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Gabriela Vasconcelos de Andrade Alves
Caracterização Hematológica e Imunofenotípica em

Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda
Tese apresentada á Universidade Federal do

Rio Grande do Norte – RENORBIO (Rede
Nordeste de Biotecnologia) para obtenção do
Título de Doutora em Biotecnologia da Saúde
pelo programa de pós-graduação em
Biotecnologia.
Natal/RN
2012
Caracterização Hematológica e Imunofenotípica em Pacientes

com Leucemia Linfoblástica Aguda
Tese apresentada á Universidade Federal do

Rio Grande do Norte – RENORBIO (Rede
Nordeste de Biotecnologia) para obtenção do
Título de Doutora em Biotecnologia da Saúde
pelo programa de pós-graduação em
Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia em Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso

Cavalcanti Júnior.
Natal/RN
2012
UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede.
Catalogação da Publicação na Fonte.
Alves, Gabriela Vasconcelos de Andrade.

Caracterização hematológica e imunofenotípica em pacientes com
leucemia linfoblástica aguda / Gabriela Vasconcelos de Andrade Alves. –
Natal, RN, 2012.
214 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Centro de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
1. Leucemia Linfóide Aguda - Tese. 2. Citometria de fluxo - Tese. 3.

Imunofenotipagem - Tese. 4. Biotecnologia - Tese. I. Cavalcanti Júnior,
Geraldo Barroso. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Rede Nordeste de Bioteconologia (Renorbio). IV. Título.
RN/UF/BCZM CDU 616.155.392

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA - RENORBIO/UFRN
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
Chefe do Departamento: Telma Maria Araújo Moura Lemos
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo
iv

Caracterização Hematológica e Imunofenotípica em Pacientes

com Leucemia Linfoblástica Aguda
v
Dedico este trabalho a DEUS que fornece a ENERGIA
que guia e conduz os meus dias com saúde e confiança
por cada conquista alcançada, e me ter permitido cumprir
mais esta etapa; à nossa família, em especial ao meu
marido, Yuri, sempre parceiro e grande companheiro, que
sempre acredita que posso mais do que eu acho que
posso, incentivando as minhas escolhas. Ao nosso filho
lindo e muito amado, Murilo, que trouxe muita luz que vem
iluminando nossos dias e nossos caminhos.

vi

Agradecimento Super Especial
Ao meu ex-professor da disciplina de Imunologia Clínica do curso de Farmácia e

Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN, depois parceiro e amigo no INCA/RJ e hoje
orientador desta Tese de Doutorado, Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, mais
conhecido como Gerald, agradeço aos bons caminhos da vida por tê-lo conhecido
no início da minha vida acadêmica, pois promoveu o intercâmbio com o INCA/RJ,
situação que proporcionou o desenvolvimento da minha dissertação. Nossa relação
tem uma afinidade natural que abrange a formação de melhores seres humanos. Esse
é o meu compromisso que aprendi com você, Gerald. Nunca desestimular ou tirar os
sonhos de alguém, pois a evolução é um processo natural para todos, não importa
quão lenta ela seja.
Além disso tudo, é um “Doutor”, ou como queira dizer, um “senhor” orientador,
estudioso e incentivador dos projetos que realiza, promovendo bem estar pelo
profissionalismo, dinamismo e alto astral com que lida com o processo de orientação,
favorecendo à criatividade e a segurança no assunto que está sendo estudado.
Muito obrigada pela confiança!
“A vida não cessa. A vida é fonte eterna e a morte é o jogo escuro das ilusões. O
grande rio tem seu trajeto, antes do mar imenso. Copiando-lhe a expressão, a alma
percorre igualmente caminhos variados e etapas diversas, também recebe afluentes de
conhecimentos, aqui e ali, avoluma-se em expressão e purifica-se em qualidade, antes de
encontrar o Oceano Eterno da Sabedoria.
Uma existência é um ato.
Um corpo - uma veste.
Um século - um dia.
Um serviço - uma experiência.
Um triunfo - uma aquisição.
“Uma morte - um sopro renovador.”
André Luiz do livro Nosso lar.
vii

AGRADECIMENTOS
Agradeço aqueles que de forma direta ou indireta colaboraram para que a
realização deste trabalho se concretizasse e, portanto, foram fundamentais. Assim,
aqui expresso o meu sincero agradecimento…
Aos pacientes, pois sem eles não avançaríamos com tantas pesquisas para podermos
proporcionar esperança de cura, melhores dias e melhores tratamentos.
À equipe do Laboratório de Hematologia e Citometria de Fluxo (especialmente
Rosana, Vítor e o prof. Dr. Geraldo), que em convênio com a Universidade Federal
do Rio Grande do Norte possibilitaram o desenvolvimento desta tese.
Aos médicos hematologistas, que compartilharam da responsabilidade de cada
diagnóstico, entregando e confiando parte dos destinos de seus pacientes à equipe
do Laboratório de Citometria de Fluxo (leia-se principalmente “Geraldo”),
À minha mãe, Pepita, que sempre procurou ajudar cobrando um melhor rendimento
nessa pesquisa. Preocupava-se com o andamento do projeto, que teve alguns
percalços, mas que graças a Deus, tudo foi melhorando com o passar dos dias. Ainda
cito o ser humano íntegro que me espelho para seguir os caminhos da vida.
À minha sogra, D. Maria, que sempre esteve ao meu lado se disponibilizando em
qualquer momento que houvesse necessidade para que eu pudesse dar seguimento a
essa pesquisa, além de ser um ser humano maravilhoso que sempre estará presente
em minha vida.
viii

À Profa. Dra. (e amiga) Teresa Neuma de Souza Brito, que participou em uma etapa
importante no desenvolvimento desta Tese, e com quem tive a satisfação de poder
compartilhar dos seus conhecimentos.
Ao Dr. Robério Seabra, “ser humano especial” que me transmite confiança, enviado
por Deus me confortou em algumas etapas da vida e me faz acreditar que sempre
vou seguir à vida com coragem.

ix

AGRADECIMENTOS
Tese desenvolvida no Hemocentro Dalton Cunha Barbosa no Laboratório

de Hematologia do HEMONORTE, Natal/RN (Brasil), sob a orientação do
Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior.
Este trabalho contou com o auxílio financeiro do Programa de Demanda

Social da Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior –
DS/CAPES, do Programa de Bolsas REUNI de Assistência ao Ensino e aos
alunos com bolsas concedidas pela UFRN, nas modalidades de assistência
ao ensino e de apoio à Pós-graduação.
x

Sumário
Dedicatória.......................................................................................................... vi
Agradecimentos.................................................................................................. vii
Índice de Figuras................................................................................................ xiii
Índice de Tabelas................................................................................................ xvi
Lista de Abreviaturas.......................................................................................... xviii
RESUMO............................................................................................................ xx
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 21
1.1 Objetivos....................................................................................................... 23
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................. 24
2.1 Hematopoese e diferenciação celular............................................................ 24
2.1.1 Diferenciação da linhagem mielóide........................................................... 29
2.1.2 Diferenciação da linhagem linfóide........................................................... 33
2.1.2.1 Diferenciação dos linfócitos B.................................................................. 35
2.1.2.2 Diferenciação dos linfócitos T................................................................. 39
2.1.2.3 Célula Natural Killer (NK)......................................................................... 46
2.2 Leucemogênese............................................................................................. 50
2.2.1 Aspectos gerais das leucemias................................................................... 50
2.2.2 Etiopatogenia.............................................................................................. 51
2.3 Leucemia linfoblástica aguda......................................................................... 54
2.3.1 Classificação das leucemias linfoblásticas agudas..................................... 55
2.3.2 Classificação morfológica........................................................................... 55
2.3.3 Classificação imunofenotípica.................................................................... 57
LLA de células da linhagem B................................................................ 58
LLA de células da linhagem T................................................................. 59
2.3.4 LLA e fenótipos aberrantes...................................................................... 63
2.3.5 Fator prognóstico e tratamento................................................................ 66
3 OBJETIVOS..................................................................................................... 69
Objetivo Geral................................................................................................. 69
Objetivos Específicos...................................................................................... 69

xi

4 METODOLOGIA............................................................................................ 70
4.1 Pacientes...................................................................................................... 70
4.2 Diagnóstico das leucemias linfoblásticas agudas......................................... 70
4.3 Coleta das amostras...................................................................................... 71
4.3.1 Hemograma................................................................................................ 71
4.3.2 Mielograma................................................................................................. 71
4.3.3 Citoquímica................................................................................................. 72
4.4 Imunofenotipagem......................................................................................... 74
4.4.1 Marcação de antígenos de superfície......................................................... 77
4.4.2 Marcação de antígenos intracitoplasmáticos e nucleares.......................... 77
4.4.3 Aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo.......................... 78
4.4.4 Critérios para interpretação e definição dos subtipos imunológicos das
LLA....................................................................................................................... 84
4.5 Análises estatísticas dos dados..................................................................... 85
4.6 Aspectos éticos.............................................................................................. 85
5 RESULTADOS.................................................................................................. 86
5.1 Características gerais dos pacientes............................................................. 86
5.2 Aspectos clínicos dos pacientes.................................................................... 93
5.3 Características hematológicas....................................................................... 97
5.4 Classificação morfológica FAB....................................................................... 100
5.5 Imunofenotipagem...................................................................................... 103
5.6 Imunofenótipos aberrantes......................................................................... 131
6 DISCUSSÃO.................................................................................................. 145
7 CONCLUSÕES.............................................................................................. 161
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 162
ABSTRACT...................................................................................................... 203
9 ANEXOS........................................................................................................ 204

xii

Índice de Figuras
Figura 1. Representação esquemática do processo de diferenciação da

linhagem hematopoética....................................................................................... 27
Figura 2. Marcadores celulares e diferenciação da linhagem mielóide............... 32
Figura 3. Esquema da diferenciação dos linfócitos T e os correspondentes
malignos................................................................................................................ 48
Figura 4. Esquema da diferenciação dos linfócitos B e os correspondentes
malignos................................................................................................................ 49
Figura 5. Distensão de medula óssea corada pelo corante May-Grünwald-
Giemsa de um paciente com LLA-L1.................................................................... 72
Figura 8. Dot plot SSC x FSC com gate (R1) nos blastos, representado
pelas células em vermelho............................................................................... 80
Figura 9 Dot plot CD45 x SSC com gate (R1) nos blastos, representado
pelas células em vermelho............................................................................... 80
Figura 10. Perfil imunofenotípico de um caso de LLA pré-B Calla+................. 81
Figura 11. Perfil imunofenotípico de um caso de LLA pré-B cµ+..................... 82
Figura 12. Perfil imunofenotípico de um caso de LLA-T................................... 83
Figura 13. Distribuição dos casos de LLA nas diferentes faixas etárias em
relação ao gênero................................................................................................. 89
Figura 14. Frequências dos subtipos morfológicos da classificação FAB nos
pacientes com LLA................................................................................................ 100
Figura 15. Representação gráfica do tipo Box Plot dos níveis de expressão do
antígeno CD19 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
imunofenotipagem................................................................................................. 115

xiii

antígeno cCD79a nos diferentes tipos de LLA determinada pela
imunofenotipagem............................................................................................... 116
antígeno cCD22 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno sCD22 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno sIgM nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno cIgM nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno TdT nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno HLADR nos diferentes tipos de LLA determinada pela
imunofenotipagem................................................................................................ 130
xiv

Figura 27. Distribuição das freqüências das expressões dos antígenos
aberrantes (sCD13, cCD13 e CD33) nas LLA..................................................... 131
Figura 28. Distribuição das Frequências de cada FA (sCD13, cCD13, CD33)
nas linhagens B e T............................................................................................. 132
antígeno mielóide sCD13 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno mielóide cCD13 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno mielóide CD33 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno mielóide CD11b nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno mielóide G-alfa nos diferentes tipos de LLA determinada pela
antígeno mielóide CD41/61 nos diferentes tipos de LLA determinada pela
xv

Índice de Tabelas
Tabela 1. Principais antígenos de diferenciação utilizados na hematopoese

normal e leucêmica.............................................................................................. 28
Tabela 2. Classificação morfológica (FAB) da leucemia linfoblástica
aguda................................................................................................................... 57
Tabela 3. Classificação imunofenotípica das leucemias agudas......................... 61
Tabela 4. Classificação imunofenotípica das LLA (EGIL).................................... 62
Tabela 5. Diferentes aspectos imunofenotípicos das leucemias agudas com
aberrações de fenótipo....................................................................................... 64
Tabela 6. Sistema de pontuação EGIL para definição de leucemias mistas ou
bifenotípicas........................................................................................................ 65
Tabela 7. Fatores prognósticos classicamente descritos para LLA.................... 68
Tabela 8. Anticorpos monoclonais empregados neste estudo........................... 75
Tabela 9. Associação entre os subtipos imunológicos de LLA e o gênero.......... 87
Tabela 10. Associação entre as faixas etárias das crianças e dos adultos com
LLA e o gênero..................................................................................................... 88
Tabela 11. Associação entre os subtipos imunológicos de LLA e as faixas
etárias em crianças, adultos e idosos.................................................................. 92
Tabela 12. Frequências dos dados clínicos em cada subtipo de LLA da
linhagem B........................................................................................................... 95
Tabela 13. Frequências dos dados clínicos em cada subtipo de LLA da
linhagem T............................................................................................................ 96
Tabela 14. Frequências da leucometria nos pacientes com LLA......................... 97
Tabela 15. Frequências da dosagem de hemoglobina nos pacientes com LLA.. 98
Tabela 16. Freqüências do número de plaquetas nos pacientes com LLA......... 98
Tabela 17. Percentuais de blastos no SP dos portadores de LLA..................... 99
Tabela 18. Associação entre os subtipos morfológicos da classificação FAB e
os subtipos de LLA das linhagens B e T............................................................ 101
Tabela 19. Associação entre os subtipos morfológicos da classificação FAB e
as faixas etárias nos pacientes com LLA........................................................... 102
xvi

Tabela 20. Frequências da reatividade dos anticorpos monoclonais utilizados. 105
Tabela 21. Resultados da imunofenotipagem nas LLA da linhagem B.............. 108
Tabela 22. Resultados da imunofenotipagem nas LLA da linhagem T.............. 109
Tabela 23. Resultados da imunofenotipagem na LLA pró-B.............................. 111
Tabela 24. Resultados da imunofenotipagem na LLA Calla+............................ 112
Tabela 25. Resultados da imunofenotipagem na LLA pré-B cµ+....................... 113
Tabela 26. Resultados da imunofenotipagem na LLA-B.................................... 114
Tabela 27. Resultados da imunofenotipagem na LLA pré-T.............................. 124
Tabela 28. Resultados da imunofenotipagem na LLA-T intermediária.............. 125
Tabela 29. Resultados da imunofenotipagem na LLA-T medular...................... 126
Tabela 30. Associação entre os fenótipos aberrantes e o gênero..................... 142
Tabela 31. Associação entre os fenótipos aberrantes e a faixa etária............... 144

xvii

Lista de Abreviaturas
Ac Anticorpo
AcMo Anticorpo Monoclonal
BFU-E Unidade de Explosão Eritrocitária
CALLA Common Acute Lymphoblastic Leukemia-associated
CD Clusters of Differentiation
CF Citômetro de Fluxo
CFU-E Unidade Formadora de Colônia de Eritrócito
CFU-G Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos
CFU-GM Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos, Eritrócitos,
Monócitos
CFU-GEMM Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos, Eritrócitos,
Monócitos e Megacarócitos
CFU-Meg Unidade Formadora de Colônia de Megacariócito
cIg Imunoglobulina intracitoplasmática
CTL Células Tronco Linfóides
DRM Doença Residual Mínima
ECM Matriz Extracelular
EGIL European Group for the Immunological Classification of
Leukemias
FA Fenótipo Aberrante
FAB French-American-British
g/dL Grama por decilitro
GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
HLA-DR Human Leukocyte Antigen
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
INCA Instituto Nacional de Câncer
LA Leucemia(s) Aguda(s)
LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen 1
LLA Leucemia(s) Linfóide(s) Aguda(s)
LMA Leucemia(s) Mielóide(s) Aguda(s)
xviii

MHC Major Histocompatibility Complex
µg Micrograma
µL Microlitro
3
mm Milímetro Cúbico
mL Mililitro
MO Medula Óssea
NK Células Natural Killer
RNA Ácido Ribonucléico
RPM Rotações por Minuto
CT Célula Tronco
sIg Imunoglobulina de superfície
SNC Sistema Nervoso Central
SP Sangue Periférico
TCR T Cell Receptor
TdT Transferase desoxinucleotidil Terminal
TEC Thymic Epithelial Cells
TMO Transplante de Medula Óssea
xix

RESUMO
A Leucemia Linfoblástica Aguda é uma doença de caráter maligno do sistema imune e
hematológico caracterizada pelo acúmulo de precursores linfóides neoplásicos B ou T
(linfoblastos) na medula óssea e/ou no sangue periférico. O diagnóstico dessas
leucemias ocorre pela classificação do aspecto morfológico French-American-British
(L1, L2 ou L3) associado às características do perfil imunológico B ou T das células
malignas, tendo como base o perfil de expressão dos anticorpos monoclonais
direcionados contra os antígenos de diferenciação celular. Vários estudos têm
demonstrado que imunofenótipos de células blásticas de casos de Leucemia
Linfoblástica Aguda nem sempre exibem características da diferenciação linfóide
normal, mas sim exibem imunofenótipos aberrantes. Assim, blastos de alguns casos de
Leucemia Linfoblástica Aguda de linhagem B podem apresentar antígenos T ou
mielóides. Também blastos de casos de Leucemia Linfoblástica Aguda T podem
possuir determinantes de células B ou mielóides. Objetivo: Determinar o perfil
imunofenotípico em 192 pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (B ou T)
diagnosticados no Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro Dalton Barbosa
Cunha - HEMONORTE, com base nos dados clínicos, laboratoriais e na
imunofenotipagem pela citometria de fluxo. Metodologia: Todas as amostras de
sangue periférico e/ou medula óssea foram submetidas à imunfenotipagem por
citometria de fluxo, utilizando um painel de anticorpos monoclonais específico para
Leucemias Agudas diretamente conjugado com até três diferentes fluorocromos por
tubo: isotiocianato de fluoresceína, do inglês fluorescein isothiocyanate (FITC) e/ou
Phicoeritrina (PE) e/ou proteína Piridina de clorofila, do termo em inglês chlorophyl de
peridinin protein (PerCP). Resultados: As Leucemias Linfoblásticas Agudas de
linhagem B foram as mais predominantes, 84,38%. Observou-se uma discreta
predominância dos indivíduos do sexo masculino (56,77%). As crianças foram as mais
acometidas pela doença correspondendo a 58,85%. A avaliação dos subtipos
morfológicos identificou o L1 com 116 casos (60,42%) como o de maior predominância.
Os três subtipos morfológicos French-American-British foram detectados nas
Leucemias Linfoblásticas Agudas de linhagem B, sendo os tipos L1 e L2 mais
freqüentemente observados nas Leucemia Linfoblástica Aguda Calla+ com 72 e 25
casos, respectivamente. Os níveis de expressão dos antígenos T mostraram
principalmente o CD3 (superfície e citoplasmático) com 8,33% e 11,17%,
respectivamente. Para os antígenos B observou-se uma maior freqüência de expressão
para os antígenos pan B: CD19, sCD22, cCD22 e cCD79a. Detectou-se a presença de
fenótipo aberrante em 66 casos. Conclusões: O emprego sistemático dos anticorpos
monoclonais e sua aplicação na citometria de fluxo tem se confirmado útil no
diagnóstico diferencial das leucemias agudas, em adição ao diagnóstico morfológico.
Palavras-chaves: Leucemia Linfóide Aguda, Citometria de Fluxo, Imunofenotipagem.
xx

1 INTRODUÇÃO
As LA compreendem um grupo de neoplasias caracterizadas pela

proliferação clonal e acúmulo na MO e/ou SP de células hematopoéticas imaturas
denominadas blastos, os quais ocupam o ambiente medular e inibem o crescimento e
maturação normal dos precursores eritróides, mielóides e megacariocitários. Elas
diferem entre si com respeito à célula de origem, apresentação clínica, curso e
resposta terapêutica. À medida que se acumulam na MO, as células leucêmicas
suprimem a expansão das células progenitoras hematopoéticas normais, refletindo as
manifestações clínicas comumente observadas nas LA no momento do diagnóstico,
tais como anemia, infecções e hemorragias, que são resultantes da escassez de
hemácias, leucócitos funcionais e plaquetas, respectivamente (Goasguen, 1996;
Greaves, 2002; Oliveira et al., 2004; Pui et al., 2011).
Nas LA dois estágios de desenvolvimento hematopoético são
prováveis alvos para a transformação maligna: a célula multipotente primitiva e as
células precursoras mielóides e linfóides (B e T), originando respectivamente a LMA e
a LLA. As leucemias podem ser classificadas por várias metodologias, tais como: i)
citomorfologia de acordo com os critérios propostos pelo grupo French-American-
British (FAB), podendo ser complementada pela citoquímica; ii) técnicas de
imunofenotipagem por citometria de fluxo; iii) citogenética e iv) biologia molecular
(Bennet et al., 1976; Greaves, 1993c; Cavalcanti Jr, 1995; Oliveira et al., 2004; Lai,
Kondo, 2008; Pui et al., 2008).
As LA são diagnosticadas e classificadas com base na célula de
origem presumida, sendo possível na maioria dos casos, identificar o estágio de
diferenciação celular. A determinação do estágio e/ou linhagem celular onde esta
transformação ocorreu pode ser determinada por técnicas de imunofenotipagem por
citometria de fluxo tendo importantes implicações clínicas, terapêuticas e prognósticas
onde a resposta clínica inicial e a chance de cura variam de acordo com o estágio
onde as células são afetadas (Fialkow, 1987; Goasguen et al., 1996; Oliveira et al.,
2004; Pamnani, 2009).
Nas pesquisas sobre câncer e no delineamento do perfil
imunofenotípico de tumores, atualmente a imunofenotipagem é considerada um

instrumento importante no diagnóstico de doenças onco-hematológicas,
particularmente nas LA (Oliveira et al., 2004; Vardiman et al., 2009; Béné et al., 2011).
Mais recentemente novas propostas de classificação das LA têm
sido descritas, destacando-se a classificação Morfológica, Imunológica e Citogenética
(MIC) e a classificação proposta pelo European Group for the Immunological
Classification of Leukemias (EGIL) (Catovsky, Matutes, 1992), sendo esta última a
mais empregada atualmente, inclusive no Brasil (Béné et al., 1995; Oliveira et al.,
2004; Vardiman et al., 2009; Peters, Ansari, 2011).
A pesquisa que serviu de base para a Tese de Doutorado em
Biotecnologia da Saúde do Programa de Pós-Graduação RENORBIO/UFRN (Rede
Nordeste de Biotecnologia/Universidade Federal do Rio Grande do Norte) aqui
apresentada, teve como objeto de estudo a LLA e foi desenvolvida no Hemocentro
Dalton Cunha Barbosa no Laboratório de Hematologia do HEMONORTE, Natal/RN
(Brasil) em convênio com a UFRN. Foram diagnosticados 192 pacientes com LLA
através citomorfologia e da imunofenotipagem por citometria de fluxo.

1.1 OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar o perfil imunofenotípico das leucemias linfoblásticas agudas

(LLA) nos pacientes atendidos no Departamento de Hematologia do Hemocentro do
Rio Grande do Norte – HEMONORTE;
Objetivos específicos
1. Conhecer a distribuição dos subtipos imunológicos das LLA em cada gênero e em

diferentes faixas etárias;
2. Avaliar as características clínicas e hematológicas nesses pacientes;
3. Correlacionar os subtipos morfológicos da classificação FAB (L1, L2 e L3) com os

subtipos imunológicos de cada linhagem linfocitária (B e T);
4. Avaliar a importância dos diferentes marcadores celulares nos diferentes subtipos B

e T das LLA;
5. Estudar a incidência de LLA com expressão de fenótipos aberrantes.

