Ex18_R [M13R] GCACGGAGTTTACAAGCAGCA
19 DMD_Ex19_F [M13F] TATAATTATTGTGTAGATTCACAGTCCTTGTATT 246
DMD_Ex19_R [M13R] ATGAACCTATGTGTTTATCAAATCCCT
continuado
09.25.23

Tabla 9.25.2 Lista de cebadores para secuenciar los exones relacionados con DMD Gene una , continuado
20 DMD_Ex20_F [M13F] CAGATCATTTCTTTCAGTCTGTGG 364
DMD_Ex20_R [M13R] TGGAATGCCAAGAAATACCTATTG
21 DMD_Ex21_F [M13F] GCAAAATGTAATGTATGCAAAGTAAAC 294
DMD_Ex21_R [M13R] ACAAATAACCATTTTGGAAAATGTCA
22 DMD_Ex22_F [M13F] CATGGCAAAGTGTGAAACAATTAA 251
DMD_Ex22_R [M13R] TATCAATGTGAATGCTTGATAAGC
23 DMD_Ex23_F [M13F] CACTAAAACTCATCAATTATTATTCATCAATT 337
DMD_Ex23_R [M13R] TATCGTTAGGGAAAAAACAAGTAAATAAAA
24 DMD_Ex24_F [M13F] TGAATTGTGTTAAAAGTAATCAGCACAC 233
DMD_Ex24_R [M13R] CTAACCAAATAATATTCATACAAAATTATTCATATT
25 DMD_Ex25_F [M13F] CTAATATGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 270
DMD_Ex25_R [M13R] CATTAGGAAATCTTAGTTAAGTACGTTGAG
26 DMD_Ex26a_F [M13F] TATAATAATAATGTTTCATCACTGTCAATAATCG 316
DMD_Ex26a_R [M13R] GTATACAACTTCAAGCATTGTTGCAT
26 DMD_Ex26b_F [M13F] TATAATAATAATGTTTCATCACTGTCAATAATCG 271
DMD_Ex26b_R [M13R] TTTACCTTCATCTCTTCAA
27 DMD_Ex27_F [M13F] ATGCATTTTGGATGTAAAGTTATTTTCA 297
DMD_Ex27_R [M13R] CACATATGACCATGTATTGACATATCATT
28 DMD_Ex28_F [M13F] ATTTCACATTTACTTTTCTACCATAATATTTAATC 256
DMD_Ex28_R [M13R] GGTACTTGACCTCTTTTAATACTGCATATAA
29 DMD_Ex29_F [M13F] GATAATCCAATGTATTTAGAAAAAAAAGGAG 303
DMD_Ex29_R [M13R] GTATCTGCTATACATTAATGCAAATTAGATTAAA
30 DMD_Ex30_F [M13F] TTACAGAAAAGCTATCAAGAGTAAACATTTAAC 317
DMD_Ex30_R [M13R] CAACATTTTGTTGAAGTAATAAAAACAAAAG
31 DMD_Ex31_F [M13F] CTTGGAAAGTTAGTTGTTCTTTGTAGAG 231
DMD_Ex31_R [M13R] ATAGACTGGAGTATAATGCCCAACGAAAACACG
32 DMD_Ex32_F [M13F] TAGGACCAGTTATTGTTTGAAAGGC 295
DMD_Ex32_R [M13R] TTACTTCTTAATGAGGAAAGTCAAGGG
33 DMD_Ex33_F [M13F] ATTATGAAATAATTTAACTCTACTGATTATCATGTT 274
DMD_Ex33_R [M13R] GTTGCTTTACAATTTATAAGGAAAGTGGA
34 DMD_Ex34_F [M13F] TTATAACGAAATTTGAATTAAAGAGTAAACTAAA 291
DMD_Ex34_R [M13R] AAAATCATATTATGTGTTTTCACGTATGTTC
35 DMD_Ex35_F [M13F] AAGCATTAAATCTTAAGACTACA 300
DMD_Ex35_R [M13R] CTTATGTATCTTTTTCTCGTGACAGAGAA
36 DMD_Ex36_F [M13F] TTCTTTAAGAATATTGTCTAACCAATAATGC 245
DMD_Ex36_R [M13R] AAGATGATTGAAGTAACTGGTGTACAATTTG
37 DMD_Ex37_F [M13F] TCTATCTTGACCTTCATTAATTACTAACTTCA 286
DMD_Ex37_R [M13R] CCTTCGCAAGAGACCATTTAGC
38 DMD_Ex38_F [M13F] TGGTTTATGTTTCTAATAAAAAGTAATTTTGATT 243
DMD_Ex38_R [M13R] TCTTTCCAAATATTTATTTCCACTCCTA
continuado
09.25.24

