TP:ACIDOS NUCLEICOS

Alumno:
Fedra Salvador Cardenas

Docentes:
Altube Julia
Alejo Gianotti

Universidad Nacional de Quilmes

19/12/2018
INTRODUCCION

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas

de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la
molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos
unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están
integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una
base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de
los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante
enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las
bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de
hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal (Figura 1).
Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo
que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente
polar, características que son aprovechadas para su extracción. Los
grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su
carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones
acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula.
Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan
expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la
unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas
entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite.
Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a
moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente.

La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar

moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los
materiales más comunes para separar moléculas de ácidos
nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos
geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un
tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA
o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo ya
que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas
cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA
de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel de
electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va
a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular.
Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido
porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las
muestras de DNA problema.

RESUMEN

En este trabajo práctico se realizó el aislamiento de ADN de una

levadura (saccharomyces cereviciae), para esto se usó un método
de ruptura celular llamado LISIS el cual consiste en la ruptura de la
pared celular de las levaduras por medio de ciclos de
congelamiento/descongelamiento.

Para el análisis del ADN extraído se usó el método una

electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polímero
extraído de algas, el cual tiene distintos polímeros que interactúan
entre si mediante enlaces no covalentes, generando así un gel
poroso.

OBJETIVOS

1-Aislamiento de ADN de la levadura Saccharomyces Cerevisiae

2-Reconocimiento y Evaluación de la extracción por medio del

la electroforesis en geles de agarosa

3-Conocer los métodos de extracción, purificación y

reconocimiento de ADN

MATERIALES Y MÉTODOS

● Micropipetas:p-1000 y p-200
● Tubos eppendorf de 1.5ml
● Transiluminador
● Centrifugadora
● Vortex
● .buffer de lisis
● Cultivo YPD
● Etanol
● Cloroformo

PROCEDIMIENTO

1-Se transfieren 1,5 ml de cultivo a un tubo Eppendorf y se

centrifuga durante 5 minutos a 14000 RPM.

2-Se agregan 200 μL de buffer de lisis (al pellet)

Agitación en Vórtex

3-Se realiza una Incubación a -80 ªC durante 2 minutos y luego se

lleva la muestra a 100 grados centígrados durante 1 minuto.

4-Se homogeniza la mezcla y se agregan 200 μL de cloroformo y

se realiza la agitación en Vortex

5-Se centrifuga 3 minutos a 14000 RPM y se transfiere a un nuevo

tubo eppendorf la superior acuosa.Posteriormente se agregan 400
μL de etanol y se mezcla.

6-Se incuba 5 min a -20 ª C, se centrifuga 5 min y se extrae el

líquido dejando precipitar el ADN.Luego se agregan 500 μL de
etanol al 70% , se centrifuga nuevamente por 5 minutos.Se descarta
el liquido dejando el ADN precipitado.
7-Luego se dejó secar el tubo eppendorf que contenía el ADN a
temperatura ambiente. Después se agregó 50 ul de buffer TE al
tubo eppendorf con una p-200ul.

8-Finalmente se dispuso a realizar la electroforesis, primero

sembrando con una p-20, 2 ul de ADN en el gel de agarosa al
0.8%(p/v) teniendo como colorante Syber Green el cual es
manifestado en calor. Luego se dejó correr el gel durante 45 min; y
después se reveló el gel en un transiluminador UV.

RESULTADOS

En función de lo antes descrito se obtuvo la siguiente imagen de la

electroforesis del ADN en el gel de agarosa

En la imagen se observa el corrimiento de las muestras sembradas

hacia el cátodo(+), esto se debe a que el ADN tiene carga negativa
procedente de los grupos fosfatos que están en su parte exterior por
la afinidad con la fase acuosa.

La imagen obtenida es poco nítida se podría decir que hay restos

de ARN en el revelado.
CONCLUSIÓN

Proceso de extracción de ADN mediante un método simple y rápido.

Se logró evaluar y conocer las técnicas de extracción ,sin embargo
no se pudo confirmar el éxito de la electroforesis por posibles
errores en el sembrado.