2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Hematopoese e diferenciação celular
Em humanos a hematopoese, o processo de formação das células

sanguíneas, é classicamente descrita em três períodos no indivíduo normal: o período
mesoblástico que se inicia com o aparecimento do tecido hematopoético rudimentar, a
partir das células centrais das ilhotas de Wolff no saco vitelino do embrião com cerca
de 3 a 5 semanas de vida. Nesta fase aparecem as primeiras células progenitoras
multipotentes (células troncos ou SC) que darão origem aos eritroblastos primitivos,
responsáveis pela síntese das hemoglobinas embrionárias (Figura 1) (Dexter et al.,
1984; Huang et al., 2007; Dzierzak, Speck, 2008; Tavian et al., 2010).
Estes eritroblastos primitivos são morfologicamente semelhantes às
células megaloblásticas associadas à deficiência de vitamina B12 e/ou ácido fólico, e
aparentemente não se diferenciam em eritrócitos anucleados. A hematopoese
megaloblástica desaparece a partir do segundo mês da vida embrionária surgindo o
período hepatoesplênico, que se extende até o sexto mês de gravidez. Nesta fase
verifica-se o aparecimento de ninhos de células hematopoética nos sinusóides
hepáticos. A hematopoese hepatoesplênica atinge uma produção máxima entre o
quinto e o sexto mês de vida fetal, e em seguida regride lentamente (Dexter et al.,
1984; Gulati et al., 1988).
A fase final da hematopoese inicia-se no quarto mês de gestação se
estendendo até a vida adulta. Nesta fase os espaços medulares começam a aparecer
no interior dos precursores cartilaginosos dos ossos longos. Da 32a semana até o
nascimento todo o espaço medular existente é preenchido por tecido hematopoético
ativo e a MO é totalmente celular com representação das várias linhagens
hematopoéticas (Gulati et al., 1988; Dzierzak, Speck, 2008; Tavian et al., 2010).
A MO é um órgão extenso presente principalmente nos ossos chatos
e epífises dos ossos longos. Nela estão presentes as células hematopoéticas
progenitoras com capacidade de auto-renovação e diferenciação nas linhagens
sanguíneas específicas, tais como as séries eritrocitárias, granulocitária,
megacariocitária, monocitária e linfocitária. A atividade proliferativa destas células é

regulada por um complexo sistema que inclui desde interações das células troncos com
o microambiente medular até mecanismos de retroalimentação desencadeados sobre
as células-alvo, através de fatores humorais denominados de fatores de crescimento
de células sanguíneas (Bondurant et al., 2004; Cumano, Godin, 2007; Huang et al.,
2007; Tavian et al., 2010; Pontikoglou et al., 2011).
Uma vez estabelecidas, as SC no microambiente medular, inicia-se
o processo de proliferação e diferenciação celular. Essas células possuem a
capacidade de reconstituir a hematopoese em longo prazo e de forma completa. Elas
possuem a característica fundamental, de divisão celular assimétrica, ou seja, ao se
dividirem dão origem a uma nova SC (auto-regeneração) e a uma célula precursora
comprometida com uma linhagem específica. A maior parte das SC encontra-se
quiescente, ou seja, na fase G0 do ciclo celular e o “pool” destas células se mantém
relativamente constante ao longo de toda a vida (Aguila, Rowe, 2005; Cumano, Godin,
2007, Pontikoglou et al., 2011). Essa proliferação é importante na manutenção da
hemostasia, o que permite suprir as perdas celulares que ocorrem continuadamente no
sangue durante a vida fetal e posteriormente na vida pós-natal (Dexter et al., 1984;
Gulati et al., 1988; Petrides, Dittmann, 1990; Liesveld et al 1991; Kerst et al 1993; Nicol
et al 1994; Dzierzak, Speck, 2008; Tavian et al., 2010; Askmyr et al 2011).
A produção e a secreção de fatores de crescimento pelas células do
microambiente também representam fatores importantes na regulação da
hematopoese, protegendo-a, por assim dizer, de uma proliferação anômala. Esses
fatores são de natureza gliocoprotéica e controlam a proliferação e a diferenciação das
células progenitoras, bem como o funcionamento das células sanguíneas maduras
(Gordon, Manley, 1991; Ogawa, 1993; Bodo et al 2009; Askmyr et al., 2011).
Este mecanismo regulador envolve a produção e liberação, por parte
das células do microambiente, de fatores estimulantes de colônias e inibitórios da
hematopoese. Assim sendo, a íntima relação entre as células progenitoras e as células
do microambiente é uma condição essencial para a hematopoese normal. Além das
células do microambiente medular, linfócitos, neutrófilos, monócitos e macrófagos
também influenciam a hematopoese secretando substâncias regulatórias que agem
sobre a proliferação e diferenciação celular. (Broxmeyer et al., 1978; Metcalf, 1989;
Gordon, Manley, 1991; Ogawa, 1993; Denkers et al., 1993; Simmons et al 1997;
Ratajczak et al 2003; Lévesque, Winkler, 2011; Askmyr et al., 2011; Brown et al., 2012).

A diferenciação celular acompanha-se, em geral, da perda da
capacidade de proliferação podendo considerar-se como dependente da existência de
vários programas de diferenciação normais, culminando com a formação de uma célula
madura e funcionalmente competente (Figura 1) (Gulati et al., 1988; Knapp et al., 1989;
Li, Li, 2006; Carlesso, Cardoso, 2010; Lévesque, Winkler, 2011; Wang, Wagers, 2011).
A caracterização dos elementos que figuram na hematopoese
tornou-se mais clara através do uso de técnicas imunológicas por anticorpos
monoclonais (AcMo), tais como a citometria de fluxo. Desta forma uma série de
reuniões internacionais “Internacional Leukocyte Differentiation Workshops” foram
organizadas para estabelecer uma nomenclatura unificada para antígenos de superfície
celular podendo, desta forma, estabelecer os padrões antigênicos dos linfócitos T, B e
NK, além de células da linhagem mielóide, assim como das células progenitoras destas
linhagens. Estes antígenos foram agrupados conforme o seu peso molecular,
especificidade antigênica, sendo então denominados de “Clusters of Differentiation-CD”
ou grupos de diferenciação, conforme demonstrado na Tabela 1 (Knapp et al., 1989;
Silva et al., 2006; Lin, Goodell, 2011).
Métodos de imunofenotipagem por citometria de fluxo tornaram
possível a detecção de populações de células específicas obtidas de suspensões
celulares definidas pelas expressões antigênicas das SC (Yamamoto et al., 1993;
Emerenciano et al., 2004; Li et al., 2010; Peters, Ansari, 2011; Lin, Goodell 2011).
A citometria de fluxo é a modalidade de citometria na qual as
partículas a terem suas propriedades medidas passam através do sítio de medição
impulsionadas pela vazão de um fluido no qual estão imersas. Dependendo do que se
deseja medir, é necessário o uso de substâncias específicas, como corantes e
luminescentes, com alguma característica mensurável que seja função da propriedade
a ser determinada. A citometria de fluxo possui uma grande quantidade de funções
imprescindíveis à biotecnologia, o que a torna bastante importante para a saúde
pública, e para o desenvolvimento tecnológico e econômico, tanto que em alguns
países é tema ligado à segurança nacional (Shapiro, 2011).
Um citômetro de fluxo é basicamente um aparelho que analisa
partículas ou células individualmente. Embora propriedades acústicas, elétricas e a
emissão de radiação nuclear possam ser utilizadas na citometria de fluxo, as
propriedades ópticas são, sem dúvida, as mais utilizadas pela simplicidade de
implementação e diversidade de informações (Van Dilla, 1985; Shapiro, 2003).

Além da possibilidade de se medirem tantas propriedades com um
citômetro de fluxo, existe um tipo especial de equipamento o qual, além de medi-las,
separa 17 populações de células consoante alguma característica desejada. A este
equipamento dá-se o nome de cell sorter, ou simplesmente sorter (Shapiro, 2003).
Devido à importância do equipamento, institutos de pesquisa e a
iniciativa privada providenciaram os seus próprios citômetros de fluxo para diagnosticar
doenças que acometem o sistema imunológico e as de caráter neoplásico, assim como
para acompanhar o tratamento dos pacientes (Coutinho, 2000).
multipotente
Figura 1 - Representação esquemática do processo de diferenciação da linhagem

hematopoética.
A célula tronco multipotente normalmente se divide com baixa freqüência para gerar mais células-tronco
multipotentes (auto-renovação) ou células progenitoras comprometidas (CFC, células formadoras de
colônias).
Fonte: adaptado de ALBERTS et al., 1997: http://www.rc.unesp.br/ib/biologicas/tronco.html
Tabela 1 - Principais antígenos de diferenciação utilizados para identificar diferentes
tipos celulares durante a hematopoese normal e leucêmica

Anticorpo Localização Função
Células T tímicas, subgrupo de células B, Glicoproteína 48kD que se liga a β2-
CD1a
células de Langerhans microglobulina
CD2 Todas as céls T, maioria das NK ligante de LFA-3
Estrutura do TCR, transdução de
CD3 Céls T tímicas e maduras
sinal
Co-receptor de MHC classe II,
CD4 Céls T auxiliadoras, monócitos, macrófagos
receptor do HIV
Céls T maduras e tímicas, subgrupo de céls
CD5 Ativação de céls T, ligante de CD72
B (Celulas B1)
CD7 Todas as céls T, céls NK Ativação de céls T e NK
Subgrupo de céls T tímicas, T
CD8 Co-receptor do MHC de classe I
supressora/citotóxica, subgrupo de NK.
Precursor B e Céls B do centro germinativo,
CD10 Endopeptidase neutra
PMN
CD13 Céls Mielóides Aminopeptidase N
CD14 Monócitos maduros e precursores
Antígeno Lewis-X, adesão celular e
CD15 Céls mielocíticas e monocíticas
fagocitose
Receptor para cadeia pesada das
CD16 Céls Natural Killer, Granulócitos
Imunoglobulinas
CD19 Céls B precursoras e maduras Ativação de céls B
CD20 Céls B precursores tardios e maduros Canal de Ca++. Ativação de céls B
CD22 Céls B precursoras e maduras Molécula de adesão celular
CD33 Céls mielóides e monocíticas Molécula de adesão do ácido siálico
CD34 Céls Progenitoras ?
Céls linfóides progenitoras, Céls.
CD38 Ativação leucocitária
Plasmáticas, Céls T ativadas
gpIIb/IIIa, receptor para
CD41 Megacariócitos e plaquetas
fibrinogenio/fibronectina
Transdução de sinal: tirosina-
CD45 Pan-hematopoético
fosfatase
CD56 Céls NK e céls T citotóxicas Molécula de adesão celular
GPIIb/IIIa, molécula de adesão celular
CD61 Megacariócitos e plaquetas
com CD41, receptor de fibrinogênio
Mb-1; transdução de sinal da Ig de
CD79a Céls B precursoras
superfície para o citoplasma
CD117 Céls mielóides precursoras receptor de c-kit
Céls B, monócitos, progenitores mielóides e Antígeno de apresentação, MHC
HLA-DR
céls T ativadas classe II
Reconhecimento da cadeia pesada
IgM * Céls pré-B, Linf B naive
da imunoglobulina M
TdT Céls linfóides imaturas Rearranjo de Igs e TCR
Fonte: (Martins SLR et al., 2000; Silva GC et al., 2006).
OBS: *Cadeia pesada de imunoglobulina; TCR (Receptores de células T); TdT (Deoxinucleotidil
transferase Terminal).

2.1.1 Diferenciação da linhagem mielóide
A linhagem mielóide origina-se a partir de um precursor multipotente

(Célula Tronco ou SC) presente na MO. A célula mais imatura conhecida como capaz
de dar origem à linhagem granulocítica, monocítica, eritrocitária e megacariocítica é
denominada de Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos, Eritrócitos, Monócitos
e Megacarócitos ou CFU-GEMM, do termo em inglês, Human Multipotential Progenitor
Cells, que nos seres humanos apresentam um fenótipo: CD34+, HLA-DR+,
expressando também o CD33 (Linton, Dorshkind, 2004; Lai, Kondo, 2008; Murre,
2009). Sua diferenciação posterior está associada à tricotomia deste sistema com a
formação da Unidade Formadora de Colônia de Granulócitos e Monócitos (CFU-GM),
da Unidade de Explosão Eritrocitária (BFU-E) e da Unidade Formadora de Colônia de
Megacariócito (CFU-Meg) (Figura 2) (Pombo de Oliveira, 1988; Knapp et al., 1989;
Foon, 1989; Pinto et al., 1994; Lai, Kondo, 2006; Lai, Kondo, 2008; Kondo, 2010).
A CFU-GM além de preservar a expressão do CD33, CD34 e HLA-
DR passa a expressar o CD13 e CD15 (Foon, 1989; Gorczyca et al., 2011). O CD33 é
uma glicoproteína de 67 kDa com expressão em células progenitoras da linhagem
mielóide e cuja expressão tende a desaparecer na diferenciação mielóide ao nível
correspondente ao mielócito (Knapp et al., 1989; Pombo de Oliveira, 1988; Pinto et al.,
1994; McMillan, Crocker, 2008; Cao, Crocker, 2011). O CD13 é o receptor para
aminopeptidase-N, tendo o peso molecular de 130 a 150 kDa, e sendo expresso ao
longo da diferenciação da linhagem mielomonocítica. Assim como o CD33, este
antígeno não é normalmente encontrado em células de outras linhagens como nos
linfócitos e eritrócitos (Figura 2) (Pombo de Oliveira, 1988; Knapp et al., 1989; Foon,
1989; Pinto et al., 1994; Mina-Osorio, 2008; Wickström et al., 2011).
O perfil imunofenotípico do mieloblasto é semelhante ao do CFU-G,
mantendo desta forma a expressão de HLA-DR, CD34, CD15, CD33 além do CD13 e
receptor do c-Kit (CD117), expressando ainda o receptor do tipo II para fração
constante de IgG (CD32). Nesta fase estas células passam a expressar a
mieloperoxidase, o mais importante marcador da linhagem granulocitária. Esta é uma
enzima lisossomal com expressão seletiva nas células da linhagem granulocítica e
monocítica, não sendo encontrada nas células maduras ou progenitoras da linhagem

linfocitária (Figura 2) (Pombo de Oliveira, 1988; Knapp et al., 1989; Foon, 1989; Pinto et
al., 1994; Praxedes et al., 1994; Klebanoff, 2005; Arnhold, Flemmig , 2010).
No promielócito ocorre a perda do HLA-DR e CD34, passando esta
célula a exibir o fenótipo caracterizado pela expressão do CD33, CD117, CD32 e uma
baixa densidade antigênica de CD11b. Este fenótipo é importante na caracterização
das leucemias promielocíticas, particularmente na forma variante (Figura 2) (Pombo de
Oliveira, 1988; Knapp et al., 1989; Foon, 1989; Pinto et al., 1994; Mina-Osorio, 2008;
Wickström, 2011).
O mielócito exibe uma forte densidade do CD11b, além do CD13,
CD15 e CD32. Já nos granulócitos mais maduros, mais precisamente na fase de
bastonetes inicia-se a expressão do receptor para fração constante de IgG classe III
(CD16) que se intensifica nos neutrófilos segmentados (Figura 2) (Foon, 1989; Lisi et al
et al., 2011; Muschter et al., 2011).
O fenótipo da linhagem monocítica é semelhante à granulocítica com
a exceção de que nesta linhagem a expressão de CD33 e de HLA-DR se mantém em
todos os estágios de diferenciação. O CD11 surge já nos monoblastos, exibindo
também estas células a expressão de CD14 (Figura 2) (Foon, 1989; Seta, Kuwana,
2007; Seta, Kuwana, 2010).
Outras moléculas de superfície envolvidas em adesão celular
também estão presentes nestas células, especialmente nos macrófagos ativados,
como o antígeno de função leucocitária do tipo 1 (LFA-1) ou CD11a/CD18 e a P150/59
(CD11c/CD18) (Figura 2) (Knapp et al., 1989; Ziegler-Heitbrock, Ulevitch, 1993;
Praxedes et al., 1994; Schymeinsky et al., 2007; Vinay, Kwon, 2010; Long, 2011).
A diferenciação eritrocitária se distingue por inicialmente apresentar
dois tipos de células imaturas: a mais imatura, denominada de BFU-E, com um
potencial proliferativo dependente de altos níveis de eritropoetina para sua maturação,
e um compartimento de células mais maduras que morfologicamente se assemelham
ao proeritroblasto, denominando-se CFU-E tendo alta sensibilidade a eritropoetina
(Leeson et al., 1988; Ross, Romrell, 1989; Praxedes et al., 1994; Chasis, Mohandas,
2008; An, 2011; Hattangadi et al., 2011).
Na ontogenia desta linhagem, a partir das células progenitoras BFU-
E ocorre a expressão de HLA-DR, CD34 e CD33, apresentando tanto modificações na
morfologia quanto na expressão de antígenos de membrana celular. Após a perda do
CD34, CD33 e HLA-DR pela CFU-E, o único marcador específico desta linhagem é a

glicoforina alfa (CD235), que é um marcador importante no diagnóstico diferencial das
eritroleucemias (Figura 2) (Gulati et al., 1988; Leeson et al., 1988; Foon, 1989; Metcalf,
1989; Ross, Romrell, 1989; McDonald, Sullivan, 1993; de Oliveira, Saldanha, 2010;
Chateauvieux et al., 2011).
A megacariopoese humana normal é representada por uma pequena
fração de células hematopoéticas responsáveis pela produção de plaquetas. O
elemento mais imaturo desta linhagem, o CFU-Meg, expressa CD34 assim como o
HLA-DR. Os marcadores específicos para megacariócitos são as glicoproteínas
plaquetárias detectadas pelos AcMo direcionados a CD41 (glicoproteína IIb/IIIa), CD42
(receptor para Fator de Von Willebrand) e CD61, sendo largamente empregados no
diagnóstico das leucemias megacarioblásticas (Figura 2) (Foon, 1989; Mininkova, 2010;
Geddis, 2010).
A Figura 2 apresenta de modo esquemático a diferenciação celular
mielóide mostrando o perfil imunofenotípico dos componentes dessa linhagem.

pluripotente
Fonte: Ruiz-Arguelles, San-Miguel (1996); apud McArtur, Torres-Lopez (1996).
Figura 2 - Marcadores celulares e diferenciação da linhagem mielóide.

2.1.2 Diferenciação da linhagem linfóide
O sistema imunológico do homem tem sua atividade exercida por

dois eixos biológicos principais: a imunidade humoral que compreende essencialmente
a produção de anticorpos (Ac) e a imunidade celular desempenhada pelos linfócitos T.
Ambos os sistemas dependem dos linfócitos, quer seja na produção de anticorpos,
quer seja na resposta imune celular (Hood, Prahl, 1971; Foon, 1989; Kamradt, Ferrari-
Kühne 2011; Muto et al., 2011).
Além da MO, estes linfócitos estão organizados nos órgãos linfóides
que compreendem o timo, os gânglios linfáticos, o baço, o apêndice, as placas de
Peyer nos intestinos e o anel de Waldeyer que inclui as amígdalas (Hood, Prahl, 1971;
Hsu et al., 1983; Vondenhoff et al., 2007; van de Pavert, Mebius, 2010).
Do ponto de vista evolutivo, o sistema linfóide pode ser dividido em
três compartimentos:
i) O primeiro compartimento compreende um reservatório de células
não diferenciadas (células tronco multipotentes ou SC) que darão origem às células
tronco linfóides (CTL), as quais são capazes de proliferação e maturação;
ii) Um segundo compartimento consiste nos tecidos linfóides centrais
ou primários (timo e MO). Estes compartimentos controlam o desenvolvimento das
células linfóides, sendo focos de intensa linfopoese independente de estímulos
antigênicos;
iii) O terceiro compartimento inclui os órgãos linfóides periféricos ou
secundários (baço, gânglios linfáticos e tecido linfóide associado às mucosas), onde se
observa uma população mista de linfócitos B e T (Hood, Prahl, 1971; Janossy et al.,
1981; Hsu et al., 1983; Gulati et al., 1988; Foon, 1989; Randall et al., 2008; Gatto,
Brink, 2010; van de Pavert, Mebius, 2010).
Os linfócitos formam um grupo heterogêneo de células mediadoras
da atividade imunológica. O uso de AcMo direcionados às moléculas da superfície
celular tem permitido identificar uma heterogeneidade de populações celulares, dentre
as quais, os linfócitos. Com base na expressão de marcadores de superfície celular,
três linhagens distintas de linfócitos foram identificadas: os linfócitos T, os linfócitos B e
as células assassinas naturais ou “natural killer cells” (NK). Além disso, a expressão
diferencial de determinados marcadores de superfície celular tem sido utilizada para

delinear estágios de diferenciação e de ativação celular, e identificar distintos subtipos
funcionais de linfócitos (Hood, Prahl, 1971; Janossy et al., 1981; Hsu et al., 1983;
Knapp et al., 1989; Foon, 1989; Gatto, Brink, 2010; Kondo, 2010; van de Pavert,
Mebius, 2010).
Os linfócitos T são capazes de reconhecer estruturas polipeptídicas
através de um complexo macromolecular CD3/receptor clonal de célula T (CD3/TCR),
enquanto os linfócitos B exercem o reconhecimento através de imunoglobulinas de
superfície celular (Janossy et al., 1981; Hsu et al., 1983; Gulati et al., 1988; Foon, 1989;
Kondo, 2010; D'Acquisto, Crompton, 2011; Dave, 2011).
Embora as estruturas de reconhecimento das células NK não sejam
totalmente conhecidas, sabe-se que elas expressam proteínas associadas à linhagem
T (CD2 e CD8), e ainda moléculas específicas ou relacionadas como o CD16, o CD56
e o CD57, além de expressarem moléculas de adesão como o CD11b e CD11c (Lanier
et al., 1983; Knapp et al., 1989; Margolick et al., 1991; Loughran, 1993; Pinto et al.,
1994; Masuda, Takahashi, 2011; Sun, Lanier, 2011; Zhang et al., 2011).
A diferenciação dos linfócitos B e T segue três diferentes estágios: o
primeiro estágio ocorre na MO quando as SC, dependendo de estímulos, se
diferenciam em célula tronco linfóide (CTL), que é um precursor comum dos linfócitos B
e T, e em células progenitoras mielóides, a CFU-GEMM. Na segunda fase, algumas
destas células migram para o timo onde, sob influência do microambiente tímico, se
diferenciam em linfócitos T. Os precursores linfóides que permanecem na MO sofrem
diferenciação que culminará com a formação dos linfócitos B. O terceiro e último
estágio corresponde à aquisição de imunocompetência o que ocorre a nível dos órgãos
linfóides secundários (Gulati et al., 1988; Nescakova, Bystricky, 2011; Galli et al., 2011;
Rothenberg, 2011).

2.1.2.1 Diferenciação dos linfócitos B
O linfócito B, por definição, é uma célula capaz de produzir

anticorpos. Como tal, expressa imunoglobulina intracitoplasmática (cIg) e/ou de
superfície (sIg) em diversas etapas da maturação. As imunoglobulinas são expressas
por mudanças na expressão de vários antígenos de diferenciação na superfície celular.
Evento importante na ontogênese dos linfócitos B é o rearranjo dos genes das
imunoglobulinas durante os estágios iniciais de maturação, em que inicialmente ocorre
o rearranjo da cadeia pesada, seguindo-se do rearranjo da cadeia leve. Quando as
cadeias leves e pesadas estão sintetizadas a imunoglobulina é, então, expressa na
superfície da célula (Cooper, 1987; Abbas et al., 1991; Youinou, 2007; Elgueta et al.,
2010; Nescakova, Bystricky, 2011).
No homem as primeiras células primitivas da linhagem B são
identificadas na MO a partir da 32a semana de gestação. Estas células pré-B são
identificadas e codificadas para o desenvolvimento de imunocompetência com
aquisição de receptores antigênicos clonais específicos. Este processo depende de
uma expressão seqüencial de receptores de superfície e se divide em duas etapas:
i) Um estágio de diferenciação independente de estímulo
antigênico, representado por células imaturas precursoras dos linfócitos B e por células
B em repouso;
ii) Um estágio de diferenciação constituído por células antígeno-
dependentes que já expressam sIgs e cIgs, que são células em proliferação, e
plasmócitos (Cooper, 1987; Gulati et al., 1988; Abbas et al., 1991; Zandi et al., 2010;
Lévesque, Winkler, 2011; Boisset, Robin, 2012).
As células primordiais linfóides expressam a enzima nuclear
Transferase desoxinucleotidil Terminal (TdT), proliferam e se diferenciam em células
pré-B, ocorrendo neste estágio o rearranjo da cadeia pesada das imunoglobulinas,
culminando com a expressão da cadeia mü da imunoglobulina no citoplasma (cµ)
(Praxedes et al., 1994; Galler et al., 2004; Mårtensson et al., 2007; Bolland et al., 2009;
Mårtensson et al., 2010).
As células pré-B que estão em proliferação darão origem a células
pré-B menores, havendo então síntese das cadeias leves que podem ser do tipo kappa
(κ) ou lambda (λ). A célula passa então a expressar imunoglobulinas na superfície (sIg)

e cada célula B é então comprometida com uma especificidade de reconhecimento de
um dado antígeno. Assim, em princípio, uma célula B pode sintetizar somente um tipo
de imunoglobulina específica para determinado antígeno ao longo de sua vida
(Praxedes et al., 1994; Johnson et al., 2009; Schroeder, Cavacini, 2010; Carpenter et
al., 2011).
Uma hierarquia seqüencial de genes de imunoglobulinas
rearranjados e mudanças fenotípicas de antígenos de membrana ocorrem na ontogenia
das células B. Cada um desses estágios de diferenciação pode ser definido através de
estudos moleculares ou rearranjos de imunoglobulinas, e pela identificação do perfil
antigênico determinado por AcMo específicos para HLA-DR, CD10, CD19 e CD20
(Uckun, 1990; Abbas et al., 1991; Bagg, 2008; Dadi et al., 2009; Luning Prak et al.,
2011).
O modelo de ontogenia de células B proposto por Uckun (1990)
sugere três etapas fenotipicamente distintas até o aparecimento da cadeia “µ”
citoplasmática e que se destacam como: TdT+/CD19 (estágio 0),
TdT+/CD10+/cCD22+/CD19+ (estágio 1), TdT+/cCD22+/CD19+ (estágio 2),
TdT+/cCD22+/CD19+ (estágio 3) e finalmente TdT+/CD10+/CD19+/”cµ” (estágio 4).
Este modelo baseia-se em análise citofluorimétrica detalhada feita com AcMo em
células frescas e cultivadas provenientes de LLA (LLA) (Bagg, 2008; Dadi et al., 2009;
Luning Prak et al., 2011; Nescakova, Bystricky, 2011).
O antígeno HLA-DR é fortemente expresso durante toda
diferenciação das células B, à exceção dos plasmócitos. O CD19 e o CD22 são
antígenos específicos de células B dentro do sistema hematopoético, não tendo sido
encontrado em linfócitos T ou demais células de linhagens hematopoéticas. O CD19 é
uma molécula com subunidades de 40 e 80kDa. Este é um antígeno de diferenciação
precoce presente em células progenitoras de linhagem B, mantendo-se presente em
linfócitos B circulantes. Apesar desta afirmação o CD19 já foi demonstrado em algumas
leucemias mielóides agudas (LMA), mas por ser considerado um marcador específico
de células B estas leucemias foram consideradas como leucemias bifenotípicas. A
expressão do CD22 precede a síntese de cadeia µ das imunoglobulinas, a qual, da
mesma forma que o CD22 pode ser detectada inicialmente no citoplasma e só
posteriormente na membrana celular (Uckun, 1990; Pombo de Oliveira, 1991; Smith,
Fearon, 2000; Carter, Myers, 2008; Schubert et al., 2012).