38 DMD_Ex38b_F [M13F] GCATCCTCAGGTACTTTTCCA 335
DMD_Ex38b_R [M13R] TGTGCTCTGAAAATTCAGTTGG
39 DMD_Ex39_F [M13F] TTAACAATGTACAGCTTTTTAAAAACCAA 267
DMD_Ex39_R [M13R] CATTATATTTTACCCTATATATTAAAAAAAAACCAC
40 DMD_Ex40_F [M13F] CAGCCAGAAGTGCACTATACATATATATTG 274
DMD_Ex40_R [M13R] CTTCACAGGTTAATTAAACTGTATAATAAAATCTG
41 DMD_Ex41_F [M13F] GCAAGTCGGTTGATGTGGTTAG 303
DMD_Ex41_R [M13R] GCCTCTGTTAATAGAGTAGTAGTTGCAAA
42 DMD_Ex42a_F [M13F] AATGGAGGAGGTTTCACTGTTAGG 409
DMD_Ex42a_R [M13R] TGAAGCCAACCACACTATCAAGTA
42 DMD_Ex42b_F [M13F] TTGTTCTTTTGTATATCTATACCAGCAC 237
DMD_Ex42b_R [M13R] TACCTTCAGAGACTCCTCTTGC
43 DMD_Ex43a_F [M13F] TATAGACAGCTAATTCATTTTTTTACTGTTTTAAA 279
DMD_Ex43a_R [M13R] TTCCCTGAAAACAAATCATTTCTG
43 DMD_Ex43b_F [M13F] ATATTACAGAATATAAAAGATAGTCTACAACAA 273
DMD_Ex43b_R [M13R] TTCCCTGAAAACAAATCATTTCTG
44 DMD_Ex44_F [M13F] TCTATAATCTGTTTTACATAATCCATCTATTTTTCT 268
DMD_Ex44_R [M13R] TAAAGAGTCCAGATGTGCTGAAGATAA
45 DMD_Ex45_F [M13F] CTCAAATAAAAAGACATGGGGCTT 284
DMD_Ex45_R [M13R] GCTTAAAAAGTCTGCTAAAATGTTTTCA
46 DMD_Ex46_F [M13F] ATAGTTTGAGAACTATGTTGGAAAAAAAAA 265
DMD_Ex46_R [M13R] AATAGATTCATATACTTCTTTATGCAAGCAG
47 DMD_Ex47_F [M13F] CAAGGTAGTTGGAATTGTGCTGTAA 269
DMD_Ex47_R [M13R] TACATACAAATACTTGCAACATTTAACACA
48 DMD_Ex48a_F [M13F] TAAACATTTTGGCTTATGCCTTG 320
DMD_Ex48a_R [M13R] AAATGAGAAAATTCAGTGATATTGCC
48 DMD_Ex48b_F [M13F] TAAACATTTTGGCTTATGCCTTG 320
DMD_Ex48b_R [M13R] CCTACCTTAACGTCAAATGG
49 DMD_Ex49_F [M13F] TAATTTTATTGCTAACTGTGAAGTTAATCTG 217
DMD_Ex49_R [M13R] CAACAGGGGAAGCATAACCCATTATGA
50 DMD_Ex50_F [M13F] TCATGAATTATCTTCAAAGTGTTAATCG 228
DMD_Ex50_R [M13R] CATAGTTGCACTTTTGAACAAATAGCTAG
51 DMD_Ex51_F [M13F] AATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTCTA 383
DMD_Ex51_R [M13R] GAGTAAAGTGATTGGTGGAAAATCT
52 DMD_Ex52_F [M13F] ATGTAAAAGGAATACACAACGCTGA 235
DMD_Ex52_R [M13R] TATTGAAACTTGTCATGCATCTTGC
53 DMD_Ex53_F [M13F] ATTTGTAAATAGAATTCCTCCAGACTAGC 341
DMD_Ex53_R [M13R] ATCTATGGTATAATTTTATCAAATGTAACCAGT
53 DMD_Ex53b_F [M13F] CTGTTGTTCATCATCCTAGCCA 524
DMD_Ex53b_R [M13R] TGTTCATTTCAGCTTTAACGTGA
continuado
09.25.25

54 DMD_Ex54_F [M13F] AACTAGAGATTTCATAAAAAAAACTGACATTC 273
DMD_Ex54_R [M13R] CCAGTTTCACCACCCCATTATTA
55 DMD_Ex55_F [M13F] TTCACTAGGTGCACCATTCTGATAT 350
DMD_Ex55_R [M13R] ACTATTTTGTTTTGTCCCTGGCTT
56 DMD_Ex56_F [M13F] CATCGCTTGTTTCTTTTGTTTG 285
DMD_Ex56_R [M13R] ATTTGGCCATTTTAATTCATTTGTG
57 DMD_Ex57_F [M13F] C AGT CAATGGAATTGTTAGAATCATCAATTACAC 271
DMD_Ex57_R [M13R] G ACC GTCACTGGATTACTATGTGCTTAACATG
57 DMD_Ex57b_F [M13F] TTTTTCAATGGAATTGTTAGAATCA 450
DMD_Ex57b_R [M13R] GCCAAAAGAGATGGACGATT
58 DMD_Ex58_F [M13F] ATTAATTTTGAGAAGAATGCCACAAG 221
DMD_Ex58_R [M13R] CGTCACCACTGATCCTTCTATCA
59 DMD_Ex59_F [M13F] TTGACAATGTTTAAAAAAAAAGAATGTG 336
DMD_Ex59_R [M13R] CAGATTAGAAGCTCTTTTGAGTCTCTCA
60 DMD_Ex60_F [M13F] TCAGTTCTTCTTGTTTTAAATATTCTCATCT 325
DMD_Ex60_R [M13R] TCCTATCCTCACAAATATTACCATGAA
61 DMD_Ex61_F [M13F] ACATTGTTTTAATTGTTCCTCATTATATAGAA 207
DMD_Ex61_R [M13R] ACTGTTATTCTTATTAATCAAGATGCAATAAAG
62 DMD_Ex62_F [M13F] CCTGTTTGCGATGAATTTGACC 170
DMD_Ex62_R [M13R] ACAGGTTAGTCACAATAAATGCTCTTTTA
63 DMD_Ex63_F [M13F] TCTTGACTACTCATTGTAAATGCTAAAGTC 175
DMD_Ex63_R [M13R] CTACTTTATCCTAAAGGTCACCTGTCATT
64 DMD_Ex64_F [M13F] TTGTCTGTTATTTCTGATGGAATAACAA 178
DMD_Ex64_R [M13R] CTAAGCAAAGACATAGTATCAAGATCTTCA
sesenta y cinco DMD_Ex65_F [M13F] GACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTT 321
DMD_Ex65_R [M13R] CATTCTGTACGCTAAGCCTCCTG
66 DMD_Ex66_F [M13F] AAGTGTTTACCCTCTAGGAAAGGGT 206
DMD_Ex66_R [M13R] AGAACTAGGGTAATTAGCCAACATTAATAAA
67 DMD_Ex67_F [M13F] GAATTGAGTTGGATGTCAGGTTC 352
DMD_Ex67_R [M13R] CATACCTACTGCCTACTGAAGAGCT
68 DMD_Ex68a_F [M13F] ATCTTGCCTTCTTTCCTTTCATCC 310
DMD_Ex68a_R [M13R] TGGCACAGGAGATAAAAGATCAA
68 DMD_Ex68b_F [M13F] ATCTTGCCTTCTTTCCTTTCATCC 276
DMD_Ex68b_R [M13R] TTGGTTCCTAATACCTGAATCCAAT
69 DMD_Ex69_F [M13F] GTGTTCTTTGGGAATTTGATTCG 232
DMD_Ex69_R [M13R] ACAAAACTGAAATTTATCCCAGGTG
70 DMD_Ex70_F [M13F] TGGTCATTAGTTTTGAAATCATCCTG 257
DMD_Ex70_R [M13R] CTGAGAGGAGTTCAAATATACATCAAACA
71 DMD_Ex71_F [M13F] CGGCTGAGTTTGCGTGTGTC 143
DMD_Ex71_R [M13R] AAGCGAGCGAATGTGTTGGT
continuado
09.25.26