O antígeno comum da LLA (CALLA) ou CD10 é uma glicoproteína
de 100 kDa que corresponde a uma endopeptidase associada à membrana celular
humana, a metaloendopeptidase enkefalinase. Este antígeno mostra-se também
presente em algumas células linfóides normais circulantes e nas células linfóides
progenitoras de linhagem B, que correspondem normalmente a 10% das células
linfóides da MO. É nesta fase de diferenciação antigênica pré-B que ocorre a maioria
das LLA. A expressão do CD10, entretanto, não é restrita as células progenitoras
linfóides de linhagem B. Esta molécula também tem sido identificada em células
oriundas de outros tecidos, como em fibroblastos, células provenientes de placenta,
células epiteliais renais, bem como em neutrófilos segmentados, assim como em cerca
de 10% dos linfoblastos leucêmicos oriundos de LLA de células T (Shipp, Look, 1993;
Béné, Faure, 1997; Ichii et al., 2010; Magguer-Satta et al., 2011).
O CD20 é uma proteína de 20 kDa, antígeno encontrado nas células
B normais e malignas, à exceção dos plasmócitos, e parece ser o último antígeno
adquirido na fase pré-B. O CD21 é uma proteína de peso molecular de 140 kDa, sendo
o receptor para a proteína C3d do complemento e para o vírus Epstein Barr (Rani et al.,
1988; Pombo de Oliveira, 1991; Roozendaal, Carroll, 2007; Kovacs et al., 2009;
Suryane et al., 2010).
O modelo de diferenciação proposto por Uckun (1990), baseado na
expressão antigênica das células progenitoras, difere dos modelos propostos por
outros pesquisadores como Fredman e Nadler. Neste modelo, em estudos realizados
com células frescas oriundas de MO humana normal, postula-se que o compartimento
de células pré-B compõe-se de cinco grupos de células com a expressão seqüencial
HLA-DR/CD19/CD24/CD10/CD20 e cµ. Nestes modelos, o que realmente marca a fase
pré-B é a expressão de cadeia pesada µ intracitoplasmática (Freedman, Nadler, 1987;
Monroe, Dorshkind, 2007; Mårtensson et al., 2010).
O primeiro rearranjo está associado com a diferenciação morfológica
e imunofenotípica das células pré-B mais imaturas: HLA-DR+/CD19+/TdT+, existindo
correlação entre a expressão antigênica de CD19+/CD10+ com o rearranjo das cadeias
leves. Assim, o CD19 parece ser o marcador de superfície de membrana que
representa o estágio mais imaturo desta linhagem (Korsmeyer et al., 1981; Foon, Todd,
1986; Freedman, Nadler, 1987; Mansson et al., 2008; Bryder, Sigvardsson, 2010).
Posteriormente ocorre um processo de rearranjo semelhante, envolvendo uma das
famílias de genes das cadeias leves. Tanto os genes de cadeia pesada quanto os de

cadeia leve são transcritos, determinando a formação de moléculas completas de IgM,
formando-se nesta fase a célula B imatura. Por fim, as células B imaturas transformam-
se em células B maduras, que apresentam IgM e IgD na superfície, podendo interagir
com antígenos de modo a sofrerem uma expansão clonal (Tonegawa, 1977; Blattner,
Tucker, 1984; Freedman, Nadler, 1987; Musatti, 1987; Uckun, 1990; Monroe,
Dorshkind, 2007; Mårtensson et al., 2010; Klimovich, 2011).
As células antígeno-dependentes que expressam sIg povoam
tecidos linfóides, formando os centros germinativos nos folículos linfóides.
Morfologicamente estas células são descritas como células pequenas e que, além de
IgM e IgD expressam HLA-DR, CD19, CD20, CD21, mCD22 (Musatti, 1987; Uckun,
1990; Klimovich, 2011; Kracker, Durandy, 2011).
A identificação e individualização das células B em repouso ou de
memória ainda são bastante controversas, porém já se sabe que estas células quando
ativadas apresentam aumento de tamanho, expressão do proto-oncogene c-myc,
aumento da síntese de RNA e maior concentração de cálcio intracelular, passando
também a expressar o antígeno relacionado com a ativação celular (CD38),
aumentando a densidade de moléculas de adesão (Uckun, 1990; Sanz et al., 2008;
Kracker, Durandy, 2011).
Nos últimos estágios de diferenciação das células B, estimulados por
antígenos, as células maduras sofrem diferenciação terminal em plasmócitos ou uma
diferenciação com mudança de isotipos de IgM para células que apresentam IgG, IgE
ou IgA na superfície, as quais, por sua vez, sofrem diferenciação terminal em
plasmócitos IgG, IgE ou IgA, respectivamente (Musatti, 1987; Uckun, 1990; Brinkmann
te al, 1992; Brinkmann, Heusser, 1993; Amanna, Slifka, 2010; Kracker, Durandy, 2011).
Os plasmócitos são citologicamente reconhecidos pela sua forma
ovóide, seu núcleo excêntrico e abundante citoplasma basofílico. Estas células têm um
aparelho secretor bem desenvolvido, tendo a capacidade de secretar grandes
quantidades de imunoglobulinas solúveis no soro e nos tecidos. Nesta fase, estas
células perdem receptores de sIg, CD45, CD19 e HLA-DR, mantendo o CD38 e
expressando imunoglobulina intracitoplasmática (cIg), além do CD11c e o antígeno
relacionado a células plasmáticas (CD138). Sua vida média é de apenas quatro dias,
mas durante este período um único plasmócito maduro tem a capacidade de liberar
milhares de moléculas de imunoglobulina por dia (Musatti, 1987; O’Connell et al., 2004;
Amanna, Slifka, 2010; Caraux et al., 2010; Leite et al., 2010; Raja et al., 2010).

2.1.2.2 Diferenciação dos linfócitos T
Os linfócitos T são morfologicamente semelhantes aos linfócitos B

e funcionalmente reconhecem peptídeo quando associados a moléculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC). Estas células são responsáveis pela
imunidade celular e basicamente se compõem de duas populações funcionalmente
distintas: os linfócitos T citotóxicos, que expressam a glicoproteína CD8 e os linfócitos
T helper, que tem como característica fundamental a expressão da molécula CD4 em
sua membrana citoplasmática (Musatti, 1987; Fitch et al., 1988; Rudd, 1990; Bonilla,
Oettgen, 2010; Júnior et al., 2010, Strutt et al., 2011).
Os linfócitos T citotóxicos (CD3+/CD8+) medeiam a citotoxicidade
específica do antígeno, ou seja, a capacidade de matar outras células que são
reconhecidas como estranhas, por exemplo, células infectadas por vírus ou células
alogênicas introduzidas através de transplantes. Estas células reconhecem antígenos
peptídicos ligados a moléculas classe I do MHC na superfície da célula alvo. Durante
uma infecção viral, peptídeos virais ligam-se as moléculas MHC-I autólogas no interior
das células-alvo infectadas e são transportados à superfície celular para que haja o
reconhecimento por estes linfócitos. Nos transplantes, são as próprias moléculas do
MHC que são reconhecidas como antígenos pelos linfócitos T citotóxicos que destroem
a célula alvo por um processo que ainda não está bem definido (O'Rourke et al., 1993;
Bonilla, Oettgen, 2010; Júnior et al., 2010; Strutt et al., 2011).
Além da função de citotoxicidade, estes linfócitos podem suprimir
respostas imunes, possivelmente pela liberação de fatores solúveis que interagem com
a função de outras células imunes. Devido a esta propriedade a população de linfócitos
T CD3+/CD8+ é freqüentemente denominada de linfócito T supressor/citotóxico ou
TLSc (Musatti, 1987; Fitch et al., 1988; Liew, 1989; O'Rourke et al., 1993; Bonilla,
Oettgen, 2010; Júnior et al., 2010; Laugel et al., 2011).
Os linfócitos T helper ou LTh (CD3+/CD4+) reconhecem peptídeos
que estão ligados às moléculas classe II do MHC presentes na superfície das células
apresentadoras de antígeno (APC), que nos órgãos linfóides periféricos, podem ser
macrófagos, células dendríticas e/ou o linfócito B. Após a apresentação do antígeno em

forma de peptídeo conjugado ao MHC-II, as células Th são ativadas e proliferam. Estas
células quando ativadas secretam linfocinas que tem influência nas funções efetoras de
outras células do sistema imune como os linfócitos B (Musatti, 1987; Fitch et al., 1988;
Janeway, 1989; Liew, 1989; Rudd, 1990; Deenick, Ma, 2011a; Deenick et al., 2011b;
Crotty, 2011).
Inicialmente, uma das maneiras de distinguir os linfócitos T humanos
das células B era verificar a capacidade da célula T ligar-se aos eritrócitos de carneiro
através da molécula CD2, uma proteína de 50 kDa pertencente a superfamília das
imunoglobulinas e membro do grupo das moléculas de adesão (Knapp, 1989; Foon,
1989; Bierer, 1993; Pinto, 1994; Kayzuka, 2009). Entretanto, o marcador definitivo dos
linfócitos T é o complexo CD3/receptor clonal de células T (CD3/TCR) (Dave, 2009;
Dave, 2011; van der Merwe, Dushek, 2011).
O TCR é um heterodímero constituído de duas cadeias
glicoprotéicas do tipo alfa/beta (α/β) ou do tipo gama/delta (γ/δ), ligadas entre si por
pontes dissulfeto. Estas cadeias são compostas de dois domínios: a porção amino
terminal que consiste em uma região variável da sequência de aminoácidos (região V),
e a porção carboxi terminal que engloba uma região constante da sequência de
aminoácidos (região C). Os domínios da região V se associam mutuamente para a
formação de um “sítio de ligação com o antígeno”, enquanto os domínios da região C
ancoram o receptor à membrana da célula T. Todo este complexo possui segmentos
intracitoplasmático, transmembranar e extracitoplasmático (Marx, 1984; Dave, 2009;
Na superfície celular o TCR está associado de forma não covalente
ao CD3, que é um complexo molecular composto de 5 polipeptídeos. O CD3 é
funcionalmente importante porque sua presença é necessária para a expressão do
TCR na superfície celular, além da transmissão de sinais bioquímicos da superfície ao
interior da célula durante o processo de ativação do linfócito T. Além disso, a expressão
do CD3 intracitoplasmático é o evento mais precoce ao longo do processo de
diferenciação dos linfócitos T (Campana et al., 1987; Bierer, Hahn, 1993; Dave, 2009;
Da mesma forma como AcMo e sondas moleculares são
empregados na caracterização das diversas fases da ontogenia do linfócito B, as
diversas etapas de maturação dos linfócitos T também podem ser definidas com o

emprego de AcMo que identificam moléculas específicas e subtipos celulares
funcionalmente distintos.
O processo de desenvolvimento dos linfócitos T é dividido em três
etapas distintas:
i) A primeira etapa dá-se com a migração das células pró-T do
fígado fetal ou MO para o timo;
ii) Interações de timócitos com as células do microambiente tímico
levando à seleção do repertório e maturação das células T; e
iii) Migração das células T maduras do timo para os diversos órgãos
linfóides secundários onde sofrerão expansão clonal, mantendo suas funções
específicas, seja de citotoxicidade ou auxiliares/indutora (Boyd et al., 1993; Ritter,
Boyd, 1993; Godfrey, Zlotnik, 1993; Savino et al., 1993; Coutinho et al., 2005; Jiang,
Chess, 2009).
Estruturalmente o timo pode ser dividido em quatro regiões
principais: o córtex subcapsular, o córtex interno, a região córtex-medular e a medula.
A região mais externa, ou seja, o córtex, contém muitos macrófagos e grandes
linfócitos morfologicamente semelhantes às células blásticas. O córtex interno e a
medula contêm linfócitos de médio porte e menores, e Corpúsculos de Hassall
compostos de aspirais compactados de células epiteliais que podem ser
remanescentes de células degeneradas. As células linfóides do timo (timócitos) estão
cercadas por células epiteliais tímicas ou “thymic epithelial cells” (TEC) cortical e/ou
medular e de outros tipos celulares, como células reticulares interdigitantes,
macrófagos e células nutrizes do timo (thymic nurse cells) compondo o microambiente
tímico (Ross, Romrell, 1989; Boyd et al., 1993; Heng et al., 2010; Gordon, Manley,
2011; Manley et al., 2011).
As thymic nurse cells consistem em células estomais tímicas
especiais que podem conter em seu citoplasma numerosos timócitos, os quais
parecem estar em um microambiente propício que facilita a sua sobrevivência e
diferenciação (Villa-Verde et al., 1994; Pearse, 2006; Gordon, Manley, 2011). Os vasos
sanguíneos são encontrados no córtex e na região medular, e caracteristicamente
possuem células epiteliais na adventícia que servem de barreira entre o timo e o
sangue (Ross, Romrell, 1989; Boyd et al., 1993; Gordon, Manley, 2011; Manley et al.,
2011).

Fatores solúveis produzidos pelo epitélio tímico têm papel importante
na diferenciação dos timócitos. Os hormônios tímicos de natureza peptídica são:
timulina, timosina α1, timosina β4 e timopoetina, que atuam inicialmente como fatores
quimiotáticos atraindo as células progenitoras T ao timo e para o interior do órgão
atuando como fatores que influenciam na proliferação e diferenciação das células T.
Além dos hormônios tímicos, as TECs também secretam IL-1, IL-3, GM-CSF e fator de
transformação alfa. Além disso, as TECs são capazes de secretar algumas proteínas
que compõem a ECM do timo, tais como laminina, fibronectina e colágeno tipo IV. In
situ estes elementos estão localizados segundo um padrão bem definido e altamente
conservado nos mamíferos (Boyd et al., 1993; Ritter, Boyd, 1993; Godfrey, Zlotnik,
1993; Savino et al., 1993; Villa-Verde et al., 1994; Pierluigi et al., 2010; Guerder et al.,
2012).
Uma complexa série de mudanças no genótipo e fenótipo
acompanha a maturação dos linfócitos T no timo. Destas mudanças destacam-se o
rearranjo e a expressão produtiva dos genes do TCR e a subseqüente seleção de
repertório de antígenos de superfície que permitirá as células T maduras reconhecerem
antígenos estranhos, mas não em geral antígenos próprios. Esta seleção dar-se-á a
partir da interação do TCR com o MHC, no contexto das moléculas CD4 ou CD8, e
ainda de moléculas de adesão (Campana et al., 1987; Boyd et al., 1993; Ritter, Boyd,
1993; Godfrey, Zlotnik,1993; Hale, Fink, 2010; Xiong, Bosselut, 2012).
Os primeiros timócitos a serem reconhecidos, as células pré-T,
podem ser identificadas pela expressão de algumas proteínas de superfície celular
como as moléculas CD7 e CD34. Estas células também são caracterizadas pela
expressão intracitoplasmática de CD3 (cCD3+), mas não ainda na sua superfície
(mCD3-). A ausência das glicoproteínas CD4 e CD8 também é característica destas
células (Campana et al., 1987; Haynes et al., 1989; Boyd et al., 1993; Dave, 2009;
Dave, 2011).
Células progenitoras T migram do fígado fetal ou da MO para o timo
atraídas por fatores quimiotáticos produzidos pelas TEC já a partir da 8a semana de
gestação em humanos. A migração destas células envolve mecanismos de adesão das
mesmas ao endotélio dos vasos sanguíneos do timo, transmigração através dos
capilares tímicos e migração das mesmas pelo timo, inicialmente na região cortical e
em seguida pela região medular (Campana et al., 1987; Boyd, Hugo, 1991; Boyd et al.,

1993; Ritter, Boyd, 1993; Godfrey, Zlotnik, 1993; Savino et al., 1993; Villa-Verde et al.,
1994; Yarilin,Belyakov, 2004; Ceredig, 2012).
Este mecanismo de migração celular é mediado por moléculas de
adesão presentes na superfície destes linfócitos e seus contra-receptores expressos na
superfície das células endoteliais tímicas e nas TEC. Dois grupos de moléculas de
adesão estão particularmente implicados no “homing” das células pré-T ao timo: o
CD44 e o VLA-4 (Campana et al., 1987; Boyd, Hugo, 1991; Savino et al., 1993; Villa-
Verde et al., 1994; Schwarz, Bhandoola, 2006; Sitnicka, 2009). O CD44 é uma
molécula de adesão pertencente à família das proteoglicanas e que tem como ligante o
ácido hialurônico (Baaten et al., 2012).
As células pré-T de camundongo que migram ao timo expressam
várias isoformas de CD44, e a incubação prévia destas células com AcMo anti-CD44
tem a propriedade de inibir a migração destas células ao timo, possivelmente pela
inibição da adesão das mesmas às células endoteliais vasculares tímicas, acreditando-
se que este fenômeno também possa ocorrer no homem (Patel, Haynes, 1993; Patel et
al., 1995). O VLA-4 é uma molécula de adesão pertencente à família das integrinas e
que está presente nos linfócitos T e timócitos, estando também envolvida no
mecanismo de “homing” das células progenitoras T ao timo (Campana et al., 1987;
Boyd, Hugo, 1991; Imai et al., 2010).
Uma vez no interior do timo, estas células, sob influência do
microambiente tímico, sofrem uma série de modificações fenotípicas, inicialmente
tornando-se timócitos, passando por diversos estágios de diferenciação que culminarão
na formação de um linfócito T maduro (Weiss, Stobo, 1984; Campana et al., 1987;
Savino et al., 1993; Villa-Verde et al., 1994; Nitta et al., 2008; Bunting et al., 2011).
A interação dos timócitos com as células do microambiente tímico é
importante nesta fase de maturação intratímica. Esta mediação ocorre através das
moléculas de adesão presentes na superfície dos timócitos, e seus contra receptores
presentes nas TEC. A interação CD2-LFA-3 e LFA-1-ICAM-1 e 2 são exemplos de
moléculas de adesão que medeiam contatos intercelulares nesta fase de
desenvolvimento dos timócitos. O antígeno de função leucocitária do tipo 3 (LFA-3) é o
ligante da molécula CD2, tratando-se de uma molécula de adesão da família das
integrinas que é expresso em uma grande variedade de células e tecidos, dentre os
quais se inclui as TEC e fibroblastos tímicos (Campana et al., 1987; Savino et al., 1993;
Savino et al., 2004; Dzhagalov, Phee, 2012).

Já no córtex tímico, as células progenitoras T se diferenciam em
células pré-T através do rearranjo dos genes gama (γ), delta (δ) e beta (β) do TCR.
Inicialmente as células que exibem TCRγ/δ originam-se nas células pré-T que se
arranjaram produtivamente e expressaram os genes γ/δ do TCR. As células pré-T
destinadas a gerar células T que exibem TCRα/β, então rearranjam os genes α do TCR
por meio de deleção dos genes δ do TCR entre os genes Vα e Cα do cromossomo. O
rearranjo de genes TCR precede a expressão de moléculas antigênicas específicas
presentes nas células T (Weiss, Stobo, 1984; Fitch et al., 1988; Boyd, Hugo, 1991;
Hale, Fink, 2010; Morris, 2012).
Um modelo simplificado de diferenciação de células T foi
inicialmente proposto por Reinherz et al (1980). Este modelo foi posteriormente
confirmado por outros pesquisadores (Korsmeyer et al., 1981; Foon, 1986; Freedman,
Nadler, 1987; Campana et al., 1987; Haynes et al., 1989) e divide as células T em três
compartimentos celulares distintos definidos pelo perfil da expressão de antígenos
específicos detectados por AcMo e que são:
I) Timócitos primitivos ou células pré-T;
II) Timócitos intermediários ou timócitos corticais; e,
III) Timócitos medulares ou maduros
O compartimento I é composto por células blásticas de grande

tamanho que expressam a enzima TdT e os antígenos de superfície CD7, CD34 e
CD38. Estas células representam 10% das células imaturas e sofrem estímulo do
microambiente tímico para dar continuidade a maturação das células T. Este
compartimento celular representa o reservatório de células dupla negativas CD4-/CD8-,
que posteriormente sofrem um processo de seleção negativa/positiva sob influência do
microambiente tímico. O CD7 é uma glicoproteína de peso molecular de 40 kDa e
representa o primeiro antígeno de membrana associado as células T. Sua expressão
precede o rearranjo dos genes (α/β) do TCR mostrando que ele pode ser um marcador
de células progenitoras. Embora sua função como molécula de adesão não esteja
ainda bem esclarecida acredita-se que tenha um papel fundamental na adesão e
ativação das células T. Para alguns autores, entretanto, a expressão desta molécula
estaria relacionada com a mediação da migração das células progenitoras T da MO ao
timo. Este antígeno foi identificado em células progenitoras (células que que podem dar

origem a outras linhagens) (Pittaluga et al., 1986; Kurtzberg et al., 1989; Sitnicka, 2009;
Awong, Zuniga-Pflucker, 2011).
O compartimento II compreende o estágio intermediário de células
que apresentam CD7, CD5, CD2, cCD3, adquirem o CD1a, expressando também o
TCR α/β, bem como CD4 e CD8 concomitantemente (células duplo positivas ou DP).
Subsequentemente esses timócitos imaturos CD4+/CD8+ expressam baixos níveis do
complexo CD3/TCRα/β, e então sofrem uma seleção e “educação”. Uma pequena
proporção de células DP perde a expressão de CD4 ou de CD8, tornando-se
CD4+/CD8- ou CD4-/CD8+. A quantidade de CD3/TCR na superfície da célula
aumenta, a molécula CD1a é perdida, surgindo assim as células que compõem o
compartimento III, com dois grupos de linfócitos T distintos, ou seja, o linfócito T
citotóxico (LTC) (CD4-/CD8+) e o LTh (CD4+/CD8-) (Patel, Haynes, 1993; Takahama
et al., 2010; Awong, Zuniga-Pflucker, 2011).
É importante ressaltar que a expressão do TdT se mantém presente
ao longo de toda a diferenciação até o completo amadurecimento das subpopulações
de células T. Esta enzima também está presente nas células imaturas da linhagem B
na MO, e sua função é atuar como uma recombinase relevante nos rearranjos dos
genes de cadeia pesada das imunoglobulinas e do TCR (Fowler, Suo, 2006).