72 DMD_Ex72_F [M13F] CAGT GTGGGTTTTTTCTCCATTAATGG 186
DMD_Ex72_R [M13R] G ACC TAGCTTTCCTTGGTTAGTTATTTCA
72 DMD_Ex72a_F [M13F] AAAAGCATTCTAGGCCATGTG 344
DMD_Ex72a_R [M13R] ATGCACGTTAGAGGGCAAGT
73 DMD_Ex73_F [M13F] GTCTTGAATAGATTCTAAGACGTCACATAAG 184
DMD_Ex73_R [M13R] ATCCCTCAAAGCAATTTCATTGT
74 DMD_Ex74_F [M13F] CTAACCCCCAAAGCAAAATAAGG 284
DMD_Ex74_R [M13R] ACTTTTCTATGTGTGCAAGTGTATGC
75 DMD_Ex75a_F [M13F] TACCATGGTATATAAAATTTGGTGATGATAT 402
DMD_Ex75a_R [M13R] AGTTTTGTTTAAGAGGGAAAAATG
75 DMD_Ex75b_F [M13F] ATGCCAATAGGAATCTGCAAG 303
DMD_Ex75b_R [M13R] ATCTCTCTCCTCACTTGCTCCA
76 DMD_Ex76_F [M13F] AATTTATACATTTGTATGTTTATTATGAAAAGTAATT 243
DMD_Ex76_R [M13R] TGTAATACGACTCTACCTTTCTTCAGACAACA
77 DMD_Ex77_F [M13F] CCTTTAATATCTGTTTTCTATAAATGTAATTTTC 213
DMD_Ex77_R [M13R] TAGGGAAGCGAGTGGCCTGA
78 DMD_Ex78_F [M13F] GATATTTATGCATGTTTTTTTTCCCTT 156
DMD_Ex78_R [M13R] ACATAAAAAGCAGGATGAGACAGACAG
79 DMD_Ex79_F [M13F] ATGCTATCTATCTGCACCTTTTGTAA 149
DMD_Ex79_R [M13R] GACTCCATCGCTCTGCCCAA
Promotor DP427m_1_F [M13F] CAAATGGTACAATAAAAACACTCAAAC 833
DP427m_1_R [M13R] GGACATAGTACTTGCTTTTAAAGCC
Promotor Dp427m_2_F [M13F] TCTGGGCATTCCTTTTTATTTGGTA 490
Dp427m_2_R [M13R] CGAAGGTAATTGCCTCCCAGATC
Promotor Dp427m_3_F [M13F] CCTGGCATCAGTTACTGTGTTGACT 615
Dp427m_3_R [M13R] ATAACTCAGATATACAAACTATCTCACAGCAATC
intrón 1 DMD_In1_F [M13F] TGGGTAGATGCCACATTCAA 349
DMD_In1_R [M13R] GGGAACGACAAGGAGAACAA
intrón 9 DMD_In9_F [M13F] CTGGGCAGGAAGAGCAATACT 281
DMD_In9_R [M13R] CATTTTTCACTACAACAGATCAGGG
intrón 25 DMD_In25_F [M13F] GACCTTATGTCTGTTATATGTACTAAGAATTTGT 261
DMD_In25_R [M13R] TTTTTACCGCATCGTCTTCTTC
intrón 60 DMD_In60_F [M13F] TGACTCTTTATGGCCCAAATTG 269
DMD_In60_R [M13R] TCAGTATTCCTCTAATTGGCAGTCTT
intrón 62 DMD_In62_F [M13F] CTCCAGGGTTTATTCATGTAATTGA 568
DMD_In62_R [M13R] GCAATATAAACATTATTCGGTTCCA 833
una Primer secuencias fueron proporcionados por Emory Laboratorio de Genética de la Universidad de Emory, Atlanta, Georgia. Cebadores incluyen etiquetas M13 para la comodidad de la secuenciación de los productos
de ampli fi cados. secuencia de M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT; secuencia M13R: CAGGAAACAGCTATGACC. Muscle específica
DMD promotor y ciertas regiones intrónicas (para detectar variantes intrónicas conocidos) también se analizan como parte de la prueba secuenciación fi c gen-específico.
09.25.27

se identifican usando algoritmos de análisis de NGS. La algunos (y por tanto de DMD) aparecerá homocigotos (o más
cobertura generalmente se refiere a leer profundidad o el apropiadamente, hemizygous) para cualquier variante de
número de único lee que un nucleótido particular, está secuencia, mientras que las mujeres portadoras son
representado por. Para los paneles de NGS dirigidas, heterocigotos (ver Fig. 9.25.4). El análisis de secuencia también
una cobertura de al menos 15 a 20 veces (optimizados puede detectar SVs adicionales de patogenicidad incierta, que
individualmente mediante la realización de laboratorio) se puede incluir variantes fi cos población privadas o benignas.
establece como el punto de corte y cualquier exón o Análisis de muestras de los padres y familiares pueden ayudar a
amplicón con incluso un solo nucleótido con <15 a 20 predecir la importancia clínica de estas variantes; Sin embargo,
veces la cobertura se considera un lowcoverage exón esto puede ser considerado sólo en individuos que son de otra
(Chin et al., 2013). Los exones de bajos o no-cobertura manera negativa para cualquier CNV patógenos o SV.
generalmente incluyen regiones ricas en GC, rica en AT
regiones, regiones con alta homología, o con una
composición compleja secuencia, y deben ser Sanger
Consideraciones de tiempo
secuenciaron. Primeros exones de los genes, la mayoría
Para protocolo básico 1, el aislamiento de ADN
de los cuales son altamente GCrich, casi siempre son
generalmente tarda de 3 hr. etiquetado fluorescente requiere
difíciles de secuenciar por NGS y tienen baja o ninguna
3 horas para completar. Pre-bloqueo tarda de 2 a 3 h. La
cobertura.
hibridación requiere 24 hr incluyendo la etapa de incubación
durante la noche. Lavado y escaneo tarda 1 día adicional
para completar CGH-array. El experimento global array-CGH
requiere 4 a 5 días, dependiendo del número de la muestra.
Protocolo Básico 2 requiere un total de 2 días para secuenciar

resultados previstos
completamente 79 exones por secuenciación de Sanger en un formato
Como se ha discutido en esta unidad y en otra parte (Flanigan et al.,
de 96 pocillos PCR.
2009), se espera que CGH-array para detectar mutaciones causales y
Para Protocolo Básico 3, el cizallamiento del ADN toma 3 hr
establecer el diagnóstico molecular en tanto como 70% a 75% de los casos
incluye la etapa fi cación DNAquanti inicial de nueve muestras.
de DMD. Por lo tanto, sólo una cuarta parte de los individuos con DMD se
Después de cizallamiento del ADN, la carrera Bioanalyzer se
hace referencia para los ensayos de secuenciación para la detección del
llevará a 2 hr. preparación Biblioteca con SPRIworks requiere un
punto de mutación. Deleciones y duplicaciones pueden ambos ser
total de 6 h. Ampli fi cación de la biblioteca toma 4 hr incluyendo
detectados por CGH-array basado en el cambio en las intensidades de
la carrera Bioanalyzer. La etapa de hibridación requiere 24 hr.
sondas hibridadas (ver Figs. 9.25.2 y 9.25.3). ratios de registro previstos
Los pasos posteriores a la hibridación requieren 2 días
para cada uno de los diferentes CNVs anticipada se enumeran en la Tabla
adicionales.
9.25.1. La deleción o duplicación tamaño observado es una aproximación
basada en la localización de las sondas a lo largo del gen. sondas fi ciente
no pueden ser diseñados en ciertas regiones intrónicas y por lo tanto