2.1.2.3 Célula Natural Killer (NK)
As “células natural killer” (NK) consistem de uma subpopulação de

linfócitos que se originam de uma célula progenitora linfóide na MO. Estas células têm
morfologia de um grande linfócito granular e expressam antígenos próprios como o
CD56 e CD57, além de antígenos relacionados como o CD16, e não específicos como
o “antígeno leucocitário comum” ou CD45, o CD38, o CD2 e o CD8 expressando
também moléculas de adesão como o CD11a,b,c e o LFA-1. Das moléculas largamente
empregadas na identificação das células NK, o CD16 tem significado funcional. Ela
representa o receptor para IgG, e portanto, confere às células NK outra função, a
capacidade de lisar células alvo revestidas de IgG, sendo este fenômeno conhecido
como citotoxicidade mediado por células dependentes de anticorpos ou ADCC (Lanier
et al., 1983; Hercend, Schmidt, 1988; Margolick et al., 1991; Stites,Terr, 1991; Hannet
et al., 1992; Poli et al., 2009; Paust,von Andrian, 2011).
As células NK maduras estão presentes no SP, na MO e no baço,
porém são pouco freqüentes nos linfonodos e no timo. Em indivíduos normais, as
células NK perfazem um total de 10 a 15% das células linfóides no SP e 1 a 2% dos
linfócitos no baço (Hannet et al., 1992; Poli et al., 2009; Paust, von Andrian, 2011).
A relação exata das células NK com os linfócitos B e T é
desconhecida, entretanto estas células formam uma linhagem claramente distinta, visto
que elas não apresentam rearranjo de genes para imunoglobulinas nem para TCR e
são CD3 negativas (Hercend, Schmidt, 1988; Poli et al., 2009; Watzl, Urlaub, 2012).
As células NK foram originalmente definidas pela sua capacidade
de destruir células tumorais (atividade NK) sem uma imunização prévia do hospedeiro
pelo tumor. Diferentemente do linfócito T citotóxico, as células NK reconhecem e
destroem tanto tumores autólogos como alogênicos sem o reconhecimento dos
antígenos do MHC nas células alvo. Esta citotoxicidade não restrita ao MHC pode ser
comprovada “in vitro” quando se emprega células da linhagem K562 usadas como alvo
para medir a função NK “in vitro”, visto que estas células são desprovidas de antígenos
HLA (Musatti, 1987). Os receptores de membrana das células NK responsáveis pelo
reconhecimento das células infectadas ou tumorais ainda não foram identificados
(Musatti, 1987; Moretta et al., 1994; Pegram et al., 2011; Watzl, Urlaub, 2012).

A atividade NK tem sido atribuída como importante na vigilância
imunológica, impedindo a disseminação metastática de células tumorais através do
sangue. Porém, a atividade mais importante das células NK provavelmente é na defesa
contra infecções virais. As células NK só destroem as células do hospedeiro infectadas
por vírus, porém não atacam as células não infectadas (Gastl et al., 1984; Musatti,
1987; Pegram et al., 2011;).
Diferentemente dos linfócitos T e B, as células NK não possuem
especificidade antigênica e não adquirem memória imune após uma exposição inicial
as células infectadas por vírus ou tumores (Pegram et al., 2011; Watzl, Urlaub, 2012).
As Figuras 3 e 4 mostram de modo esquemático a diferenciação dos
linfócitos T e B, respectivamente.

Fonte: Cavalcanti Júnior GB, 1995.
LPL-T (Leucemia Prólinfocítica de célula T), SS (Síndrome de Sjögren), LNH-T (Linfoma não-Hodgkin
de Células T), ATLL (Leucemia/linfoma de Células T do Adulto).
Figura 3 - Esquema da diferenciação dos linfócitos T e os correspondentes malignos.
48
DIFERENCIAÇÃO NORMAL CONTRAPARTE
MALIGNA
CÉLULA
TDT CD34
TRONCO HLADr
LINFÓIDE
MO
HA
FN CD44
CD34
VLA-4
TDT CÉLULA
VCAM- CD19 LLA PRÓ-B
PRÉ-B
HLADr
GRANDE CD19
IL-
TDT CÉLULA HLADr LLA PRÉ-B DO
SC
PRÉ-B CD10
IL- cCD22 TIPO COMUM
CD44
Célula Estromal
µ µ
? CD19
CÉLULA HLADr
µ TDT µ
CD44 PRÉ-B CD10 LLA PRÉ-B
µ (Cµ +) cCD22
VLA- Cµ Ig
VCAM-1 CD19
µ CÉLULA B HLADr
Macrofágo LLA -B
B IMATURA CD22
sIgM
CD44 +++
sIg
CD19 CD19 YY
LLC / LNH
ÓRGÃOS LINFÓIDES
sIgG
SECUNDÁRIOS
sIgA
sIgE Plasmócito
SP
B
B sIgM
LCP / MM
Linfócito B de
Memória
Fonte: Cavalcanti Júnior GB, 1995, baseado em Uckum FM, 1990. LLC (Leucemia Linfocítica
Crônica)/LNH (Linfoma Não-Hodgkin), LCP (Leucemia de Células Plasmáticas)/MM (Mieloma Múltiplo).
Figura 4 - Esquema da diferenciação dos linfócitos B e os correspondentes malignos.
49
2.2.Leucemogênese
2.2.1 Aspectos gerais das leucemias
Leucemias são cânceres que acometem os glóbulos brancos

sangüíneos (leucócitos) e são resultantes da substituição dos elementos sanguíneos
normais por leucócitos neoplásicos. Estas células ocupam o ambiente medular e inibem o
crescimento e maturação normal dos precursores linfocitários, eritróides, mielóides e
megacariocitários. À medida que se acumulam na MO as células leucêmicas suprimem a
expansão das células progenitoras hematopoéticas normais. A substituição dos elementos
sanguíneos normais por leucócitos leucêmicos levam ao quadro clínico reservado das
leucemias, caracterizada por anemia, trombocitopenia e infecções resultantes pela perda
de leucócitos funcionantes (Erslev, Gabuzda, 1985; Cotran et al., 1994; Goasguen et al.,
1996; Hoffbrand, Pettit, 2001; Lane, Gilliland, 2010; Park et al., 2012).
A MO normal é celular e contém menos de 5% de células blásticas,
com a proliferação e maturação das séries eritrocitária, megacariocitária e granulocitária
evidentes. Nas leucemias, entretanto, ocorre uma substituição difusa dos elementos
celulares normais pelas células leucêmicas proliferativas. Estas células têm um processo
maturativo lento e incompleto. Seu ciclo celular é acelerado, sobrevivendo mais que os
elementos sanguíneos normais. Este crescimento excessivo é resultante de uma
alteração cromossômica adquirida que resulta em um bloqueio de maturação das células
sanguíneas progenitoras (Lane, Gilliland, 2010; Bianco, 2011).
As primeiras observações de pacientes que tinham grandes elevações
do número de glóbulos brancos foram feitas por médicos europeus no século 19, que
deram o nome "sangue branco" a esta doença. Mais tarde, foi usado o termo "leucemia",
que é derivado do grego "leukos" (branco) e "haima" (sangue) (Austin et al., 1988;
Armstrong, Look, 2005; Kampen, 2012).
As leucemias são inicialmente classificadas quanto às células
predominantemente envolvidas no processo de leucemogênese (linfóide ou mielóide) e
quanto ao grau de maturidade dessas células (agudas ou crônicas), sendo a distinção
entre LA linfóides e mielóides crucial para o estabelecimento do sucesso de um
tratamento. Assim sendo, uma classificação inicial baseada na análise de esfregaços de

MO e/ou de SP subdivide as leucemias em mielóides e linfóides. Um outro critério clínico
classifica as leucemias em agudas ou crônicas, dependendo da sua evolução (Harris et
al., 1999; Kampen, 2012).
As LA se caracterizam pelo fato do infiltrado leucêmico ser
predominantemente de células com características blásticas e pelo curso rapidamente
fatal quando não tratadas a contento. Nas formas crônicas ocorre predomínio de formas
sanguíneas mais diferenciadas e um quadro clínico mais favorável (Becker, Jordan, 2011;
Meenaghan et al., 2012).
Desta forma, uma classificação inicial subdividiu as leucemias em
quatro padrões distintos:
i) Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA);
ii) LMA (LMA);
iii) Leucemia Linfoblástica Crônica (LLC); e,
iv) Leucemia Mielóide Crônica (LMC) (Sabattini et al., 2010; Campo et al., 2011)
2.2.2 Etiopatogenia
Embora as causas das leucemias ainda sejam desconhecidas,

atualmente identificam-se certos fatores atribuídos como leucemogênicos. Estes
fatores estariam envolvidos na ativação de proto-oncogenes ou na inativação de genes
supressores tumorais (Bachireddy et al., 2012).
Proto-oncogenes são genes encarregados dos fenômenos normais
de proliferação e maturação celular. Os oncogenes seriam uma forma alterada destes
proto-oncogenes e que estariam envolvidos na evolução e proliferação de células
neoplásicas. Os genes supressores tumorais, por sua vez, consistem em um grupo de
genes normais encarregados de suprimir a proliferação celular maligna, caso possa
ocorrer pela ativação dos oncogenes. Assim sendo, pode-se dizer que a ativação dos
oncogenes ou a inativação dos anti-oncogenes nas células progenitoras do sangue
seriam fatores fundamentais no desencadeamento de leucemias e linfomas (Gulati,
Hyun, 1994; Kennedy, Barabé, 2008; Bachireddy et al., 2012).
Assim como em diversas outras formas de câncer vários agentes
ambientais estão implicados na etiologia das leucemias e linfomas. Influências bem
estabelecidas incluem a exposição a fatores ambientais como as radiações ionizantes,

produtos químicos e infecções, bem como fatores genéticos e imunológicos (Gulati,
Hyun, 1994; Groves t al., 1994; Wiemels, 2012). A correlação entre a exposição das
radiações ionizantes e a leucemogênese ficou constatada de modo evidente após as
explosões atômicas de Hiroshima e Nagasaki em 1945. Observações mais recentes
também correlacionavam uma maior incidência de leucemias em indivíduos jovens
residentes na área da usina nuclear de Sellafield na região leste da Inglaterra. Neste
caso, as leucemias observadas eram do tipo linfoblástica e acometiam jovens e
crianças cujos pais trabalhavam naquela usina, levando a crer que estas leucemias
surgiram por efeito das radiações gama em células germinativas dos indivíduos
afetados (Groves et al., 1994; Kinlen et al., 1995).
Segundo Greaves et al. (1993a), as leucemias ou outra forma de
câncer desencadeadas por radiações são patologias que ocorrem através de
acontecimentos sucessivos. Inicialmente ocorre uma mutação genética que pode
resultar na ativação de certos genes nas células progenitoras do sangue dando origem
a produtos gênicos anômalos, subsequentemente à reativação dos genes com
anomalias resultantes da mutação inicial. A presença de cromossomo extra ou
deleções cromossômicas, assim como o rearranjo dos genes encontrados nas
translocações cromossômicas também seriam responsáveis pela ativação dos
oncogenes ou inativação dos genes supressores tumorais, dando origem às leucemias.
Embora o mecanismo etiopatogênico dos produtos químicos
permaneça obscuro acredita-se que inicialmente ocorre uma absorção destas
substâncias pela corrente sanguínea, sendo então carreadas para os órgãos alvo,
como a MO (Groves et al., 1994; Wiemels, 2012).
Durante muito tempo suspeitou-se de uma etiologia viral nas
leucemias humanas e há indícios desta associação pela caracterização do vírus
linfotrópico de células T humanas do tipo I e II (HTLV-I), isolado em linfócitos
neoplásicos oriundos de pacientes com leucemia e linfoma do tipo T do adulto (ATLL).
Nestes casos, as sequências pró-virais do HTLV-I estão presentes no DNA das células
T neoplásicas, mas não no DNA das células B do mesmo indivíduo, indicando assim
que o HTLV-I é adquirido por infecção e não por transformação de linhagens
germinativas, sendo também observado que cerca de 90% destes pacientes tem a
presença de anticorpos anti HTLV-I em seu soro (Yodoi, 1992; Höllsberg, Hafler, 1993;
Gallo, 2011).

O mecanismo que torna estes vírus oncogênicos e de como eles
desencadeiam o surgimento da leucemia é bastante complexo. Sabe-se, porém, que
alguns destes vírus após de se inserirem no DNA da célula hospedeira vão intervir em
pontos críticos do genoma da célula ativando os oncogenes. Estes, uma vez ativados
promovem o crescimento anormal, surgindo assim o clone leucêmico. O HTLV tem
predileção pela célula TCD4+. O vírus possui em seu genoma uma região denominada
de região X ou Px, que codifica as proteínas regulatórias de alguns proto-oncogenes,
como por exemplo, os genes codificadores da IL-2 e de seu receptor (CD25), sendo
este último responsável pela ativação dos linfócitos T (Günthert et al., 1991; Kress et
al., 2011).
O vírus Epstein Barr também é considerado oncogênico. Ele
pertence ao grupo dos herpesvírus, tendo sido considerado como possível agente
etiológico do linfoma de Burkitt. Neste caso, o vírus infecta os linfócitos B do
hospedeiro que passam a proliferar de modo anormal. O DNA viral se insere no
genoma das células progenitoras proliferantes da linhagem B, tendo sido descrito um
gene viral denominado de BNLF-1 que seria capaz de promover a transformação
maligna dos linfócitos B (Cotran et al., 1994; Grömminger et al., 2012).
Greaves (1997) sugeriu que uma infecção poderia dar início a
leucemogênese de precursores de células B, induzindo o surgimento de LLA do tipo
Calla+. Este processo poderia ser causado por vários caminhos e dentre eles a
existência de um vírus ainda desconhecido poderia ser o responsável pela
transformação maligna dos precursores de células B. No entanto, qualquer infecção
que induzisse uma resposta imune defeituosa, por sua vez, ativaria indiretamente as
células do microambiente a produzirem fatores de crescimento. Estes, através de
moléculas de adesão e a interação entre as células progenitoras da linhagem B com o
microambiente medular desencadeariam o surgimento e proliferação anormal desta
linhagem celular (Journo, Mahieux, 2011).
Pacientes com distúrbios congênitos associados a anormalidades
cromossômicas apresentam um maior risco de desenvolverem leucemias. Por
exemplo, o risco de leucemias em indivíduos com Síndrome de Down é 15 vezes maior
que o da população geral. Situação semelhante também é observada em pacientes
com a Síndrome de Klinefelter. Indivíduos com síndromes de instabilidade
cromossômica, como a Anemia de Fanconi, a Anemia de Bloom e a Ataxia
Telangiectasia também estão relacionadas com um maior risco de desenvolver

leucemias, provavelmente porque os genes de reparo de DNA que codificam as
moléculas de regulação e proliferação celular apresentam fragilidades e pontos de
quebras cromossômicas relacionadas com os mecanismos de leucemogênese (Gulati,
Hyun, 1994; Seif, 2011).
Ainda no contexto da etiologia das leucemias é importante enfatizar
a relação existente entre as imunodeficiências provenientes de distúrbios imunológicos
e o surgimento de leucemias e linfomas. Existe a probabilidade destas neoplasias
surgirem em conseqüência do desenvolvimento de clones de células anormais que
escapariam da destruição devido a uma falha no mecanismo normal de
reconhecimento e eliminação de células tumorais (Erslev, Gabuzda, 1985; Khatami,
2011).
2.3 Leucemia linfoblástica aguda
A Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é uma doença de caráter

maligno do sistema imune. Estas doenças linfoproliferativas malignas se originam a
partir da proliferação neoplásica de uma única célula linfocitária progenitora que sofre
alteração no seu processo de crescimento e reprodução resultando na formação de um
clone neoplásico (teoria monoclonal). As células deste clone vão se expandindo ao
nível dos diversos órgãos linfóides e da MO, atingindo a corrente sanguínea, podendo
assim atingir vários órgãos ou tecidos (Gulati, Hyun, 1994; Pui et al., 2004; Onciu,
2009; Meenaghan et al., 2012).
A maioria dos pacientes com LLA apresenta ao diagnóstico, sinais
e sintomas decorrentes da insuficiência medular e infiltração em órgãos extramedulares
pelo clone leucêmico. Cansaço, febre, palidez, sangramento, dor óssea,
hepatoesplenomegalia e linfadenopatia geralmente estão presentes. Outras
manifestações mais raras estão presentes ao diagnóstico e incluem infiltração
testicular, presença de massa no mediastino e sintomas neurológicos decorrentes da
infiltração do sistema nervoso central pelas células leucêmicas (Cotran et al., 1994;
Onciu, 2009; Cornell, Palmer, 2012).

2.3.1 Classificação das leucemias linfoblásticas agudas
2.3.2 Classificação morfológica
A LLA representa quase 25% dos cânceres pediátricos e pode afetar

tanto adultos quanto crianças, embora esta seja o tipo de leucemia mais comum da
infância (80% dos casos), apresentando um pico de incidência entre os 2 e 5 anos de
idade, decrescendo para um índice de cerca de 20% em adultos, voltando a aumentar
a incidência nesses pacientes após os 60 anos (Armstrong, Look, 2005; McGregor et
al., 2012). A estimativa nos EUA (Estados Unidos da América) é de 3.000 casos novos
ao ano e 2/3 deles são crianças (3,4 casos/100.000 crianças menores de 15 anos
(Meenaghan et al., 2012).
A LMA predomina na faixa dos 13 aos 39 anos, enquanto que a
LMC e a LLC são predominantes na faixa etária dos 40 aos 59 anos, sendo que a LLC
predomina no adulto com mais de 60 anos de idade (Cotran et al., 1994; Becker,
Jordan, 2011; Meenaghan et al., 2012).
As LLA são leucemias caracterizadas pelo acúmulo de precursores
linfóides neoplásicos (linfoblastos) na MO e/ou no SP. Segundo os critérios da
classificação FAB (French-American-British), as LLA podem ser diagnosticadas pela
presença de mais de 30% de células blásticas na MO (Lilleyman et al., 1986). A WHO-
World Health Organization ou Organização Mundial de Saúde (OMS) considera uma
contagem maior que 20% o suficiente para o diagnóstico dessa doença (Onciu, 2009,
Wandt et al., 2010).
As LLA são classificadas pelo aspecto morfológico associado às
características do perfil imunológico das células malignas. O grupo French-American-
British (FAB) classificou as LLA em três subtipos distintos, L1, L2 e L3, baseados
somente em critérios morfológicos de MO e de SP corados pelo May-Grünwald-Giemsa
(Bennett et al., 1976; Benett et al., 1981; Sachdeva et al., 2006; Wandt et al., 2010).
A classificação do sistema FAB é baseada em sistemas de escores
e analisa a relação tamanho do núcleo/citoplasma, presença de nucléolos, regularidade
da membrana nuclear e tamanho da célula como critérios para a distinção entre os
subgrupos morfológicos L1 e L2.

O subtipo L1 caracteriza-se por apresentar em seus esfregaços de
MO ou de SP blastos pequenos homogêneos com núcleo redondo de contorno regular.
A cromatina é levemente condensada e os nucléolos não são visíveis em, pelo menos,
75% dos blastos. O citoplasma é escasso resultando em uma alta relação
núcleo/citoplasma (Tabela 2) (Bennett et al., 1981; Dacie, Lewis, 1984; Wandt et al.,
2010).
O subtipo L2 é constituído por células de tamanhos variados. O
citoplasma geralmente é mais abundante que o observado na L1, os núcleos mostram
um contorno irregular em mais que 30% dos blastos, apresentando clivagem ou fendas.
A cromatina nuclear é frouxa e os nucléolos são sempre visíveis. O subtipo L3 (Tipo
Burkitt) é constituído por células grandes de aspecto homogêneo, o citoplasma é
caracteristicamente hiper basofílico com presença de vacúolos; a cromatina nuclear é
frouxa, exibindo 1 a 2 nucléolos proeminentes. A presença de células em mitose é
outra constante neste subtipo de LLA (Tabela 2) (Bennett et al., 1981; Dacie, Lewis,
1984; Wandt et al., 2010).
O subtipo L1 é mais freqüente em crianças (76 a 89%) do que em
adultos (31 a 43%), o subtipo L2 é mais freqüente em adultos (49 a 60%) que em
crianças (14 a 22%) e o subtipo L3, raramente encontrado, é mais freqüente em
crianças do que em adultos (Plasschaert et al., 2004; Pui et al., 2004; Alves et al.,
2012).
O tipo L3 é um tipo de LLA de células B maduras com
características distintas, associado ao vírus Epstein Barr, colocando-o como uma
entidade única de genótipo e imunofenótipo (Tabela 2) (Pegoraro et al., 1984;
Rawlinson et al., 2011; Alves et al., 2012).
A precisão do diagnóstico de LLA tipo 3 tem uma importância crítica
para a sobrevida dos pacientes, pois este tipo de leucemia não responde
satisfatoriamente aos tratamentos que são normalmente bem-sucedidos em outro tipos
de LLA (Lai et al., 2000; Rawlinson et al., 2011).

Tabela 2 – Classificação morfológica (FAB) da leucemia linfoblástica aguda
Critérios
L1 L2 L3
Morfológicos
Predominância de
Grandes, Grandes,
Diâmetro Celular células pequenas,
heterogêneas homogêneas
homogêneas
Cromatina Nuclear Fina ou aglomerada Fina Fina
Regular, pode Irregular, podendo
Regular, redondo
Forma do núcleo apresentar fenda ou apresentar fenda
ou oval
indentação ou indentação
Um ou mais por Um ou mais por
Indistintos ou não-
Nucléolos célula, grandes, célula, grandes,
visíveis
proeminentes proeminentes
Quantidade de Moderadamente Moderadamente
Escassa
citoplasma abundante abundante
Basofilia
Ligeira Ligeira Intensa
citoplasmática
Vacúolos
Ausentes Ausentes Evidente
citoplasmáticos
Fonte: Bennet JM et al., 1976.
2.3.3 Classificação imunofenotípica
Em 1995, European Group of Imunological Characterization of

Leukaemias ou EGIL, propôs que a classificação imunológica para as LA fosse
uniformizada, apresentando como base o perfil de expressão dos marcadores celulares
determinado por painéis de AcMo direcionados contra os antígenos de diferenciação
celular (Bene et al., 1995; Weinberg, Arber, 2010).
Baseando-se no princípio de que no processo de diferenciação e
maturação os linfócitos apresentam antígenos de superfície e de membranas
citoplasmáticas, e que algumas destas moléculas são perdidas ou adquiridas podem-se
estabelecer perfis de diferenciação maturativo. Considerando também que as
leucemias representam a expansão clonal de uma célula em determinado estágio
maturativo, o emprego de painéis de AcMo permitiu classificar as LLA conforme suas
expressões antigênicas em LLA de linhagem B e T. Aproximadamente 20% dos casos
são de origem de células T, 75% de precursores de células B e 5% de células B
maduras (Bene et al., 1995; Gorczyca et al., 2011; Davidson et al., 2012).