Literatura citada
cualquier CNVs en esta región no pueden ser detectados. De vez en
Ankala, A., Kohn, JN, Hegde, A., Meka, A.,
cuando, mosaicismo para CNVs puede estar presente y detectados por
Efrén, CL, Askree, SH, Bhide, S., y Hegde, MR 2012.
CGH-array. En tal escenario, el ADN extraído se recomienda el tejido
aberrante anillo fi de orígenes de replicación potencialmente
muscular fromdystrophic para la determinación de la CNVs exacta. Además, explica reordenamientos alquiler nonrecur- intragenic dentro de
translocaciones cromosómicas no pueden ser detectados por CGH-array y los genes, incluyendo el gen de la DMD humana. Genome Res. 22:
necesitan cariotipo o análisis de bandeo G. En raras ocasiones, debido 25-34. Armor, JA, Sismani, C., Patsalis, PC, y Cross,
tomisbehaving o sondas no óptima de hibridación, se pueden observar

G. 2000. Medición de locus número de copias por
falsos positivos hallazgos de la CNV. De las diferentes variantes de
hibridación con ampli fi sondas capaces. Nucleic Acids Res. 28:
secuencia o mutaciones puntuales detectado por secuenciación de Sanger y
605-609. Askree, SH, Chin, EL, Bean, LH, café, B.,
dirigido ensayo basado en NGS, mutaciones sin sentido comprenden la
mayoría, mientras que otras mutaciones que truncan como frameshift

Tanner, A., y Hegde, M. 2013. Límite de detección de deleciones
causando inserciones, deleciones, o indeles vienen a continuación. Los intragénicas con la hibridación genómica comparativa matriz
hombres con una copia de la X cromo- translocaciones cromosómicas no específica com-. BMC Genet.
pueden ser detectados por CGH-array y necesitan cariotipo o análisis de 14: 116.
bandeo G. En raras ocasiones, debido tomisbehaving o sondas no óptima Beggs, AH, Koenig, M., Boyce, FM, y Kunkel,
de hibridación, se pueden observar falsos positivos hallazgos de la CNV. De LM 1990. La detección de 98% de DMD / BMD deleciones de genes
por reacción en cadena de la polimerasa.
las diferentes variantes de secuencia o mutaciones puntuales detectado por
Tararear. Gineta. 86: 45-48. Chin, EL, da Silva, C., y Hegde,
secuenciación de Sanger y dirigido ensayo basado en NGS, mutaciones sin
Molecular M. 2013. As-
sentido comprenden la mayoría, mientras que otras mutaciones que truncan
Diagnosis de sessment de sensibilidad analítica clínica y la especificidad de la
Distrofia como frameshift causando inserciones, deleciones, o indeles vienen a
secuenciación de próxima generación para de- tección de
muscular de continuación. Los hombres con una copia de la X cromo- translocaciones mutaciones simples y complejos. BMC Genet. 14: 6.
Duchenne
cromosómicas no pueden ser detectados por CGH-array y necesitan cariotipo o análisis de bandeo G. En raras ocasiones, debido tomisbehaving o sondas no óptima de hibridación, se pueden observa
09.25.28