Essas expressões passam a predizer, a partir dos fenótipos B ou T,
que as alterações biológicas associadas à resposta terapêutica, monitorização da
doença residual mínima e estratificação de grupos em maior ou menor risco, hoje em
dia são sabidamente bem mais importantes que os critérios estritamente morfológicos
(Bene et al., 1995; Gorczyca et al., 2011).
LLA de células da linhagem B
As LLA da linhagem B foram divididas de acordo com os quatro

estágios de diferenciação normal dos progenitores B na MO, conforme a expressão
fenotípica:
i) LLA pró-B (TdT+, HLA-DR+, CD19+);
ii) LLA comum ou CALLA positiva (HLA-DR+, TdT+, CD19+, CD10+, cCD22+);
iii) LLA pré-B cµ+ (HLA-DR, TdT+, CD19+, CD10+, cCD22+, cµ+);
iv) LLA de células B (HLA-DR+, TdT+/-, CD19+, mCD22+, CD20+, SmIg+).
A LLA do tipo pró-B representa 5% dos casos pediátricos e 10% dos

casos de LLA em adulto (Infante-Rivard, 1999; Fasching, 2000; Campos-Sanchez,
2011). As células blásticas desse grupo expressam: HLA-DR, Terminal
Desoxinucleotidil Transferase (TdT), CD34, CD19 e CD22 intracitoplasmática (cCD22).
O CD19 conforme já relatado é o marcador pan-B mais sensível para as células da
linhagem B (Perrillat et al., 2002; Cobaleda, Sánchez-García, 2009; Purizaca et al.,
2012).
A LLA do tipo comum (Calla+) representa 75% dos casos da LLA
infantil e 50% dos casos em adultos (Perrillat F et al., 2002; Kubiac-Wlekly A et al.,
2009). As células expressam CD10, o que causa um impacto favorável no prognóstico,
além do cCD22, CD19 e cCD79a (Consolini et al., 1998; Reynolds et al., 2002;, Murray
et al., 2002; Maguer-Satta et al., 2011).
As características imunofenotípicas da LLA pré-B cIgM é a
expressão da cadeia µ citoplasmática associada a presença do CD19, cCD79a e CD10
(Infante-Rivard, 1999), representando, aproximadamente, 15% das crianças com LLA e
10% dos casos em adultos (Gajjar et al., 2000; Higa et al., 2009).
Finalmente, a LLA do tipo B maduro, presente em 2% a 5% de
crianças e adultos, apresenta um fenótipo incomum, caracterizando-se pela expressão

de cadeias leves de imunoglobulina na superfície de membrana (SmIg) (Fasching et al.,
2000: Higa et al., 2009). Os blastos apresentam as mesmas características
morfológicas (FAB L3) e translocações cromossômicas associadas à célula maligna do
linfoma de Burkitt (Bleyer, 1988; Cavalcanti Júnior et al., 1997; Perrillat et al., 2002;
Bain, 2003; Higa et al., 2009). Esse tipo de leucemia apresenta prognóstico
desfavorável, pois há elevada incidência de envolvimento no sistema nervoso central
(SNC), resposta deficiente à terapia e sobrevida abreviada (Cavalcanti Júnior et al.,
1997; Higa et al., 2009; Purizaca et al., 2012).
LLA de células da linhagem T
As LLA de células T representam cerca de 25% dos casos que

acometem os adultos e 15% das crianças (Gajjar A et al., 2000). Ocorrem com maior
freqüência em indivíduos do sexo masculino, estando associado a fatores de mau
prognóstico, tais como elevada leucometria por ocasião do diagnóstico, presença de
massas tumorais como o alargamento de mediastino e envolvimento do sistema
nervoso central (Cavalcanti Júnior et al., 1997; Stock, 1999; Zago et al., 2001; Koch,
Radtke, 2011; Kraszewska et al., 2012).
As características mais importantes destas leucemias é a presença
do TdT e do CD7, bem como a expressão da molécula do complexo TCR e o antígeno
CD3 intracitoplasmático (Hara et al., 2009; Koch, Radtke, 2011).
Assim como as LLA da linhagem B estas leucemias representam um
grupo heterogêneo de doenças conforme seu perfil imunológico (Korsmeyer et al.,
1981; Foon, Todd, 1986; Pui et al., 1993; Koch, Radtke, 2011), dividindo-se em três
subgrupos de acordo com os antígenos de diferenciação correspondentes aos níveis
de diferenciação intratímica normal, que são:

LLA de linhagem T: (CD3+ citoplasmático e/ou de membrana)
I) LLA pré-T: CD7+
II) LLA-T Intermediária: CD2+, CD1a+, CD7+, CD4+/CD8+
III) LLA-T Medular: mCD3+, CD1a-, CD4+ ou CD8+
- LLA-T α/β: TCR α/β +
- LLA-T γ/δ: TCR γ/δ +
O grupo I representa os timócitos mais primitivos (células pré-T) com
expressão de CD7 e CD38, podendo também expressar o CD34 e o HLA-DR. No
próximo nível de diferenciação intratímica as células mantém o CD7 e o CD38,
passando a expressar fortemente o CD3 intracitoplasmático (cCD3). Nesta fase elas
adquirem o CD2 e o CD1, e CD4 e CD8 concomitantemente. Estas células
representam o estágio II que corresponde aos timócitos intermediários na diferenciação
tímica normal. Aproximadamente 10 a 20% das LLA de células T expressam este
fenótipo (Freedman, Nadler, 1987; Stites, Terr, 1991; Patel, Haynes, 1993; Pui et al.,
1993; van't Veer et al., 1993; Dayton et al., 1994; Dzhagalov, Phee, 2012).
As LLA do terceiro grupo correspondentes aos timócitos maduros já
não expressam mais o CD1, passando também a expressar o CD4 ou CD8
seletivamente, da mesma forma que os linfócitos T circulantes. Nesta fase, estas
células também passam a expressar o CD3 de membrana (mCD3), mantendo a
expressão do CD7, CD2 e TdT (Freedman, Nadler, 1987; Pui et al., 1993; van't Veer et
al., 1993; Breit et al., 1994; Mossalayi et al., 1994; Dzhagalov, Phee, 2012; Guerder et
al., 2012).
Embora clinicamente não pareça haver diferença entre as LLA pré-T,
intermediária e medular, alguns autores definem a LLA pré-T com o perfil CD7+,CD4-
,CD8- como as que evoluem com o pior prognóstico, com resistência aos regimes
terapêuticos utilizados (Kurtzberg et al., 1989; Digel et al., 1994; Dzhagalov, Phee,
2012; Guerder et al., 2012).
No entanto, Pui et al (1993) correlacionaram o último estágio de
diferenciação intratímica (mCD3+) juntamente com a morfologia L2, anormalidades
cariotípicas, idade superior a 15 anos, bem como as LLA-T que expressavam o
receptor para transferrina (CD71) como as que evoluem para um mau prognóstico (Pui,
1993; Guerder et al., 2012).

Tabela 3 - Classificação imunofenotípica das leucemias agudas
Linhagem B Linhagem T
AcMo pró-B COMUM pré-B cμ+ B (sIgM+) pré-T T-Int T-Med
HLADR (+) (+) (+) (+) (+\-) (+\-) (-)

TdT (+) (+) (+) (-) (+) (+) (+/-)
CD19 (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-)
cCD22 (+/-) (+) (+) (+) (-) (-) (-)
CD10 (-) (+) (+) (+/-) (-) (+/-) (+/-)
CD20 (-) (+/-) (+) (+) (-) (-) (-)
cIgM (-) (-) (+) (+/-) (-) (-) (-)
sIgM (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-)
CD7 (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+)
CD2 (-) (-) (-) (-) (+/-) (+) (+)
cCD3 (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+)
CD1a (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-)
CD4 (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+)
CD8 (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+)
mCD3 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+)
Adaptado de Drexler HG et al., 1988; Uckun FN, 1990.
Obs: 10% das LLA de células T são CD10+; I (Intermediário); M (Medular).

Tabela 4 - Classificação imunofenotípica das LLA (EGIL)
LLA linhagem B: (CD19+ e/ou CD79a+ e/ou CD22+)*

LLA pró-B: sem expressão de outros antígenos de diferenciação
LLA pré-B (B comum): CD10+ (Calla+)
LLA pré-B (cµ+): com expressão citoplasmática da cadeia pesada da
imunoglobulina IgM (cµ+)
LLA B: com expressão da imunoglobulina IgM de superfície e restrição
clonal para cadeia leve das imunoglobulinas Kappa ou Lambda
citoplasmática ou de membrana
LLA linhagem T: (CD3+ citoplasmática e/ou de membrana)**
LLA pré-T: CD7+
LLA T intermediária: CD2+, CD1a, CD7, CD4+ ou CD8+
LLA T medular: CD3+ membrana, CD1a-, CD4+ ou CD8+
LLA T α/β: TCR α/β
LLA T γ/δ: TCR γ/δ
LLA com Expressão Aberrante de Antígenos Mielóides (CD13 e/ou CD33)
Sem expressão de escore para bifenotípica
* positivo para no mínimo dois dos três marcadores. Muitos casos são TdT+, HLADr+,
exceto em B-IV, que geralmente são TdT-.
** muitos casos são TdT+, HLA-DR-, CD34-, porém esses marcadores não são considerados
para efeito de diagnóstico ou classificação dessas neoplasias.

2.3.4 LLA e fenótipos aberrrantes
A LA é uma doença bastante heterogênea de progresso rápido que

afeta a maior parte das células hematopoéticas ainda não diferenciadas
(emerenciano, 2004; Fohrer-Sonntag, 2012). Vários estudos têm demonstrado que
imunofenótipos de células blásticas de casos de LLA nem sempre exibem
características da diferenciação linfóide normal, mas sim exibem imunofenótipos
aberrantes. Assim, blastos de alguns casos de LLA de linhagem B podem não
apresentar certos antígenos B ou podem apresentar antígenos T ou mielóides.
Também blastos de casos de LLA T podem não apresentar antígenos T comuns ou
possuir determinantes de células B ou mielóides (Kurec et al., 1991; Béné, Porwit,
2012).
A definição de fenótipos aberrantes está frequentemente associada
às leucemias identificadas com: i) coexpressão de marcadores que raramente ou
nunca são encontrados simultaneamente na diferenciação hematopoética normal, ii)
com a superexpressão de um marcador específico de linhagem celular, ou iii) com a
ausência de um marcador que configura assincronia maturativa da célula (Campana et
al., 1990; Emerenciano et al., 2004; dos Santos et al., 2011; Béné, Porwit, 2012).
Estudos imunológicos e moleculares mostram que muitas LA
podem apresentar características de mais de uma linhagem celular. Estas
observações permitiram que fossem então descritas duas categorias de LA que
demonstram “infidelidade de linhagem”, são elas: LLA com antígenos associados à
linhagem mielóide (LLA My+) e LMA com antígenos associados à linhagem linfóide
(LMA Ly+). O critério recomendado para a classificação destes subgrupos leucêmicos
sugere parâmetros que possibilitam a detecção da expressão antigênica ambígua
(Tabela 5) (Campana, Behm, 2000; Emerenciano et al., 2004; Béné, Porwit, 2012).

Tabela 5 - Diferentes aspectos imunofenotípicos das LA com aberrações de fenótipo
LLA (My+) Células precursoras B a LMA L+ a

Células leucêmicas são: Células leucêmicas são:
1. MPO+ ou no mínimo 2 outros marcadores como
1. CD79a+ ou cIg i+ ou CD19+ e CD22+
CD117 +, CD33 + ou CD13 +
2. CD3 - 2. CD3 -
3. MPO - 3. CD79a -
4. CD13, CD15, CD33, CD65 ou CD14 + 4. CD2, CD5, CD7, CD19, CD22 ou CD56+
Leucemias com linhagens mistas ou bifenotípicas
LLA (M+) Linhagem T a
b
Células leucêmicas são: Células leucêmicas coexpressam:
1. CD7+ e CD3+
1. MPO e CD79a ou cIg i ou
(membrana/citoplasma)
2. CD79a - 2. MPO e CD3 ou
3. MPO - e expressam CD13, CD15,
3. cCD3 e cIg i
CD33, CD65 ou CD14
sIg
CD19
No entanto, é importante distinguir casos de leucemias bifenotípicas

dos casos de LLA e LMA que possuem expressão aberrante de antígenos devido às
diferenças de conduta terapêutica. Ao estudar casos com marcadores aberrantes
deve ser incluído o sistema de pontuação sugerido pelo Grupo Europeu de
Caracterização Imunológica das LA (EGIL) e a utilização de múltiplos AcMo com
análise multiparamétrica através da citometria de fluxo. O EGIL estabeleceu um
sistema de escore em que antígenos detectados pela imunofenotipagem por
citometria de fluxo eram pontuados em 0,5, 1 e 2 pontos dependendo da sua
especificidade para as linhagens mielóide, linfóide B e linfóide T (Tabela 6). Casos
tendo escore maior que 2, tanto para os antígenos mielóides quanto linfóides B ou T
são designados como LA bifenotípicas (Bene et al., 1995; Brunning et al., 2001;
Emerenciano et al., 2004; dos Santos et al., 2011).

Tabela 6 - Sistema de pontuação EGIL para definição de leucemias mistas ou
bifenotípicas
PONTOS LINFÓIDE B LINFÓIDE T MIELÓIDE
CD1a CD117
TdT CD64
0,5 CD7
CD24
TdT CD15
CD14
CD19 CD2 CD13

CD10 CD5 CD33
1
CD20 CD8 CDw65
CD10
CD79a CD3 (cyt/m)
2 IgM (cyt) anti-TCR α/β anti-MPO
CD22 (cyt) anti-TCR γ/δ
Fonte: EGIL, 1995.
Os mecanismos pelos quais ocorre a expressão de fenótipo

aberrante no desenvolvimento das LAs ainda permanecem obscuros, no entanto, já é
possível estabelecer associações entre essas expressões incomuns e outras
características biológicas da doença, como as associações com translocações
cromossômicas e fatores prognósticos. Além disso, os imunofenótipos aberrantes são
reconhecidamente instrumentos de grande importância na detecção de doença
residual mínima (DRM) (Emerenciano et al., 2004; dos Santos et al., 2011).
A presença de antígenos aberrantes mielóides em leucemias
linfóides agudas apesar de aparentemente não significar nenhuma característica
biológica específica e nem influenciar o curso clínico, mostra-se uma ferramenta útil e
importante a ser aplicada nos serviços de saúde (Kurec, 1991). Além do que a
presença de imunofenótipo aberrante nos blastos linfóides de pacientes com LAs não
são infreqüentes e podem ser a manifestação de uma característica significativa na
diferenciação das células precursoras ou uma transformação anormal da informação
genética durante o processo leucêmico (Kurec et al., 1991), portanto de acordo com
Emerenciano et al (2004) e Vitale et al (2007) os valores prognósticos da expressão
dos FA são parcialmente conhecidos e muitas vezes discordantes na literatura. Além

disso, o número relativamente pequeno de grupo de pacientes com LLA avaliados e
diferenças nos protocolos de tratamento tem levado a resultados divergentes.
A avaliação da expressão desses antígenos e o nível de
expressão antigênica permanecem disponíveis para uma caracterização mais precisa
da população leucêmica em cada paciente individual. Isto tem implicações clínicas em
termos de decisões terapêuticas (ex. tratamento anti-CD33) e para monitorização da
doença residual mínima durante o curso da doença (Vitale et al., 2007).
Estudos prospectivos usando protocolos de tratamento seriam
necessários para estabelecer se os pacientes com FA teriam o curso da doença
diferenciado. No entanto, como em vários subtipos das LAs existe forte correlação com
o genótipo, esta grande diversidade de marcadores poderá ser conseqüência da
heterogeneidade biológica da origem celular e das alterações moleculares associadas
encontradas nas LAs (Emerenciano et al., 2004; Vitale et al., 2007; Seegmiller et al.,
2009).
2.3.5 Fator prognóstico e tratamento
Fator prognóstico
O prognóstico da LLA melhorou dramaticamente ao longo das

últimas décadas, como resultado da terapia de adaptação para o nível de risco de
recaída, melhoria nos cuidados de suporte e otimização das drogas de quimioterapia
existentes. O resultado positivo da LLA pediátrica evoluiu a partir de uma curva de
sobrevida de menos de 10% em 1960 para aproximadamente 75% a 80% até o
momento. No entanto, para os pacientes adultos a perspectiva é menos otimista. As
taxas de remissão atingiram 85 a 90%, com taxas de sobrevivência global de apenas
40 a 50% (Gökbuget, Hoelzer, 2009; Onciu, 2009).
Cerca de 75% dos pacientes apresentam características de alto
risco e têm uma sobrevida livre da doença de 25%, e apenas 25% apresentam
características de risco padrão, que conferem sobrevida livre da doença maior que
50%. Todos os pacientes são estratificados e tratados de acordo com os algoritmos
que integram as características que apresentam (idade, número de leucócitos,
presença ou ausência do envolvimento do sistema nervoso central ou testicular),

características de leucemia (subgrupo celular e genético) e de início resposta
terapêutica (medindo a dinâmica do curso da doença nas primeiras 1-2 semanas de
tratamento) (Faderl et al., 2003; Onciu, 2009).
Pacientes com baixo risco para a recaída são tratados
principalmente com terapia antimetabólito. Pacientes pediátricos que apresentam
características de alto risco ou que apresentem falha de indução ou doença residual
mínima persistente (DRM) após as primeiras duas semanas de indução recebem
terapia mais agressiva e são considerados para transplante alogênico de células-tronco
hematopoiéticas. Todos os casos restantes são classificados como risco normal de
recaída e são tratados com regimes quimioterápicos intensivos com multiagentes
(Onciu, 2009).
O prognóstico dos pacientes com LLA depende de uma série de
fatores, os quais permitem separar os pacientes em diferentes grupos (baixo,
intermediário e de alto risco), levando a diferentes estratégias de tratamento. As
principais variáveis envolvidas no prognóstico das leucemias incluem o sexo, a idade, a
leucometria inicial, anormalidades citogenéticas, o imunofenótipo e a resposta ao
tratamento (Tabela 7) (Cotran et al., 1994; Onciu, 2009; Rowe, 2010).

Tabela 7 - Fatores prognósticos classicamente descritos para LLA
Variáveis Favorável Desfavorável

Idade 3 – 7 anos < 1 e > 10 anos
Sexo Feminino Masculino
Leucometria < 25.000 / mm3 ≥ 100.000 / mm3
SNC Ausente Presente
Organomegalias (#) Ausente Maciço
Massa mediastinal Ausente Presente
Hemoglobina ≥ 10 g/dL < 10 g/dL
Imunofenotipagem CALLA + T; B; Fenótipo Aberrante
Tipo FAB L1 L2; L3
Ki-67 Ausente Presente
LDH < 480 UL ≥ 480 UL
Fase Diagnóstico Recaída; Refratária.
SNC, Envolvimento do sistema nervoso central; FAB, grupo FAB para

classificação das leucemias linfóides agudas; # Hepatoesplenomegalia.
Adaptado de: Pui et al., 1993; Van T et al., 1993; Digel et al., 1994; Matutes,
1995; Matutes, 1995; Hoelzer, 1996; Ochs, 1996; Hoelzer, 1996; Van Dogen e
Adriaansen, 1996; Lukens, 1998; Styczynski e Wysocki, 2002.
Tratamento
Na maioria dos centros o tratamento da LLA envolve quimioterapia

intensiva a curto prazo (com dose elevada de metotrexato, citarabina, ciclofosfamida,
ou dexametasona prednisona, vincristina, L-asparaginase, e/ou uma antraciclina). Este
protocolo é seguido pela terapia de intensificação ou de consolidação para eliminar a
leucemia residual, prevenir ou erradicar a leucemia no SNC, e assegurar a
continuidade da remissão. A radiação pode ser utilizada em pacientes que mostram
evidência no SNC ou leucemia testicular. Em pacientes adultos, o uso de fatores de
crescimento como fator estimulante de colônias de granulócitos acelera a recuperação
hematopoiética e tem melhorado muito a taxa de sucesso da terapia (Pui et al., 2008;
Onciu, 2009).

3 OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar o perfil imunofenotípico das leucemias linfoblásticas agudas

(LLA) nos pacientes atendidos no Departamento de Hematologia do Hemocentro do
Rio Grande do Norte – HEMONORTE;
Objetivos específicos
1. Conhecer a distribuição dos subtipos imunológicos das LLA em cada gênero e em

diferentes faixas etárias;
2. Avaliar as características clínicas e hematológicas nesses pacientes;
3. Correlacionar os subtipos morfológicos da classificação FAB (L1, L2 e L3) com os

subtipos imunológicos de cada linhagem linfocitária (B e T);
4. Avaliar a importância dos diferentes marcadores celulares nos diferentes subtipos B

e T das LLA;
5. Estudar a incidência de LLA com expressão de fenótipos aberrantes.

4 METODOLOGIA
4.1 Pacientes
A seleção dos pacientes para este estudo foi realizada durante o

período de março de 2005 a julho de 2012. Nesse período foram coletadas amostras
de aspirado de MO (MO) e SP (SP) em 192 pacientes recém diagnosticados com LLA
encaminhados ao Laboratório de Citometria de Fluxo do serviço de Hematologia do
HEMONORTE.
4.2 Diagnóstico das leucemias linfoblásticas agudas
O diagnóstico das LLA baseou-se em critérios clínicos e

laboratoriais. Estes últimos incluíam o hemograma, o mielograma e a
imunofenotipagem celular por citometria de fluxo com um painel de anticorpos
monoclonais (AcMo) específicos para o diagnóstico de LA (Tabela 8). Os critérios
utilizados foram de acordo com os conceitos citomorfológicos FAB (Bennet et al., 1976)
e imunofenotípicos do EGIL (Bene et al., 1995).
Considerou-se linfadenopatia generalizada quando os linfonodos
mediram mais que 2 cm de diâmetro e pertenceram a mais de uma cadeia regional não
contígua. Considerou-se visceromegalia quando o fígado e/ou baço mediram mais que
3 cm abaixo do rebordo costal direito e esquerdo, respectivamente. A presença de
massa de mediastino foi determinada mediante exames radiológicos do tórax, com
aumento de 1/3 da imagem radiológica própria do mediastino (Hamerschlak, 2010).
Além desse outros dados clínicos foram fornecidos pelo médico
hematologista ou na investigação dos prontuários médicos e incluíam envolvimento do
sistema nervoso central (SNC), presença de massa abdominal, infiltração na pele,
hipertrofia gengival, fenômenos hemorrágicos, dentre outros.

4.3 Coleta das amostras
Foram coletadas amostras de MO dos pacientes através da punção

da crista ilíaca em tubos Vacuteiner de 4mL contendo EDTA (Vacuette). As amostras
de SP (SP) foram coletadas por venopunção em tubos Vacuteiner de 4mL (Vacuette)
para exame de imunofenotipagem e hemograma. Todas as amostras foram
manipuladas em até 24 horas após a coleta.
4.3.1 Hemograma
Os hemogramas foram realizados em equipamento automatizado, o

analisador hematológico MICROS (ABX), que forneceu as dosagens de hemoglobina e
contagem de leucócitos e plaquetas. Posteriormente foi feita a análise citomorfológica
por microscopia óptica em distensão de filme sangüíneo em lâminas de microscopia
corados com o corante May-Grünwald-Giemsa (MGG) para contagem diferencial de
leucócitos e determinação do percentual de células blásticas no SP. As lâminas depois
de coradas foram examinadas ao microscópio óptico, inicialmente com objetiva de 40x
e, posteriormente com objetiva de 100x (Olympus Corporation, Tokyo, Japan), sendo
analisadas 100 células para cada 50.000 leucócitos contados no analisador
hematológico.
4.3.2 Mielograma
Os mielogramas foram realizados através da contagem diferencial

de 300 células na distensão do fluido do aspirado de MO, corados com o corante May-
Grünwald-Giemsa. Cada caso foi classificado de acordo com as recomendações do
grupo FAB (Bennet et al., 1976), conforme demonstrado nas Figuras 5, 6 e 7.

4.3.3 Citoquímica
Utilizou-se como prova citoquímica a reação do Negro de Sudan,

que cora de negro uma grande variedade de lipídios presentes nos grânulos primários
e secundários das células sanguíneas da linhagem granulocitária, apresentando reação
negativa para células da linhagem linfocitária. Na investigação de LA esta reação é útil
como método complementar à análise citomorfológica para diferenciar as LMA (reação
positiva) das LLA que são negativas (Bennet et al., 1976).
Linfócito B de Memória

TDT

4.4 Imunofenotipagem
Todas as amostras de SP e/ou MO foram submetidas a

imunfenotipagem por citometria de fluxo, utilizando um painel de AcMo específico para
LA diretamente conjugado com até três diferentes fluorocromos por tubo: isotiocianato
de fluoresceína, do inglês fluorescein isothiocyanate (FITC) e/ou Phicoeritrina (PE)
e/ou proteína Piridina de clorofila, do termo em inglês chlorophyl de peridinin protein
(PerCP), que detectam as fluorescências verde, laranja e vermelha, respectivamente,
possibilitando a marcação de dupla ou tripla marcação por tubo em uma única etapa
de marcação (imunofluorescência direta).
Utilizou-se AcMo (Becton Dickinson, San José CA, USA) contra
antígenos T ( CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 e CD8), antígenos B (CD10, CD19,
CD20, CD22, CD79a e IgM), antígenos mielóides/monocitários (CD11b, CD13, CD14,
CD15, CD33, CD117, CD15), antígenos eritróides (Glicoforina alfa ou CD235 e CD71),
glicoproteínas plaquetárias (CD42 e CD61), antígeno leucocitário comum (CD45),
HLADR e antígeno relacionado as células progenitoras (CD34 e anti-Terminal
deoxinucleotidil Transferase ou TdT).
A Lista completa desses AcMo encontra-se discriminada na Tabela
8.

Tabela 8 - Anticorpos monoclonais empregados neste estudo
Antígenos relacionados aos linfócitos T e B

Anticorpos Especificidade Marca comercial
CD3/CD19/CD45 Linfócitos T e B Beckton-Dikinson
CD4/CD8/CD3 Linfócitos T e subpopulações Th e TSc Beckton-Dikinson
CD22 Linfócitos B e precursores Beckton-Dikinson
CD79a Linfócitos B e precursores Beckton-Dikinson
CD10 Antígeno Comum da LLA Beckton-Dikinson
CD20 Linfócitos B e precursores Beckton-Dikinson
CD2 Linfócitos T e precursores Beckton-Dikinson
CD1a Timócitos Corticais Beckton-Dikinson
IgM Cadeia pesada da imunoglobulina IgM Beckton-Dikinson
Antígenos mielóides, monocitários, plaquetários e eritróides
CD13 Células mielóides Beckton-Dikinson
CD33 Células mielóides Beckton-Dikinson
CD15 Granulócitos Beckton-Dikinson
CD11b Monócitos e precursores Beckton-Dikinson
CD45/CD14 Leucócitos / Monócitos Beckton-Dikinson

CD41 Glicoproteína plaquetária Beckton-Dikinson
CD61 Glicoproteína plaquetária Beckton-Dikinson
Glicoforina alfa Eritrócitos e precursores Beckton-Dikinson
MPO Células mielóides Beckton-Dikinson
Outros
CD34 Células progenitoras Beckton-Dikinson
CD117 Receptor para C-kit Beckton-Dikinson
TdT Terminal deosinucleotidil Transferase Beckton-Dikinson
CD38 Antígeno relacionado a ativação celular Beckton-Dikinson
HLADR Antígeno de histocompatibilidade de classe II Beckton-Dikinson
Fonte: Laboratório de Hematologia; Setor de Citometria de Fluxo – HEMONORTE.
Para melhor caracterização do perfil imunofenotípico das LA foi

necessário a montagem de um painel combinando os diferentes AcMo por tubo, de
acordo com a especificidade e conjugação dos mesmos.