Del Gaudio, D., Yang, Y., Boggs, BA, Schmitt, Mehler, MF 2000. distrofina cerebro, Neurogenética
ES, Lee, JA, Sahoo, T., Pham, HT, Wiszniewska, J., y el retraso mental. Brain Res. Brain Res. Rdo. 32: 277-307.
Chinault, AC, Beaudet, AL, y Eng, CM 2008. Diagnóstico
molecular de la distrofia muscular de Duchenne / Becker:
Mendell, JR, Buzin, CH, Feng, J., Yan, J., Ser-
detección hanced En- de gen de la distrofina mentos
rano, C., Sangani, DS, Wall, C., Prior, TW, y Sommer, SS
rearrange- por hibridación de oligonucleótidos nómica ge-
2001. El diagnóstico de distrofia por la detección mejorada de
array-comparativa. Tararear. Mutat. 29: 1100-
pequeñas taciones mu-. Neurología 57: 645-650. Stockley,
1107. TL, Akber, S., Bulgin, N., y Ray,
Flanigan, KM, Dunn, DM, von Niederhausern,

PN 2006. Estrategia para la prueba ular molec- integral de
A., Soltanzadeh, P., Gappmaier, E., Howard,
Duchenne y Becker distrofias musculares. Gineta. Prueba. 10:
MT, Sampson, JB, Mendell, JR, Pared, C., Rey, WM,
229-243. Valencia, CA, Ankala, A., Rhodenizer, D., Bhidé,
Pestronk, A., Florencia, JM, Con- nolly, AM, Mathews, KD,
Stephan, CM, Laubenthal, KS, Wong, BL, Morehart, PJ,
Meyer, A., Finkel, RS, Bonnemann, CG, Medne, L., Día, JW, S., Littlejohn, MR, Keong, LM, Rutkowski,
Dalton, JC, Margolis, A., Sparks, S., Bonnemann, C., y Hegde, M.
2013. Análisis Comprehensivemutation para la distrofia
MK, Hinton, VJ, y Weiss, RB 2009. Mu- espectro tational de muscular congénita: Un enriquecimiento y de próxima
mutaciones en pacientes con DMD trophinopathy disfunciones: generación sequenc- ing panel basado en PCR clínica. Más
Aplicación de técnicas modernas de diagnóstico a una gran uno 8: e53083. Wei, X., Dai, Y., Yu, P., P., N., Lan, Z., Hong,
cohorte. Tararear. Mutat. 30: 1657-1666.
X., Sun, Y., Yang, G., Xie, S., Shi, Q., Zhou,
Hamed, SA y Hoffman, EP 2006. Automated H., Zhu, Q., Chu, Y., Yao, F., Wang, J., He, J., Yang, Y.,
cribado secuencia de todo el ADNc de distrofina en la Liang, Y., Qi, M., Yang, L., Wang, W., Wu, H., Duan, J.,
distrofia Duchenne: detección de mutaciones Point. A.m. J. Shen, C., Cui, L., y Yi, X.
Med. Gineta. B. Neuropsychiatr. Gineta. 141B: 44-50. 2014. Targeted secuenciación de próxima generación como una
prueba integral de los pacientes con y mujeres portadoras de
DMD / BMD: estudio agnóstico Un multi-di- población. EUR. J.
Hegde, MR, Chin, EL, Mulle, JG, Okou,
DT, Warren, ST, y Zwick, ME detección de mutaciones Hum. Gineta. 22: 110-118. Blanco, SJ, Aartsma-Rus, A., Flanigan,
basados en la Microarray 2008. En el gen de la distrofina. Tararear. KM,

Mutat. 29: 1091- Weiss, RB, Kneppers, AL, Lalic, T., Janson,
1099. AA, Ginjaar, HB, Breuning, MH, y den Dunnen, JT 2006. Las
duplicaciones en el gen DMD. Tararear. Mutat. 27: 938-945.
Janssen, B., Hartmann, C., Scholz, V., Jauch, A.,
Worton, RG y Thompson, MW 1988. Genética
y Zschocke, J. 2005. MLPA análisis para la detección de
deleciones, duplicaciones y reordenamientos complejos en el
gen de la distrofina: potencial y trampas. Neurogenética 6: de la distrofia muscular de Duchenne. Annu. Rev. Genet. 22:
29-35. 601-629.
Genética Molecular
clínicos
09.25.29

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Molecular Diagnosis de distrofia muscular UNIDAD 9,25

1 Departamento de Genética Humana de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory, Atlanta, Georgia

comparativos arrays de hibridación genómica

secuenciación basada en PCR

suplemento 83 Current Protocols in Human Genetics

Oligo CGH-array / Kit de Hibridación chip-on-chip (Agilent Technologies / OGT)

10 × tampón de bloqueo (liofilizado agente de bloqueo, ver receta)) Hi-RPM tampón de

Estabilización y solución de secado (Agilent Technologies)

NanoDrop espectrofotómetro Branson

barras de agitación magnética y placa de agitación

Current Protocols in Human Genetics suplemento 83

muestras de ADN de etiquetas con fluorescencia

ajustes en un Branson Soni fi er 450:

Ciclos de trabajo: constante de

control de salida: tiempo 4

18 μ l esquilada muestra de ADN de paciente DMD (30 ng / μ l) 1 μ l espiga-en 10 μ l de

durante al menos 5 min a 4 ° DO.

10 μ l dCTP mezcla de marcaje 1 μ l Cy3-dCTP o Cy5-dCTP

de Cy5 maestro etiquetado mezclar para controlar tubo de muestra de ADN.

suplemento 83 Current Protocols in Human Genetics

11. Retirar la placa de colector y reconstituir puri muestra fi ed mediante la adición de 22 μ l

muestras marcadas Pre-bloque

16. Lugar de PCR tiras de tubos en un termociclador e incubar 3 min a 95 ° C y 30 min a

Hibridar muestras pre-bloqueados

17. Antes de iniciar la hibridación, comprobar que la temperatura de la 65 ° C hibridación

Current Protocols in Human Genetics suplemento 83

libremente dentro de la junta.

Golpear suavemente la cámara en el mostrador de garantizar un libre flujo de la muestra.

23. Coloque la cámara de SureHyb en el 65 ° C horno de hibridación. Asegúrese de encender

24. Hibridar desliza durante al menos 16 horas o durante la noche.

Realizar lavado post-hibridación

suplemento 83 Current Protocols in Human Genetics

diapositivas cuidadosamente separados de las juntas.

min en la campana de humos.

barra de agitación magnética dentro de la jarra.

con agitación suave.

solución durante 30 segundos.

Current Protocols in Human Genetics suplemento 83

Escanear diapositivas y analizar datos

BigDye Terminator v3.1 reacción Ready Mix M13 hacia

Nanodrop espectrofotómetro de 96 pocillos placa de

suplemento 83 Current Protocols in Human Genetics

Amplificar gen DMD mediante PCR

amplificar todas las reacciones):

5.0 μ l 10 × tampón de PCR con MgCl 2 ( Roche)

5. Añadir 2 μ l de 5 μ M cebador directo y 2 μ l de 5 μ M correspondiente cebador inverso

1 ciclo de: 3 min 95 ° C (desnaturalización)

35 ciclos: 15 sec 95 ° C (desnaturalización)

Purificar PCR productos ampli fi cación de 79 exones del gen de DMD

7. Después de la PCR ampli fi cación, centrifugar la PCR placa de 30 seg.

un nuevo placa de 96 pocillos PCR.

Current Protocols in Human Genetics suplemento 83

1.75 μ l 5 × El tampón de secuenciación

0.5 μ l BigDye Terminator v3.1 mezcla de reacción listo

Siempre mantenga BigDye Terminator v3.1 Ready Mix protegido de la luz.

Eliminar terminador de colorante de las muestras de reacción de secuenciación de ciclo

una centrifugadora. Centrifugar durante 5 minutos a 850 × sol.

Realizar secuenciación capilar

La melatonina mejora la calidad de secuenciación mediante la estabilización de la reacción de secuenciación.

suplemento 83 Current Protocols in Human Genetics

El agua destilada, grado HPLC 1 × bajo TE tampón (Life

Current Protocols in Human Genetics suplemento 83

SeqCap EZ hibridación y Kits de lavado (Nimblegen) que contiene:

2.5 × Bead Wash Buffer (Nimblegen) xGen mezcla