Painel Inicial – Superfície
Tubo 1: Controle isotípicoFITC / Controle isotípicoPE /Controle isotípico Pcyp
Tubo 2: CD45FITC /CD14PE
Tubo 3: CD3FITC/CD19PE/CD45Pcyp
Tubo 4: CD4FITC/CD8PE/CD3 Pcyp
Tubo 5: CD5 FITC /CD19PE
Tubo 6: CD20FITC/CD38PE
Tubo 7: HLADRFITC/CD117PE/CD34Pcyp
Tubo 8: CD33PE
Tubo 9: sCD13PE
Tubo 10: CD15FITC/CD11bPE
Tubo 11: CD10FITC/CD22PE/CD20Pcyp
Tubo 12: CD2FITC/CD38 PE
Tubo 13: sCD79a PE
Tubo 14: CD7PE
Tubo 15: CD1aPE
Tubo 18: anti IgMFitc
Painel Secundário Intracitoplasmático/Nuclear

Tubo 1: Controle isotípicoFITC / Controle isotípicoPE /Controle isotípico Pcyp
Tubo 2: MPOFITC / cCD13PE
Tubo 3: TdTPE
Tubo 4: cCD22FITC / cCD79aPE/ cCD3 Pcyp
Tubo 5: cIgM FITC

4.4.1 Marcação de antígenos de superfície
Para a marcação dos antígenos de superfície, 50 microlitros (µL) das

amostras de MO e/ou SP previamente homogeneizadas foram incubadas com 10 µL de
cada AcMo no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. Após esta etapa a
suspensão foi novamente homogeneizada e foram acrescentados 2 mililitros (mL) de
solução de lise (FacsLysing, Becton Dickinson, San José CA, USA) previamente diluída
a 10% em água destilada, havendo nova incubação por mais 10 minutos no escuro à
temperatura ambiente (TA). Após este período, a suspensão celular foi centrifugada por
5 minutos a 2.000 rotações por minutos (RPM), o sobrenadante desprezado e o
sedimento ressuspenso em PBS e novamente centrifugado a 1.500 RPM por 5
minutos, sendo esta última etapa realizada mais 2 vezes consecutivas. Ao final desta
etapa o sedimento foi ressuspenso em 1 mL de solução de 1% formaldeído diluído em
solução tamponada de fosfatos (PBS, Ph 7,2) e estocado ao abrigo da luz, sob
refrigeração, até o momento da análise. Em todos os casos analisados utilizou-se um
controle de auto-fluorescência inespecífica com um conjugado IgG marcado com
fluorocromo (Gama 1FICT/gama2PE/gama 3Pcyp - Becton Dickinson, San José CA, USA).
4.4.2 Marcação de antígenos intracitoplasmáticos e nucleares
Por se tratar de antígenos cujos epítopos encontram-se localizados

no citoplasma foi necessária a prévia permeabilização celular possibilitando, dessa
forma o direcionamento e reatividade do AcMo para os seguintes antígenos: TdT e
MPO, sendo também necessária a utilização desta metodologia na investigação
intracitoplasmática para o CD13 (cCD13), o CD22 (cCD22) e o CD79a (cCD79a). Para
este procedimento foi utilizado o protocolo de permeabilização da membrana
citoplasmática celular empregando solução de lise (Becton Dickinson´s FACS lysing
solution, San José CA, USA) (Krivit, Good, 1957; Lange, 2000).
Cerca de 50µL de amostra de suspensão celular de SP e/ou MO por
tubo foi incubada com de solução de lise (Facs-Lysing, Becton Dickinson, San José
CA, USA) previamente diluída a 10% em água destilada por 10 minutos à TA, seguido
77
de uma centrifugação a 1.500 RPM por 5 minutos, descarte do sobrenadante e
homogeneização do sedimento. Após ressuspender o sedimento em 2 mL de solução
de Tween-20 diluído a 0,5% em PBS (Tween-20 / BHD, England) centrifugou-se 2
vezes a 1.500 RPM.
Após o descarte do sobrenadante o sedimento foi homogeneizado e
foram adicionados 10µL dos AcMo de acordo com o protocolo previamente descrito
seguida de uma incubação por 30 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
Após esta etapa, o sedimento foi homogeneizado em 2 mL de solução de PBS/Tween-
20 seguida de centrifugação a 1.500 RPM por 5 minutos. Desprezado o sobrenadante
o sedimento foi ressuspendido e submetido a mais uma lavagem com solução de
PBS/Tween-20. Após o descarte do sobrenadante foi adicionado 1 mL de solução de
formaldeído diluído a 1% em PBS ao sedimento final e estocado na geladeira ao abrigo
da luz até o momento da leitura no citômetro de fluxo (CF).
Para cada amostra foi utilizado um tubo controle de marcação inespecífica
(Gama 1FICT/gama 2PE/gama 3Pcyp;- Becton Dickinson, San José CA, USA).
4.4.3 Aquisição e análise das amostras por citometria de fluxo
A aquisição e a análise das amostras foram realizadas em citômetro

de fluxo de 3 cores FACscScalibur (Beckton Dickinson) em plataforma machintosh
(Apple), onde foi utilizado o programa Cell Quest (Cell Quest software Beckton
Dickinson) com aquisição (leitura) de um total de 20.000 células por tubo, levando-se
em conta os parâmetros Forward Scatter (FSC) em escala linear que avalia o tamanho
celular, e Side Scatter (SSC) também em escala linear, o qual avalia a complexidade e
granulosidade celular, FL1, FL2 e FL3 em escala logarítimica que detectam as
fluorescências verde, laranja e vermelha, ou seja, a reação antígeno-anticorpo
conjugado ao FICT, PE e Pcyp, respectivamente. Para cada amostra analisada foram
empregados controles isotípicos de marcação inespecífica, os quais serviram de
referencial para calibração do citômetro de fluxo.
As imunofenotipagens foram consideradas positivas por ambas as
técnicas quando ocorreram mais que 20% das células blásticas positivas para os
AcMo. No caso dos marcadores de células progenitoras como o CD34 e o TdT, por
78
serem muito específicos, a reação foi considerada positiva quando o número de células
marcadas foi igual ou superior a 10%.
Utilizaram-se o plot SSC (complexidade) x FSC (tamanho) para identificar a
população de células mononucleares (Figura 8). Adicionalmente, também foi
empregado o plot CD45 x SSC para delimitar melhor a área de células blásticas
leucêmicas das células precursoras normais e linfócitos residuais (Figura 9). Os
blastos, precursores eritrocitários e os linfócitos localizam-se na região de baixa
complexidade. Os linfócitos apresentam intensidade forte para o CD45, os precursores
eritrocitários são CD45 negativos e os blastos usualmente apresentam baixa
intensidade, sendo ocasionalmente CD45 negativos. Os precursores neutrofílicos e
eosinofílicos têm maior complexidade interna e os monócitos são maiores, com maior
complexidade interna e intensidade forte ao CD45 (Foon, Todd, 1986).
Usando esses parâmetros os blastos foram identificados, e então selecionados
através de uma janela eletrônica denominada “gate”.
Os Resultados foram expressos em percentagem de células positivas. O limiar
de positividade foi baseado no controle negativo do tubo controle das amostras
(Figuras 10, 11 e 12).
79
Figura 8 - Dot plot SSC x FSC com gate (R1) nos blastos, representado pelas
células em vermelho.
Fonte: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, Laboratório de Hematologia; Hemocentro
Dalton Barbosa Cunha - HEMONORTE.
Figura 9 - Dot plot CD45 x SSC com gate (R1) nos blastos, representado pelas células
em vermelho.
Fonte: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, Laboratório de Hematologia; Hemocentro
Dalton Barbosa Cunha - HEMONORTE.
80
A B C
D E F
Figura 10 - Perfil imunofenotípico de um caso de LLA pré-B Calla+.

Nota: A) Características morfológicas das células blásticas em destaque na cor vermelha
detreminadas pelas caracteristicas FSC x SSC, especialmente na área delineada pelo
“gate”; B) CD19 e CD3 expressos em 80% e 16% nas células blásticas, respectivamente;
C) Coexpressão CD10/CD22 em 68% nas células blásticas; D) expressão negativa do
antígeno CD7; E) Expressão do antígeno CD79a intra-citoplasmático em 60% e
negatividade para o antígeno cCD13; F) AcMo contra a Terminal deoxynucleotidil
Transferase (TdT) em 80% das células blásticas e expressão negativa para o AcMo anti-
mieloperoxidase (MPO).
81
A B C
D E F
Figura 11 - Perfil imunofenotípico de um caso de LLA pré-B cµ+.

“gate”; B) CD19 e CD3 expresso em 70% e 1% nas células blásticas, respectivamente; C)
Expressão do CD10 em 23% nas células blásticas e negatividade para o antígeno CD20;
D) Expressão negativa do antígeno CD3 e positividade para a IgM em 84% das células
blasticas; E) Negatividade para os antígeno CD41 e CD33; F) Expressão do CD22
citoplasmático em 90% das células blásticas e expressão negativa para o AcMo anti-
mieloperoxidase (MPO).
82
A B C
D E F
Figura 12 - Perfil imunofenotípico de um caso de LLA-T.

“gate” B) CD19 e CD3 expressos em 1% e 96% nas células blásticas, respectivamente;
C) Expressão negativa para os antígenos CD10 e CD22; D) Expressão negativa dos
antígenos CD22 e CD20; E) Positividade para o TdT em 90% das células blásticas; F)
Expressão do CD3 citoplasmático em 90% das células blásticas e expressão negativa
para o AcMo anti-IgM.
83
4.4.4 Critérios para interpretação e definição dos subtipos imunológicos das LLA
Chamou-se de LLA de células T quando mais que 20% das células

blásticas apresentavam positividade para os antígenos pan T, ou seja, CD2, CD3 e
CD7 (Tabela 4), seguindo os critérios de Freedman AS & Nadler LM, 1987. As LLA de
células T mais primitivas ou de células pré-T só expressam os antígenos CD7 e cCD3.
Neste grupo também pode ser observada a presença de CD34, CD38, HLA-DR e TdT,
sendo observada a ausência de expressão para o CD2, CD4, CD8, CD1a e mCD3. As
LLA correspondentes ao grupo II ou timócitos intermediários se caracterizaram pela
expressão do CD2, CD1a e pela expressão simultânea dos CD4 e CD8, mantendo a
expressão do CD7, cCD3, CD34, HLA-DR, e o CD38 também pode ser encontrado
neste grupo. O grupo III ou timócitos maduros expressam o CD7, CD2 e cCD3 com a
dicotomia para os antígenos CD4 e CD8, além da expressão completa da molécula
CD3 (mCD3).
Chamou-se de LLA de linhagem B quando mais que 20% das
células leucêmicas apresentavam antígenos descritos como de linhagem B e pré-B
(CD19 e cCD79a) conforme os critérios descritos por Freedman & Nadler (1987);
Drexler et al (1988) e Pui et al (1993), também com descrição resumida na Tabela 4.
As LLA do tipo pró-B expressam o HLA-DR e o CD19, podendo
também ser encontrado o CD34. As LLA foram consideradas comum ou Calla positiva
quando as células expressaram o CD10, além do HLA-DR e CD19 ou cCD22.
As LLA pré-B cµ+ expressam o fenótipo: HLA-DR, CD19, cCD22,
CD20, CD10, cµ+, e finalmente as LLA de células B apresentam expressão completa
de sIg M nas células blásticas.

4.5 Análises estatísticas dos dados
Os dados foram coletados e digitados na planilha eletrônica

Microsoft Excell, e posteriormente conferidos e transferidos para o software estatístico
Statistic Pack for Social Sciences (SPSS for Windows versão 17.0; Copyright ® SPSS,
INC).
O tratamento estatístico neste trabalho teve como objetivo testar
hipóteses do tipo:
H0: A proporção de pacientes com um determinado marcador, em um certo tipo

de LLA, é igual a zero;
H1: A proporção de pacientes com um determinado marcador, em um certo tipo

de LLA, é maior que zero;
Portanto, a questão era testar estas proporções. Nas situações onde

o tamanho da amostra era de pelo menos 20 unidades, optou-se por utilizar o teste
estatístico para proporções:
Onde p foi estimado pela proporção amostral, e n é o tamanho da

amostra. As diferenças entre os resultados foram analisadas através dos testes
Bootstrap ou Student's t-test com uma significância estatística de p < 0,05.
4.6 Aspectos éticos
A presente pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos da Universidade Federal do Rio Grande de Norte, protocolo
CEP/HUOL/UFRN: 359/09.

5 RESULTADOS
Foram estudados 192 casos de LLA recém diagnosticados no

Laboratório de Citometria de Fluxo do Hemocentro Dalton Barbosa Cunha-
HEMONORTE, no período de março de 2005 a julho de 2012. O diagnóstico foi feito
baseado nos achados clínicos e laboratoriais determinados pelo hemograma,
mielograma e imunofenotipagem pela citometria de fluxo.
5.1 Características gerais dos pacientes
Para a classificação em subtipos de acordo com a linhagem celular

no diagnóstico das LLA neste grupo de estudo, observou-se que as LLA de linhagem B
foram as mais predominantes, respondendo pelo maior percentual de casos da doença,
162/192 (84,38%), seguida pela LLA-T 30/192 (15,63%) (Tabela 9).
Em relação aos subtipos das LLA da linhagem B, a distribuição das
freqüências de casos foi: LLA pró-B em 33/192 (17,19%), LLA Calla+ em 97/192
(50,52%), LLA pré-B cm+ em 24/192 (12,50%) e LLA-B (sIgM+) em 8/192 (4,17%)
(Tabela 9).
Em relação aos subtipos das LLA-T, a distribuição das freqüências
de casos foi: LLA pré-T em 6/192 (3,13%), LLA-T intermediária em 17/192 (8,85%) e
LLA-T medular em 7/192 (3,65%) (Tabela 9).
Em relação à prevalência do gênero nos pacientes investigados,
observou-se uma discreta predominância dos indivíduos do sexo masculino em relação
ao feminino, correpondendo a 109/192 (56,77%) e 83/192 (43,23%), respectivamente
(Tabela 9).
Correlacionando a distribuição da classificação imunofenotípica das
LLA e os pacientes do sexo masculino observou-se que 94/192 (48,96%) dos casos
foram LLA de linhagem B que ficaram distribuídas assim: pró-B 19/192 (9,90%), Calla+
53/192 (27,60%), pré-B cµ+ 17/192 (8,85%) e B madura 5/192 (2,60%); enquanto que
15/192 (7,81%) dos casos foram LLA da linhagem T: pré-T 2/192 (1,04%), T
intermediária 9/192 (4,69%) e T medular 4/192 (2,08%). Em relação aos pacientes do
sexo feminino observou-se que 68/192 (35,42%) foram LLA da linhagem B distribuídas

em: LLA pró-B em 14/192 (7,29%), LLA Calla+ em 44/192 (22,92%), LLA pré-B cµ+ em
7/192 (3,65%) e LLA-B em 3/192 (1,56%) dos casos; enquanto que 15/192 (7,81%)
foram LLA da linhagem T: LLA pré-T em 4/192 (2,08%), LLA-T intermediária 8/192
(4,17%) e LLA-T medular 3/192 (1,56%) (Tabela 9).
Tabela 9 - Associação entre os subtipos imunológicos de LLA e o gênero
Sexo
Total
Diagnóstico M F
n (%)
n (%) n (%)
LLA pró-B 19 (9,90) 14 (7,29) 33 (17,19)
LLA Calla+ 53 (27,60) 44 (22,92) 97 (50,52)
LLA pré-B cμ+ 17 (8,85) 7 (3,65) 24 (12,5)
LLA-B 5 (2,60) 3 (1,56) 8 (4,17)
Total linhagem B 94 (48,96) 68 (35,42) 162 (84,38)
LLA pré-T 2 (1,04) 4 (2,08) 6 (3,13)
LLA-T intermediária 9 (4,69) 8 (4,17) 17 (8,85)
LLA-T medular 4 (2,08) 3 (1,56) 7 (3,65)
Total linhagem T 15 (7,81) 15 (7,81) 30 (15,63)
TOTAL 109 (56,77) 83 (43,23) 192 (100)
Fonte: Acervo do autor.
A estratificação das faixas etárias dos pacientes foi delineada de

acordo com as recomendações propostas pelos serviços de Onco-Hematologia e
adotada pelo serviço de Hematologia do HEMONORTE (Hamerschlak et al., 2010),
sendo inicialmente distribuídos em dois grandes grupos: i) pacientes pediátricos e ii)
pacientes adultos e idosos. Os pacientes pediátricos foram distribuídos em lactentes (≤
que um ano), pré-escolares (>1 a 5 anos), escolares (>5 a 10 anos) e adolescentes
(>10 a 18 anos). Os pacientes adultos/idosos foram distribuídos em adultos jovens (>18
a 45 anos), adultos (45 a 65 anos) e idosos (>65 anos).
As crianças foram os pacientes mais acometidos pela doença
correspondendo a 113 casos (58,85%) que foram distribuídos entre os lactentes com 9
casos (7 do sexo masculino e 2 feminino), escolares com 39 casos (26 do sexo
masculino e 13 feminino), escolar com 40 casos (22 do sexo masculino e 18 feminino)

e adolescentes com um total de 25 casos (15 dos sexo masculino e 10 feminino). O
grupo dos adultos corresponderam a 79 casos (41,15%) distribuídos entre os adultos
jovens com 58 casos (29 do sexo masculino e feminino), adultos com 15 casos (6 do
sexo masculino e 9 feminino) e idosos com 6 casos (4 dos sexo masculino e 2
feminino) (Tabela 10 e Figura 13).
Tabela 10 - Associação entre as faixas etárias das crianças e dos adultos com LLA e o
gênero
Sexo
TOTAL
Grupos pela Faixa Etária M F
n (%)
n (%) n (%)
≤ 1 ano (lactentes) 7 (3,65) 2 (1,04) 9 (4,69)
> 1 a 5 anos (pré-escolar) 26 (13,54) 13 (6,77) 39 (20,31)
Crianças
> 5 a 10 anos (escolar) 22 (11,46) 18 (9,38) 40 (20,83)
> 10 a 18 anos (adolescente) 15 (7,81) 10 (5,21) 25 (13,02)
Total Crianças 70 (36,46) 43 (22,40) 113 (58,85)
> 18 a 45 anos (adultos jovens) 29 (15,10) 29 (15,10) 58 (30,21)
Adultos > 45 a 65 anos (adultos) 6 (3,13) 9 (4,69) 15 (7,81)
> 65 anos (idosos) 4 (2,08) 2 (1,04) 6 (3,13)
Total Adultos 39 (20,31) 40 (20,83) 79 (41,15)
TOTAL 109 (56,77) 83 (43,23) 192 (100)

ao Gênero

Figura 13 - Distribuição dos casos de LLA nas diferentes faixas etárias em relação ao gênero.
A T abela 11 m ostra a associação ent re as f aixas et árias

estabelecidas e os subtipos imunológicos das LLA investigadas.
Nos lactentes detectou-se um total de 5 c asos (5,21%) sendo 3 LLA
pró-B, um caso de LLA Calla+ e outro de LLA pré-B cµ+ (Tabela 11).
Nas c rianças obs ervou-se a oc orrência de 113 do t otal dos c asos,
distribuídos em 94 casos (48,96%) para a LLA de linhagem B e 19 (9,90%) para a LLA-
T, di stribuídos de ac ordo c om a es tratificação das quat ro f aixas et árias par a es se
grupo.
O gr upo dos p ré-escolares foi o m ais ac ometido pe la do ença,
correspondendo a um t otal de 43 c asos ( 22,40%), 40 dos quai s LLA de l inhagem B
(20,83%), com a s eguinte d istribuição: 28 c asos ( 14,58%) de LLA Calla+, 6 ca sos
(3,13%) de LLA pró-B, 4 casos (2,28%) de LLA pré-B cµ+ e 2 casos (1,04%) de LLA-B
Os 3 c asos de LLA-T (1,56%) foram catalogados como 1 c aso (0,52%) LLA pré-T e 2
casos (1,04%) LLA-T intermediária (Tabela 11).
No gr upo dos es colares f oram r egistrados um t otal de 4 0 c asos
(20,83%), sendo 34 ( 17,71%) LLA de l inhagem B e 6 (3,13) LLA-T, com a di stribuição
89
Calla+, que correspondeu a um total de 25 casos (13,02%), seguida pelas LLA pró-B
com 5 casos (2,60%), LLA pré-B cμ+ com 3 casos (1,56%) e um caso (0,52%) de LLA-
B. Os seis casos de LLA-T foram caracterizados como 5 casos (2,60%) de LLA-T
intermediária e um (0,52%) de LLA-T medular (Tabela 11).
Os pacientes do grupo adolescentes corresponderam a um total de
25 casos (13,02%), sendo observado também a mesma tendência dos grupos
pediátricos e das outras faixas etárias, ou seja, predomínio de casos de LLA de
linhagem B, porém sobressaindo como o grupo com um número maior de casos de
LLA-T, correspondendo a 15 casos (7,81%) e 10 casos (5,21%), respectivamente. Nas
LLA de linhagem B, observou-se predomínio das LLA Calla+ com 8 casos (4,17%),
seguido pela LLA pré-B cμ+ com 4 casos (2,08%) e LLA pró-B com 3 casos (1,56%). A
distribuição dos casos de LLA-T foi de 6 (3,13%) LLA-T intermediária e 4 (2,08%) T
medular (Tabela 11).
Já no grupo dos pacientes adultos e idosos observou-se uma menor
freqüência de casos em relação às crianças com 79/192 (41,15%), os quais foram
igualmente distribuídos de acordo com as faixas etárias pré-estabelecidas. Nestes
pacientes também se observou um maior número de casos de LLA imunofenotipadas
como LLA de linhagem B, correspondendo ao total de 68 casos (35,42%) contra 11
casos (5,73%) de LLA-T (Tabela 11).
Dentre todas as faixas etárias, o grupo dos adultos jovens (> 18 a 45
anos) foi o que apresentou maior número de casos, com o total de 58 casos (30,21%)
distribuídos em 50 casos (26,04%) de LLA de linhagem B e 8 (4,17%) LLA-T. Dentre as
LLA de linhagem B observou-se predomínio da LLA Calla+ com 25 casos (13,02%),
seguida pela LLA pró-B com 13 casos (6,77%), LLA pré-B cµ+ com 7 casos (3,65%) e
LLA-B com 5 casos (2,60%). As LLA-T foram distribuídos entre 3 casos (1,56%) de LLA
pré-T e T intermediária, cada, e 2 casos (1,04%) de LLA-T medular (Tabela 11).
O grupo dos adultos da faixa etária > 45 a 65 anos representaram 15
casos (7,81%), sendo 13 (6,77%) LLA de linhagem B e 2 (1,05%) casos de LLA-T.
Dentre as LLA de linhagem B observou-se predomínio da LLA Calla+ com 8 casos
(4,17%), seguidas pela LLA pró-B e pré-B cμ+ com 3 (1,56%) e 2 (1,04%) casos,
respectivamente. As LLA-T foram distribuídas entre 1 caso (0,52%) de LLA pré-T e T
intermediária cada (Tabela 11).

No grupo dos pacientes idosos, a frequência de casos foi tão baixa
quanto no grupo dos lactentes com apenas 6 (3,13%), sendo 5 (2,60%) nas LLA de
linhagem B e 1 caso (0,52%) de LLA pré-T. As LLA de linhagem B foram distribuídas
entre 3 casos (1,56%) de LLA pré-B cμ+ e 2 casos (1,04%) de LLA Calla+ (Tabela 11).

Tabela 11 - Associação entre os subtipos imunológicos de LLA e as faixas etárias em crianças, adultos e idosos
Diagnóstico Crianças* Adultos/Idosos*

Total
≤1a >1a5a > 5 a 10 a > 10 a 18 a Total Crianças > 18 a 45 a > 45 a 65 a > 65 a Total
n (%) Adultos/Idosos
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
n (%)
LLA pró-B 3 (1,56) 6 (3,13) 5 (2,60) 3 (1,56) 17 (8,85) 13 (6,77) 3 (1,56) 0 (-) 16 (8,33) 33 (17,19)
LLA Calla+ 1 (0,52) 28 (14,58) 25 (13,02) 8 (4,17) 62 (32,29) 25 (13,02) 8 (4,17) 2 (1,04) 35 (18,23) 97 (50,52)
LLA pré-B cμ+ 1 (0,52) 4 (2,08) 3 (1,56) 4 (2,08) 12 (6,25) 7 (3,65) 2 (1,04) 3 (1,56) 12 (6,25) 24 (12,5)
LLA-B 0 (-) 2 (1,04) 1 (0,52) 0 (-) 3 (1,56) 5 (2,60) 0 (-) 0 (-) 5 (2,60) 8 (4,17)
TOTAL B 5 (2,60) 40 (20,83) 34 (17,71) 15 (7,81) 94 (48,96) 50 (26,04) 13 (6,77) 5 (2,60) 68 (35,42) 162 (84,38)
LLA pré-T 0 (-) 1 (0,52) 0 (-) 0 (-) 1 (0,52) 3 (1,56) 1 (0,52) 1 (0,52) 5 (2,60) 6 (3,13)
LLA T-intermediária 0 (-) 2 (1,04) 5 (2,60) 6 (3,13) 13 (6,77) 3 (1,56) 1 (0,52) 0 (-) 4 (2,08) 17 (8,85)
LLA-T medular 0 (-) 0 (-) 1 (0,52) 4 (2,08) 5 (2,60) 2 (1,04) 0 (-) 0 (-) 2 (1,04) 7 (3,65)
TOTAL T 0 (-) 3 (1,56) 6 (3,13) 10 (5,21) 19 (9,90) 8 (4,17) 2 (1,04) 1 (0,52) 11 (5,73) 30 (15,63)
TOTAL 5 (2,60) 43 (22,40) 40 (20,83) 25 (13,02) 113 (58,85) 58 (30,21) 15 (7,81) 6 (3,13) 79 (41,15) 192 (100)
*idade em anos

5.2 Aspectos clínicos dos pacientes
Foram registrados vários sintomas clínicos referentes aos diferentes

perfis das LLA investigadas: linfadenopatia, esplenomegalia, hepatomegalia, presença
de massas tumorais (mediastinal e abdominal), febre e infiltração extra-medular (pele,
glândula supra-renal e sistema nervoso central), devendo ser ressaltado que um único
paciente apresentou mais de um sintoma clínico. Também foi observado que cada
grupo de LLA apresentou alguns sinais específicos de acordo com o perfil
imunofenotípico (Tabelas 12 e 13).
A linfadenopatia foi o sintoma clínico mais observado nesses
pacientes, com maior predominância nas LLA de linhagem B. Na LLA pró-B ocorreu em
27 casos (81,82%), na LLA Calla+ em 77 casos (79,38%), na pré-B cμ+ em 17 casos
(20,83%) e na LLA-B madura em 6 casos (75%) (Tabela 12). Nas LLA-T, a
linfadenopatia foi observada em todos os casos de LLA-T pré-T, em 88,24%, da LLA
pré-T e 71,43% das LLA-T medular (Tabela 13).
A esplenomegalia, apesar de ser o segundo sintoma clínico mais
relatado, ocorreu em um número bem inferior de casos quando comparado a
linfadenopatia, ocorrendo também em sua maioria nas LLA de linhagem B: na LLA pró-
B ocorreu em 3 casos (9,09%), na LLA Calla+ em 8 casos (8,25%), na pré-B cμ+ em 5
casos (20,83%) e em um paciente (12,50%) diagnosticado como LLA-B (Tabela 12).
Nas LLA-T esse dado clínico foi detectado em 8 casos (47,06%) das LLA-T
intermediária e em 5 (71,43%) dos casos de LLA-T medular (Tabela 13).
A hepatomegalia também foi constatada nesses pacientes, porém
com uma distribuição de casos mais homogênea entre dois grupos de LLA. Na LLA
pró-B foi detectada em 4 casos (12,12%), em 5 casos (5,15%) das LLA Calla+ 5 e em 2
casos (8,33%) das LLA-pré-B cμ+ (Tabela 12). Nas LLA-T, a hematomegalia ocorreu
em 5/17 casos (29,41%) de LLA-T intermediária e a T medular em 4/7 (57,14%)
(Tabela 13).
A presença de massa mediastinal ocorreu exclusivamente nos
pacientes com LLA-T, onde pudemos observar um caso nas LLA pré-T (16,67%), na T
intermediária 13 casos (76,47%) e em 6 casos (85,71%) das LLA-T medular (Tabelas
12 e 13).

A presença de massas tumorais foi observada em um número
muito pequeno de casos, apenas quatro, predominando nas LLA da linhagem B com a
seguinte distribuição: 2 casos (6,06%) das LLA pró B, 1 caso (4,17%) das pré-B cμ+ e
1 caso (12,50%) das LLA-B (Tabela 12). Nas LLA-T esse dado clínico foi relatado em 3
casos (17,65%) de LLA T intermediária (Tabela 13).
Outros sintomas ou sinais clínicos foram pouco relatados no
momento da coleta ou pouco descritos nos prontuários dos pacientes, que incluíam:
infiltração da pele em 02 pacientes com LLA pró B; presença de massa abdominal em
01 paciente com LLA-B; infiltração da glândula supra-renal em 01 paciente com LLA-T
intermediária; infiltração no SNC em 02 pacientes, um com LLA-T intermediária e outro
LLA-T medular.
A febre, apesar de ser um sintoma inespecífico, é classicamente
associada aos primeiros sintomas de pacientes diagnosticados com LA e foi referida
em apenas 7 pacientes, sendo 4 em LLA da linhagem B e 3 em LLA-T.

Tabela 12 - Frequências dos dados clínicos em cada subtipo de LLA da linhagem B
Dados Clínicos n0 Testados / n0 Positivos % p-valor

LLA pró-B
Linfadenopatia 33 / 27 81,82 0,00000*
Esplenomegalia 33 / 3 9,09 0,03464*
Hepatomegalia 33 / 4 12,12 0,01644*
Massa Mediastinal 33 / 0 0 -
Massa tumoral 33 / 2 6,06 0,07227
LLA Calla+
Linfadenopatia 97 / 77 79,38 0,00000*
Esplenomegalia 97 / 8 8,25 0,00157*
Hepatomegalia 97 / 5 5,15 0,01084*
Massa tumoral 97 / 0 0 -
LLA pré-B cμ+
Linfadenopatia 24 / 17 70,83 0,00000*
Esplenomegalia 24 / 5 20,83 0,00598*
Hepatomegalia 24 / 2 8,33 0,06982
Massa tumoral 24 / 1 4,17 0,15351
LLA-B Madura
Linfadenopatia 8/6 75 0,00000*
Esplenomegalia 8/1 12,50 -
Hepatomegalia 8/0 0 -
Massa Mediastinal 8/0 0 -
Massa tumoral 8/1 12,50 -
OBS: Os p-valores com asterisco (*) significam que esses pacientes foram positivos e
apresentaram um intervalo de confiança de 95% (p-valor < 0,05), sendo estatisticamente
significativos; a proporção de pacientes com p-valores > 0,05 ou com (-) foram considerados
negativos.

Tabela 13 - Frequências dos dados clínicos em cada subtipo de LLA da linhagem T
Dados Clínicos n0 Testados / n0 Positivos % p-valor

LLA pré-T
Linfadenopatia 6/6 100 -
Esplenomegalia 6/0 0 -
Hepatomegalia 6/0 0 -
Massa Mediastinal 6/1 16,67 -
Massa tumoral 6/0 0 -
LLA-T Intermediária
Linfadenopatia 17 / 15 88,24 0,00000*
Esplenomegalia 17 / 8 47,06 0,00157*
Hepatomegalia 17 / 5 29,41 0,00389*
Massa Mediastinal 17 / 13 76,47 0,00000*
Massa tumoral 17 / 3 17,65 0,02816*
LLA-T Medular
Linfadenopatia 7/5 71,43 *
Esplenomegalia 7/5 71,43 *
Hepatomegalia 7/4 57,14 *
Massa Mediastinal 7/6 85,71 *
Massa tumoral 7/0 0 -
OBS: Os p-valores com asterisco (*) significam que esses pacientes foram positivos e
apresentaram um intervalo de confiança de 95% (p-valor < 0,05), sendo estatisticamente
significativos; a proporção de pacientes com p-valores > 0,05 ou com (-) foram considerados
negativos.

5.3 Características hematológicas
A contagem global de leucócitos mostrou-se elevada na maioria dos

casos estudados. A contagem mínima foi de 1.400/mm3, a máxima foi de 552.000/mm3
e a média de 90.000/mm3. Foram constatados 7/192 casos (3,65%) com contagem
inferior a 5.000/mm3, 7/192 (3,65%) oscilaram entre 5.000 e 10.000/mm3, 5/192
(2,60%) variaram entre 10.000 e 20.000/mm3, 53/192 (27,60%) apresentaram
contagem de leucócitos entre 20.000 e 50.000/mm3 e a maioria das LLA
diagnosticadas, 120/192 (62,5%), apresentaram leucometria maior que 50.000 cél/mm3
(Tabela 14).
Tabela 14 - Frequências da leucometria nos pacientes com LLA
Leucometria (cél/mm³) Frequência (%)

< 5.000 7 3,65
> 5.000 e ≤ 10.000 7 3,65
> 10.000 e ≤ 20.000 5 2,60
> 20.000 e ≤ 50.000 53 27,60
> 50.000 120 62,50
Total 192 100
97
Os níveis da dosagem de hemoglobina variaram de 3,0 a 14,1 g/dL,
com média de 8,15 g/dL. A maioria dos subtipos de LLA estudadas, 180/192 (93,75%),
apresentou dosagem de hemoglobina menor ou igual a 10 g/dL, e 12/192 (6,25%)
maior que 10 g/dL (Tabela 15).
Tabela 15 - Frequências da dosagem de hemoglobina nos pacientes com LLA
Dosagem de Hemoglobina (g/dL) Frequência (%)

≤ 10 180 93,75
> 10 12 6,25
Total 192 100
A contagem de plaquetas variou de 9.000 a 398.000/mm3 com

média de 70.000/mm3, apresentando as seguintes variações: 13/192 casos (6,77%)
com número de plaquetas menor ou igual a 20.000/mm3; 54/192 (28,13%) com
contagem maior que 20.000 e menor ou igual a 50.000/mm3; 96/192 (50%) com
plaquetometria maior que 50.000 e menor ou igual a 100.000/mm3; 28/192 casos
(14,58%) com número de plaquetas na faixa correspondente a maior que 100.000 e
menor ou igual a 150.000/mm3 e apenas 1/192 (0,52%) com contagem de plaquetas
acima de 150.000/mm3 (Tabela 16).
Tabela 16 - Frequências do número de plaquetas nos pacientes com LLA
№ de plaquetas/mm³ Frequência (%)

< 20.000 ou igual 13 6,77
> 20.000 e ≤ 50.000 54 28,13
> 50.000 e ≤ 100.000 96 50
> 100.000 e ≤ 150.000 28 14,58
> 150.000 1 0,52
Total 192 100
98
A contagem relativa (percentual) de células blásticas no SP variou
de 21 a 94%, com média de 82%. Dos 192 pacientes estudados 4 (2,08%)
apresentaram contagem menor ou igual a 30% de blastos, 34 (17,71%) apresentaram
mais que 30 a 70%, e a maioria dos casos, 154 (80,21%), apresentaram mais de 70%
de blastos no SP (Tabela 17).
Tabela 17 - Percentuais de blastos no SP nos pacientes com LLA
Contagem Relativa de Blastos/SP (%) Frequência %

até 30% de blastos 4 2,08
> 30 a 70% de blastos 34 17,71
> 70% de blastos 154 80,21
Total 192 100
99
5.4 Classificação morfológica FAB
A avaliação dos subtipos morfológicos foi realizada de acordo com a

classificação pr oposta pe lo grupo F ranco-Americano-Britânico (FAB) ( Bennett et al.,
1976). Desta avaliação observaram-se os seguintes resultados: LLA L1 com 116 casos
(60,42%), LLA L2 com 69 (35,94%) e LLA L3 com 7 (3,65%) (Figura 14).

Figura 1 4 - Frequências d os s ubtipos m orfológicos d a
classificação FAB nos pacientes c om LLA.
100
A Tabela 18 mostra a associação entre os três subtipos morfológicos
FAB, L1, L2 e L3 com os dados da imunofenotipagem nos 192 pacientes desse estudo.
Os três subtipos morfológicos FAB foram detectados nas LLA de
linhagem B, sendo os tipos L1 e L2 mais freqüentemente observados nas LLA Calla+
com 72 e 25 casos, respectivamente. Diferente do que foi observado no subtipo L3, em
que, apesar dos poucos casos notificados, todos ocorreram na LLA-B. Em relação às
LLA de linhagem T, observaram-se apenas os subtipos L1 e L2, sendo este último
predominante (Tabela 18).
Tabela 18 - Associação entre os subtipos morfológicos da classificação FAB e os

subtipos de LLA das linhagens B e T
LLA
Total
Diagnóstico L1 L2 L3
n (%)
n (%) n (%) n (%)
LLA pró-B 25 (13,02) 8 (4,17) 0 (-) 33 (17,19)
LLA Calla+ 72 (37,50) 25 (13,02) 0 (-) 97 (50,52)
LLA pré-B/cIgM+ 12 (6,25) 12 (6,25) 0 (-) 24 (12,5)
LLA B 1 (0,52) 0 (-) 7 (3,65) 8 (4,17)
Total linhagem B 110 (57,29) 45 (23,44) 7 (3,65) 162 (84,38)
LLA pré-T 1 (0,52) 5 (2,60) 0 (-) 6 (3,13)
LLA T intermediária 3 (1,56) 14 (7,29) 0 (-) 17 (8,85)
LLA T medular 2 (1,04) 5 (2,60) 0 (-) 7 (3,65)
Total linhagem T 6 (3,13) 24 (12,50) 0 (-) 30 (15,63)
Total 116 (60,42) 69 (35,94) 7 (3,65) 192 (100)

A Tabela 19 mostra a distribuição dos diferentes subtipos de LLA em
diferentes faixas etárias e os subtipos morfológicos da classificação FAB (L1, L2 e L3)
nos 192 pacientes desse estudo.
O subtipo L1 foi predominante tanto no grupo das crianças quanto
nos adultos. O primeiro grupo apresentou maior freqüência de casos entre as idades
pré-escolar e escolar, enquanto que os adultos jovens foram os mais freqüentes no
segundo grupo (Tabela 19).
Já o subtipo L2 apresentou-se de forma equitativa para ambos os
grupos (adultos e crianças), embora no grupo das crianças tenha sido distribuído de
forma homogênea entre as faixas etárias pré-escolar, escolar e adolescente. No grupo
dos adultos a freqüência do subtipo morfológico L2 também predominou no grupo de
adultos jovens (Tabela 19).
O subtipo L3 teve uma freqüência de casos muito baixa, porém
também situados entre as idades pré-escolar, escolar e nos adultos jovens (Tabela 19).
Tabela 19 - Associação entre os subtipos morfológicos da classificação FAB e as faixas

etárias nos pacientes com LLA
LLA
Faixa Etária
L1 L2 L3 Total
n (%) n (%) n (%) n (%)
≤ 1 ano 4 (2,08) 1 (0,52) 0 (-) 5 (2,60)
> 1 a 5 anos 31 (16,15) 10 (5,21) 2 (1,04) 43 (22,40)
Crianças
> 5 a 10 anos 26 (13,54) 13 (6,77) 1 (0,52) 40 (20,83)
> 10 a 18 anos 15 (7,81) 10 (5,21) 0 (-) 25 (13,02)
Total Crianças 76 (39,58) 34 (17,71) 3 (1,56) 113 (58,85)
> 18 a 45 anos 27 (14,06) 27 (14,06) 4 (2,08) 58 (30,21)
Adultos > 45 anos a 65 anos 11 (5,73) 4 (2,08) 0 (-) 15 (7,81)
> 65 anos 2 (1,04) 4 (2,08) 0 (-) 6 (3,13)
Total Adultos 40 (20,83) 35 (18,23) 4 (2,08) 79 (41,15)
Total 116 (60,42) 69 (35,94) 7 (3,65) 192 (100)

5.5 Imunofenotipagem
Os dados referentes às imunofenotipagens encontram-se

discriminados nas tabelas numeradas de 20 a 29. Os níveis de expressão desses
marcadores encontram-se representados pelos gráficos do tipo Box Plot (Figuras 15 a
17).
Os 192 pacientes foram diagnosticados inicialmente pela análise
citomorfógica suplementada pela coloração citoquímica de Sudan Black, confirmados
posteriormente pela imunofenotipagem com um painel de AcMo (Tabela 8), fato esse
que possibilitou a diferenciação inicial entre os tipos imunológicos B ou T das LLA.
Posteriomente com análise combinada de expressão desses marcadores houve uma
melhor caracterização dessas LLA com a subclassificação em subtipos para cada
linhagem: LLA de linhagem B (pró-B, Calla+, pré-Bcμ+ e LLA-B) e LLA de linhagem T
(pré-T, T intermediária e T medular).
No estabelecimento dos critérios de positividade para cada AcMo foi
adotado o valor mínimo de 10% de positividade para os marcadores CD34 e TdT nas
células analisadas, por serem muito sensíveis e mais específicos. Para os demais
marcadores o valor mínimo foi de 20% de positividade nas células analisadas.
Na Tabela 20 estão registrados, de modo geral, a frequência e o
nível de significância de cada AcMo utilizado para todas as LLA.
Em relação aos antígenos mielóides observou-se expressão
aberrante de alguns desses marcadores, como o sCD13 28/192 (14,58%), o cCD13
19/190 (10,53%) e o CD33 19/191 (11,52%). Outros marcadores do mesmo grupo, tais
como, o CD14, CD15 e CD11b mostraram-se pouco frequentes com positividade de
casos de 1,05%, 0,52% e 2,08%, respectivamente. Não foi observado nenhum caso de
positividade para os AcMo anti-MPO, glicoforina-alfa (CD235), CD41/61 e c-Kit
(CD117) (Tabela 20).
Em relação aos níveis de expressão dos antígenos relacionados aos
linfócitos T observou-se que o CD3 (superfície e citoplasmático) apresentou a maior
freqüência, 16/192 (8,33%) e 21/188 (11,17%), respectivamente. Embora este antígeno
seja relatado como o marcador celular mais específico para celulas T, na confecção de
um painel de AcMo para diagnóstico de LLA, existe a necessidade da adição de outros
AcMo para melhor identificação das células leucêmicas dessa linhagem, o que foi feito

no presente estudo. Assim, observou-se uma expressão significativa para os antígenos
CD7 13,97%, CD5 12,64%, CD2 10,38%, CD1a 7,61%, CD8 8,33% e CD4 3,13%
(Tabela 20).
No tocante aos antígenos relacionados às LLA de linhagem B
observou-se uma maior freqüência de expressão para os antígenos pan B: CD19,
sCD22, cCD22 e cCD79a com positividade de 73,44%, 60%, 59,09%, 73,98%,
respectivamente. Em relação as antígenos relacionados com a diferenciação celular,
constatou-se predomínio do CD10 com positividade em 52,60% dos casos, seguido
pela cadeia pesada da Imunoglobulina IgM intracitoplasmática (cμ+) com 17,49%,
CD20 (16,75%) e imunoglobulina IgM de superfície (sIgM), presente em 5,36% dos
casos (Tabela 20).
Em relação aos marcadores de linhagem não específica e de células
progenitoras, observou-se uma expressão variável indicando que a sua presença
ocorreu de forma independente da linhagem T ou B. Desta forma, o CD34 foi visto em
52,88%, o HLA-DR em 72,27%, o TdT em 60,24%. Em relação ao CD38 observou-se
expressão em 76,30% dos casos, indicando que apesar de ser um marcador de baixa
especificidade apresenta elevada sensibilidade para inúmeras neoplasias
hematológicas; assim como o CD45 que mostrou-se presente em 83,85% dos casos
(Tabela 20).

Tabela 20 - Frequências da reatividade dos anticorpos monoclonais utilizados
Frequência da Reatividade dos Anticorpos Monoclonais

Anticorpo Total № Testados № Positivos (%) P-valor
Antígenos Relacionados às Células Mielóides
CD14 192 190 2 1,05 0,07755
sCD13 192 192 28 14,58 0,00000*
cCD13 192 190 19 10,53 0,00000*
CD33 192 191 19 11,52 0,00000*
MPO 192 186 0 0 -
G-alfa 192 184 0 0 -
CD15 192 192 1 0,52 0,15802
CD11b 192 192 4 2,08 0,02163*
CD41/61 192 166 0 0 -
CD117 (c-kit) 192 177 0 0 -
Antígenos Relacionados aos Linfócitos T
sCD3 192 192 16 8,33 0,00001*
cCD3 192 188 21 11,17 0,00000*
CD4 192 192 6 3,13 0,00641*
CD8 192 192 16 8,33 0,00001*
CD7 192 179 25 13,97 0,00000*
CD1a 192 184 14 7,61 0,00005*
CD2 192 183 19 10,38 0,00000*
CD5 192 182 23 12,64 0,00000*
Antígenos Relacionados aos Linfócitos B
CD10 192 192 101 52,60 0,00000*
CD19 192 192 141 73,44 0,00000*
CD20 192 191 32 16,75 0,00000*
sCD22 192 190 114 60 0,00000*
cCD22 192 132 78 59,09 0,00000*
sCD79a 192 98 9 9,18 0,00082*
cCD79a 192 123 91 73,98 0,00000*
sIgM 192 168 9 5,36 0,00186*
cIgM 192 183 32 17,49 0,00000*
Outros Marcadores Celulares
CD34 192 191 101 52,88 0,00000*
HLA-DR 192 176 136 77,27 0,00000*
CD38 192 173 132 76,30 0,00000*
TdT 192 166 100 60,24 0,00000*
CD45 192 192 161 83,85 0,00000*
CD16/56 192 192 0 0 -
OBS: Os p-valores com asterisco (*) significam que esses pacientes foram positivos e apresentaram um intervalo de confiança
de 95% (p-valor < 0,05), sendo estatisticamente significativos; a proporção de pacientes com p-valores > 0,05 ou com (-) foram
considerados negativos.

As Tabelas 21 e 22 mostram separadamente os resultados e a
significância dos AcMo empregados na caracterização das LLA de linhagem B e T.
Nas LLA de linhagem B, a presença de antígenos aberrantes foi
evidenciada principalmente pela expressão dos seguintes marcadores mielóides:
sCD13 em 24/162 casos, cCD13 em 18/160 e CD33 em 17/162. Outros marcadores do
mesmo grupo, tais como o CD14, CD15 e CD11b mostraram-se pouco expressos com
positividade de 1,24%, 0,62% e 0,62%, respectivamente, não sendo detectado nenhum
caso com expressão da glicoforina alfa, glicoproteínas plaquetárias (CD41 e CD61),
receptor para c-kit (CD117) e mieloperoxidase (Tabela 21).
Em relação à presença de antígenos relacionados aos linfócitos T
nas LLA de linhagem B, foi evidenciada expressão pouco significativa em alguns casos
para o CD3 e CD5, provavelmente resultante de contaminação por linfócitos T residuais
presentes nas amostras (Tabela 21).
A expressão dos antígenos relacionados aos linfócitos B foi bem
evidenciada caracterizando-se pela elevada positividade de antígenos pan B: CD19 em
140/162 (86,42%), sCD22 em 114/160 (71,25%), cCD22 em 78/104 (75%) e cCD79a
em 89/94 (94,68%). Em relação aos antígenos relacionados à maturação celular,
observou-se a expressão do CD10 em 98/162 (60,49%), CD20 em 13/162 (8,02%),
cIgM em 32/153 (20,92%) e sIgM em 9/140 (6,43%) (Tabela 21).
No tocante a expressão dos marcadores de linhagem não específica
e de células progenitoras, observou-se a presença do CD45 em 83,33% dos casos,
CD34 em 55,28% dos casos, HLA-DR em 88,08%, CD38 em 74,31%, TdT em 56,93%
dos casos (Tabela 21).
Nos 30 casos de LLA da linhagem T, a expressão do fenótipo
aberrante de antígenos mielóides também foi detectada, porém em um pequeno
número de casos, predominando o sCD13 em 13,33%, seguido pelo CD33 em 6,90%,
cCD13 em 3,33% e CD11b em 10% dos casos; não tendo ocorrido nenhum caso de
positividade para os AcMo anti-MPO, glicoforina-alfa, CD41/61 e c-Kit (CD117) (Tabela
22).
Em relação aos antígenos pan T, observou-se forte expressão
antigênica para o CD7 em 96,67%, CD5 em 73,33%, cCD3 em 93,33%, CD2 em 50% e
sCD3 em 30%, este último presente no grupo de LLA-T mais madura. Em relação aos
antígenos relacionados à maturação celular, observou-se a expressão do CD8 em
66,67%, CD4 em 63,33% e CD1a em 36% (Tabela 22).

Quanto a expressão dos marcadores de linhagem não específica e
de células progenitoras observou-se a presença do CD45 em 86,67% dos casos, CD38
em 86,21% dos casos, TdT em 75,86% dos casos, CD34 em 36,67% dos casos e HLA-
DR em 19,23% (Tabela 22).

Tabela 21 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA da linhagem B
LLA da linhagem B
CD14 162 161 2 1,24 0,07736
sCD13 162 162 24 14,81 0,00000*
cCD13 162 160 18 11,25 0,00000*
CD33 162 162 17 10,49 0,00001*
MPO 162 156 0 0 -
G-alfa 162 154 0 0 -
CD15 162 162 1 0,62 0,15791
CD11b 162 162 1 0,62 0,15791
CD41/61 162 139 0 0 -
CD117 (c-kit) 162 148 0 0 -
sCD3 162 162 3 1,85 0,04020*
cCD3 162 162 0 0 -
CD4 162 162 0 0 -
CD8 162 162 0 0 -
CD7 162 155 0 0 -
CD1a 162 159 0 0 -
CD2 162 153 0 0 -
CD5 162 154 1 0,65 0,15786
CD10 162 162 98 60,49 0,00000*
CD19 162 162 140 86,42 0,00000*
CD20 162 162 13 8,02 0,00001*
sCD22 162 160 114 71,25 0,00000*
cCD22 162 104 78 75 0,00000*
sCD79a 162 85 9 10,59 0,00076*
cCD79a 162 94 89 94,68 0,00000*
sIgM 162 140 9 6,43 0,00178*
cIgM 162 153 32 20,92 0,00000*
CD34 162 161 89 55,28 0,00000*
HLA-DR 162 151 133 88,08 0,00000*
CD38 162 144 107 74,31 0,00000*
TdT 162 137 78 56,93 0,00000*
CD45 162 162 135 83,33 0,00000*
CD16/56 162 162 0 0 -
OBS: Os p-valores com asterisco (*) significam que esses pacientes foram positivos e apresentaram um intervalo de
confiança de 95% (p-valor < 0,05), sendo estatisticamente significativos; a proporção de pacientes com p-valores > 0,05 ou
com (-) foram considerados negativos.

Tabela 22 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA da linhagem T
LLA da linhagemT
CD14 30 29 0 0 -
sCD13 30 30 4 13,33 0,01584*
cCD13 30 30 1 3,33 0,15455
CD33 30 29 2 6,90 0,07137
MPO 30 30 0 0 -
G-alfa 30 30 0 0 -
CD15 30 30 0 0 -
CD11b 30 30 3 10 0,03394*
CD41/61 30 27 9 33,33 0,00012*
CD117 (c-kit) 30 29 0 0 -
Antígenos Relacionados aos linfócitos T
sCD3 30 30 9 30 0,00000*
cCD3 30 30 28 93,33 0,00000*
CD4 30 30 19 63,33 0,00000*
CD8 30 30 20 66,67 0,00000*
CD7 30 30 29 96,67 0,00000*
CD1a 30 25 9 36 0,00000*
CD2 30 20 10 50 0,00000*
CD5 30 30 22 73,33 0,00000*
Antígenos Relacionados aos linfócitos B
CD10 30 30 3 10 0,03394*
CD19 30 30 1 3,33 0,15455
CD20 30 30 0 0 -
sCD22 30 30 0 0 -
cCD22 30 28 0 0 -
sCD79a 30 18 0 0 -
cCD79a 30 29 2 6,90 0,07137
sIgM 30 28 0 0 -
cIgM 30 30 0 0 -
CD34 30 30 11 36,67 0,00002*
HLA-DR 30 30 5 16,67 0,00642*
CD38 30 30 29 96,67 0,00000*
TdT 30 29 22 75,86 0,00000*
CD45 30 30 26 86,67 0,00000*
CD16/56 30 30 0 0 -

As Tabelas numeradas de 23 a 26 mostram a significância de cada
marcador celular em cada subgrupo das LLA da linhagem B classificadas pela
imunofenotipagem.
Na LLA pró-B observou-se pouco número de casos com expressão
aberrante de antígenos mielóides. Esse tipo de LLA foi caracterizada pela elevada
expressão de antígenos pan B tais como CD19, cCD79a e cCD22 presentes em
84,85%, 80% e 64,71% dos casos associados com forte positividade de antígenos
relacionados a imaturidade celular, tais como TdT em 50% e CD34 em 51,52% dos
casos (Tabela 23).
Na LLA comum, caracterizada pela expressão do antígeno CD10, a
presença de fenótipo aberrante foi mais acentuada que nos outros grupos de LLA,
predominando também a expressão do sCD13 em 21,65%, seguido pelo CD33 em
15,46% e cCD13 em 14,58% dos casos. Embora em menor freqüência observou-se a
expressão do CD14 em 2/96 (2,08%), CD15 e o CD11b cada um expresso em um caso
(1,03%). Nessas LLA a ocorrência de expressão de antígenos pan B foi: CD19 em
88,66%, cCD22 em 73,85%, sCD22 em 73,96%, cCD79a em 96,36%, sendo negativos
para CD20 e IgM de superfície, e fracamente positivo em 6 casos para a IgM
citoplasmática. Ainda nesse grupo, o TdT esteve presente em 64,94%, o CD34 em
63,54% e o HLA-DR em 94,32% (Tabela 24).
Na LLA pré-B cμ+, caracterizada pela presença da cadeia pesada da
imunoglobulina IgM intracitoplasmática (cμ+), a expressão de antígenos aberrantes foi
muito baixa. Os antígenos pan B, CD19 e cCD22 foram expressos cada um em 87,50%
dos casos, o cCD79a em 95,24% e o sCD22 em 73,91% dos casos. Por se tratar de
uma LLA com maturação celular avançada observou-se maior positividade para o
CD20 associado a uma menor expressão do CD10 correpondendo a 9/24 e 5/24 dos
casos, respectivamente (Tabela 25).
A LLA-B madura foi caracterizada pela presença da cadeia pesada
da imunoglobulina IgM de superfície (sIgM+) associada com ausência de expressão
dos antígenos de células progenitoras como o CD34 e o TdT. Esse subtipo também
apresenta uma característica morfológica da classificação FAB L3 (Tabela 26).

Tabela 23 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA pró-B
LLA Pró-B
Anticorpo Total Testados
(%) P-valor
CD14 33 33 0 0 -
sCD13 33 33 2 6,06 0,07227
cCD13 33 32 0 0 -
CD33 33 33 1 3,03 0,15493
MPO 33 32 0 0 -
G-alfa 33 32 0 0 -
CD15 33 33 0 0 -
CD11b 33 33 0 0 -
CD41/61 33 30 0 0 -
CD117 (c-kit) 33 29 0 0 -
sCD3 33 33 1 3,03 0,15493*
cCD3 33 32 0 0 -
CD4 33 33 0 0 -
CD8 33 33 0 0 -
CD7 33 32 0 0 -
CD1a 33 32 0 0 -
CD2 33 32 0 0 -
CD5 33 31 0 0 -
CD10 33 33 0 0 -
CD19 33 33 28 84,85 0,00000*
CD20 33 32 2 6,25 0,07206
sCD22 33 33 20 60,61 0,00000*
cCD22 33 17 11 64,71 0,00000*
sCD79a 33 9 0 0 -
cCD79a 33 10 8 80 0,00000*
sIgM 33 29 1 3,45 0,15441
cIgM 33 29 1 3,45 0,15441
CD34 33 33 17 51,52 0,00000*
HLA-DR 33 31 24 77,42 0,00000*
CD38 33 29 14 48,28 0,00000*
TdT 33 28 14 50 0,00000*
CD45 33 33 30 90,91 0,00000*
CD16/56 33 33 0 0 -

Tabela 24 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA Calla+
LLA Calla+
CD14 97 96 2 2,08 0,07648
sCD13 97 97 21 21,65 0,00000*
cCD13 97 96 14 14,58 0,00003*
CD33 97 97 15 15,46 0,00001*
MPO 97 92 0 0 -
G-alfa 97 91 0 0 -
CD15 97 97 1 1,03 0,15740
CD11b 97 97 1 1,03 0,15740
CD41/61 97 82 0 0 -
CD117 (c-kit) 97 87 0 0 -
sCD3 97 97 2 2,06 0,07650
cCD3 97 94 1 1,06 0,15736
CD4 97 97 0 0 -
CD8 97 97 0 0 -
CD7 97 89 0 0 -
CD1a 97 93 0 0 -
CD2 97 90 0 0 -
CD5 97 90 1 1,11 0,15730
CD10 97 97 97 100 0,00000*
CD19 97 97 86 88,66 0,00000*
CD20 97 97 0 0 -
sCD22 97 96 71 73,96 0,00000*
cCD22 97 65 48 73,85 0,00000*
sCD79a 97 54 8 14,81 0,00109*
cCD79a 97 55 53 96,36 0,00000*
sIgM 97 79 0 0 -
cIgM 97 88 6** 6,82 0,00558*
CD34 97 96 61 63,54 0,00000*
HLA-DR 97 88 83 94,32 0,00000*
CD38 97 86 66 76,74 0,00000*
TdT 97 77 50 64,94 0,00000*
CD45 97 97 78 80,41 0,00000*
CD16/56 97 97 0 0 -
OBS: **Baixa expressão antigênica; Os p-valores com asterisco (*) significam que esses pacientes foram positivos e
apresentaram um intervalo de confiança de 95% (p-valor < 0,05), sendo estatisticamente significativos; a proporção de
pacientes com p-valores > 0,05 ou com (-) foram considerados negativos.

Tabela 25 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA pré-B cμ+
LLA pré-B cμ+

CD14 24 24 0 0 -
sCD13 24 24 1 4,17 0,15351
cCD13 24 24 4 16,67 0,01423*
CD33 24 24 1 4,17 0,15351
MPO 24 24 0 0 -
G-alfa 24 24 0 0 -
CD15 24 24 0 0 -
CD11b 24 24 0 0 -
CD41/61 24 19 0 0 -
CD117 (c-kit) 24 24 0 0 -
sCD3 24 24 0 0 -
cCD3 24 24 0 0 -
CD4 24 24 0 0 -
CD8 24 24 0 0 -
CD7 24 24 0 0 -
CD1a 24 24 0 0 -
CD2 24 24 0 0 -
CD5 24 23 0 0 -
CD10 24 24 5 20,83 0,00598*
CD19 24 24 21 87,50 0,00000*
CD20 24 24 9 37,50 0,00007*
sCD22 24 23 17 73,91 0,00000*
cCD22 24 16 14 87,50 0,00000*
sCD79a 24 15 0 0 -
cCD79a 24 21 20 95,24 0,00000*
sIgM 24 24 24 100 0,00000*
cIgM 24 24 24 100 0,00000*
CD34 24 24 11 45,83 0,00000*
HLA-DR 24 23 18 78,26 0,00000*
CD38 24 21 20 95,23 0,00000*
TdT 24 24 12 50 0,00000*
CD45 24 24 19 79,17 0,00000*
CD16/56 24 24 0 0 -
OBS: Os p-valores com asterisco (*) significam que esses pacientes foram positivos e apresentaram um intervalo de confiança de 95%
(p-valor < 0,05), sendo estatisticamente significativos; a proporção de pacientes com p-valores > 0,05 ou com (-) foram considerados
negativos.

Tabela 26 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA-B
LLA-B
CD14 8 8 0 0 -
sCD13 8 8 0 0 -
cCD13 8 8 0 0 -
CD33 8 8 0 0 -
MPO 8 8 0 0 -
G-alfa 8 7 0 0 -
CD15 8 8 0 0 -
CD11b 8 8 0 0 -
CD41/61 8 8 0 0 -
CD117 (c-kit) 8 8 0 0 -
sCD3 8 8 0 0 -
cCD3 8 8 0 0 -
CD4 8 8 0 0 -
CD8 8 8 0 0 -
CD7 8 7 0 0 -
CD1a 8 8 0 0 -
CD2 8 7 0 0 -
CD5 8 8 0 0 -
CD10 8 8 2 25
CD19 8 8 6 75 *
CD20 8 8 4 50 *
sCD22 8 8 4 50 *
cCD22 8 7 4 57,14 *
sCD79a 8 7 1 14,29 -
cCD79a 8 7 2 28,57
sIgM 8 8 8 100 *
cIgM 8 8 2 25 -
CD34 8 8 0 0 -
HLA-DR 8 8 6 75 *
CD38 8 8 7 87,5 *
TdT 8 8 0 0 -
CD45 8 8 8 100 -
CD16/56 8 8 0 0 -

As Figuras de 15 a 18 são a representação gráfica do tipo Box Plot
dos níveis de expressão dos antígenos pan B: CD19, cCD79a, cCD22 e sCD22,
respectivamente, nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.
Figura 15. Representação gráfica do tipo Box Plot dos níveis de expressão do antígeno
CD19 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.
OBS.: As figuras em estrela (*) correspondem aos casos com valores extremos. As figuras em
ponto (•) representam os casos com valores externos. A linha inferior da caixa corresponde ao
primeiro quartil, a linha superior corresponde ao terceiro quartil e a linha dentro da caixa
corresponde a mediana. O eixo X corresponde aos subtipos de LLA estudados, e no eixo Y
corresponde o percentual de positividade para o anticorpo analisado. Considera-se positivo
quando o percentual encontra-se acima de 20%.

cCD79a nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

cCD22 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

sCD22 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

dos níveis de expressão dos antígenos B relacionados à maturação celular: CD20,
sIgM, CD10 e cIgM, respectivamente, nos diferentes tipos de LLA determinada pela
imunofenotipagem.

sIgM nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.


cIgM nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

As Tabelas numeradas de 27 a 29 mostram a significância dos
AcMo em cada subgrupo das LLA-T classificadas através da imunofenotipagem por
citometria de fluxo.
A LLA pré-T ocorreu em poucos casos, constatando-se predomínio
de expressão dos antígenos pan T CD7 e cCD3 associado ao TdT, sendo também
observada a expressão do antígeno CD8 em 3 casos (Tabela 27).
Na LLA-T intermediária, representada por 17 pacientes, observou-se
a expressão aberrante do antígeno CD13 em 4 casos: um intracitoplásmático e três de
superfície. Ainda neste contexto, detectectou-se expressão aberrante do antígeno
CD10 em 2 casos, um dos quais com baixa contagem de células positivas, sugerindo
uma contaminação residual por células precursoras B, já que a amostra foi oriunda de
MO. Em relação aos antígenos específicos, observou-se uma grande quantidade de
células blásticas com expressão do antígenos Pan T, tais como o CD7 (100%), CD5
(88,24%), CD2 (77,78%) e CD3, intracitoplasmático e de superfície com 94,12% e
35,29% dos casos, respectivamente, detectando-se também antígenos associados a
maturação celular, tais como CD1a, CD8 e CD4 em todos os casos, valendo salientar
que o fenótipo CD1a+/CD4+/CD8+ é uma das características imunológicas desse
grupo de LLA. Em relação à expressão de antígenos de linhagens não específicas e de
células progenitoras, detectou-se o CD34, TdT e HLAD-DR em 29,41%, 56,25% e
17,65% dos casos, respectivamente (Tabela 28).
Nas LLA-T medular, a expressão simutânea dos antígenos pan T
CD3, CD5, CD7 e CD2 em 100% dos casos, associada à perda da expressão do CD1a
e dicotomia dos antígenos CD4 e CD8, caracterizou o fenótipo dessas LLA. No tocante
aos antígenos não específicos e de imaturidade, observou-se a expressão do TdT em
5/7 casos e CD34 em 3/7 casos . Ainda nessas leucemias, a presença de fenótipo
aberrante se resumiu a um único caso com expressão do sCD13 (Tabela 29).

Tabela 27 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA pré-T
LLA pré-T
№
Anticorpo Total № Testados Positivos (%) P-valor
CD14 6 5 0 0 -
sCD13 6 6 0 0 -
cCD13 6 6 0 0 -
CD33 6 5 0 0 -
MPO 6 6 0 0 -
G-alfa 6 6 0 0 -
CD15 6 6 0 0 -
CD11b 6 6 3 50 *
CD41/61 6 4 0 0 -
CD117 (c-kit) 6 6 0 0 -
sCD3 6 6 1 16,67
cCD3 6 6 6 100
CD4 6 6 0 0 -
CD8 6 6 3 50 *
CD7 6 3 3 100
CD1a 6 3 0 0 -
CD2 6 6 0 0 -
CD5 6 6 0 0 -
CD10 6 6 0 0 -
CD19 6 6 0 0 -
CD20 6 6 0 0 -
sCD22 6 6 0 0 -
cCD22 6 4 0 0 -
sCD79a 6 4 0 0 -
cCD79a 6 5 0 0 -
sIgM 6 4 0 0 -
cIgM 6 6 0 0 -
CD34 6 6 0 0 -
HLA-DR 6 2 0 0 -
CD38 6 5 5 100
TdT 6 6 6 100
CD45 6 6 3 50 *
CD16/56 6 6 0 0 -

Tabela 28 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA-T intermediária
LLA-T intermediária
CD14 17 17 0 0 -
sCD13 17 17 3 17,65 0,02816*
cCD13 17 17 1 5,88 0,15132
CD33 17 17 2 11,76 0,006609
MPO 17 17 0 0 -
G-alfa 17 17 0 0 -
CD15 17 17 0 0 -
CD11b 17 17 0 0 -
CD41/61 17 16 0 0 -
CD117 (c-kit) 17 16 0 0 -
sCD3 17 17 6 35,29 0,00005*
cCD3 17 17 16 94,12 0,00000*
CD4 17 17 2 11,76 0,06609
CD8 17 17 8 47,06 0,00005*
CD7 17 17 17 100 0,00000*
CD1a 17 17 13 76,47 0,00000*
CD2 17 9 7 77,78 0,00000*
CD5 17 17 15 88,24 0,00000*
CD10 17 17 2 11,76 0,06609
CD19 17 17 1 5,88 0,15132
CD20 17 17 0 0 -
sCD22 17 16 1 6,25 0,15085
cCD22 17 16 0 0 -
sCD79a 17 7 0 0 -
cCD79a 17 8 2 25 0,05124
sIgM 17 16 0 0 -
cIgM 17 17 0 0 -
CD34 17 17 5 29,41 0,00005*
HLA-DR 17 17 3 17,65 0,02816*
CD38 17 17 14 82,35 0,00000*
TdT 17 16 9 56,25 0,00000*
CD45 17 17 16 94,12 0,00000*
CD16/56 17 17 0 0 -

Tabela 29 - Resultados da imunofenotipagem nas LLA-T medular
LLA-T medular
CD14 7 7 0 0 -
sCD13 7 7 1 14,29
cCD13 7 7 0 0 -
CD33 7 7 0 0 -
MPO 7 7 0 0 -
G-alfa 7 7 0 0 -
CD15 7 7 0 0 -
CD11b 7 7 0 0 -
CD41/61 7 7 0 0 -
CD117 (c-kit) 7 7 0 0 -
sCD3 7 7 4 57,14 *
cCD3 7 7 3 42,86
CD4 7 7 4 57,14 *
CD8 7 7 5 71,43 *
CD7 7 7 6 85,71 *
CD1a 7 7 1 14,29
CD2 7 7 6 85,71 *
CD5 7 7 7 100
CD10 7 7 1 14,29
CD19 7 7 1 14,29
CD20 7 7 0 0 -
sCD22 7 7 0 0 -
cCD22 7 5 0 0 -
sCD79a 7 2 0 0 -
cCD79a 7 4 0 0 -
sIgM 7 7 0 0 -
cIgM 7 7 0 0 -
CD34 7 7 3 42,86 *
HLA-DR 7 7 2 28,57
CD38 7 7 6 85,71 *
TdT 7 7 5 71,43 *
CD45 7 7 7 100
CD16/56 7 7 0 0 -

dos níveis de expressão dos antígenos inespecíficos e relacionados com imaturidade:
CD34, TdT, HLADR e CD38, respectivamente, nos diferentes tipos de LLA determinada
pela imunofenotipagem.
ponto(•) representam os casos com valores externos. A linha inferior da caixa corresponde ao

TdT nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

HLADR nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.


5.6 Imunofenótipos aberrantes
Dos 192 pac ientes d iagnosticados c om LLA , det ectou-se a

presença de f enótipo a berrante (FA) em 66 c asos, a lguns c om mais de um t ipo de
antígeno ( Tabelas 20 a 29). Dentre es tes, det ectou-se o pr edomínio do C D13 de
superfíce com 28 dos 66 casos, seguido pelo CD13 intracitoplasmático e CD33 ambos
com 19/66 casos, cada um (Figura 27).
Figura 27 - Distribuição das f reqüências das ex pressões dos

antígenos aberrantes (sCD13, cCD13 e CD33) nas LLA.
131
Dentro desse grupo de LLA, observou-se FA em 59 casos de LLA de linhagem B
e 7 nas LLA-T, cuja distribuição encontra-se resumida na Figura 28.
Figura 28. Distribuição das Frequências de cada FA (sCD13, cCD13, CD33) nas
linhagens B e T.
132
dos níveis de expressão dos antígenos mielóides: sCD13, cCD13, CD33, CD15,
CD11b, CD14, Glicoforina alfa e CD41/61, respectivamente, nos diferentes tipos de
LLA determinada pela imunofenotipagem.

mielóide sCD13 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

mielóide cCD13 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.

mielóide CD33 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.


mielóide CD11b nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.


mielóide G-alfa nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.
corresponde ao percentual de positividade para o anticorpo analisados. Os níveis de expressão
da glicoforina alfa encontram-se abaixo do limite mínino para ser considerado positivo (> 20%).

mielóide CD41/61 nos diferentes tipos de LLA determinada pela imunofenotipagem.
corresponde ao percentual de positividade para o anticorpo analisados. Os níveis de expressão
do antígeno CD41/CD41 encontram-se abaixo do limite mínino para ser considerado positivo (>
20%).

As Tabelas de 30 a 31 mostram associações entre a expressão dos
FAs (sCD13, cCD13 e/ou CD33) com o tipo de linhagem celular (B ou T), o gênero, a
faixa etária e o subtipo da classificação morfológica FAB (L1, L2 e L3),
respectivamente.
Na correlação entre a expressão do sCD13 com 28/66 casos
(42,42%) e o tipo de linhagem celular observou-se que a maioria (24/66 casos -
36,36%) ocorreu nas LLA da linhagem B: Pró-B com 2/66 (3,03%), Calla+ com 21/66
(31,82%) e Pré-B/cIgM com 1/66 (1,52%). Nas LLA da linhagem T foram notificados
4/66 casos (6,06%), sendo distribuídos apenas nas LLA T intermediária com 3/66
(4,55%) e T medular com 1/66 (1,52%) (Tabela 30).
Correlacionado, agora, esse mesmo marcador com o sexo
masculino observou-se que ocorreram 17/66 casos (25,76%), dos quais 16/66
(24,24%) foram nas LLA da linhagem B principalmente no subtipo Calla+ (14/66 casos -
21,21%), seguida pela Pró-B e Pré-B/cIgM com 1/66 caso (1,52%), cada. Já nas LLA
da linhagem T a distribuição ocorreu unicamente na T intermediária (1,52%) (Tabela
30).
Quanto ao sexo feminino observou-se que dos 11/66 casos
(16,67%) ocorridos, novamente predominou nas LLA da linhagem B com 8/66 casos
(12,12%), sendo distribuídos entre a Pró-B com 1/66 caso (1,52%) e a Calla+ com 7/66
(10,61%). Nas LLA da linhagem T foram notificados 3/66 casos (4,55%), em que 2/66
casos (3,03%) foram na T intermediária e 1/66 caso (1,52%) na T medular (Tabela 30).
Os níveis de expressão para os AcMo cCD13 e CD33 foram iguais,
19/66 (28,79%) para cada, e correlacionado-os com o sexo observou-se que o feminino
predominou, embora discretamente, com 10/66 casos (15,15%) para ambos. Em
relação ao tipo celular afetado as LLA de linhagem B novamente predominaram com
18/66 casos (27,27%) e 17/66 (25,76%), respectivamente, porém ressaltando a maior
freqüência para a LLA Calla+ com 10/66 (15,15%) e 9/66 (13,64%) (Tabela 30).

Tabela 30 - Associação entre os fenótipos aberrantes e o gênero
Fenótipos Aberrantes (FA)

sCD13 cCD13 CD33
Diagnóstico n (%) n (%) n (%) TOTAL

Sexo Sexo Sexo n (%)
Total Total Total
M F M F M F
n (%) n (%) n (%)
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
LLA Pró-B 1 (1,52%) 1 (1,52%) 2 (3,03%) 0 (0%) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 3 (4,55%)
LLA Calla+ 14 (21,21%) 7 (10,61%) 21 (31,82%) 4 (6,06%) 10 (15,15%) 14 (21,21%) 6 (9,09%) 9 (13,64%) 15 (22,73%) 50 (75,76%)
LLA pré-B / cIgM+ 1 (1,52%) 0 (-) 1 (1,52%) 4 (6,06%) 0 (-) 4 (6,06%) 1 (1,52%) 0 (-) 1 (1,52%) 6 (9,09%)
LLA B 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-)
Total linhagem B 16 (24,24%) 8 (12,12%) 24 (36,36%) 8 (12,12%) 10 (15,15%) 18 (27,27%) 7 (10,61%) 10 (15,15%) 17 (25,76%) 59 (89,39%)
LLA pré-T 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-)
LLA T intermediária 1 (1,52%) 2 (3,03%) 3 (4,55%) 0 (-) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 0 (-) 2 (3,03%) 2 (3,03%) 6 (9,09%)
LLA T medular 0 (-) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%)
Total linhagem T 1 (1,52%) 3 (4,55%) 4 (6,06%) 0 (-) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 0 (-) 2 (3,03%) 2 (3,03%) 7 (10,61%)
TOTAL 17 (25,76%) 11 (16,67%) 28 (42,42%) 8 (12,12%) 11 (16,67%) 19 (28,79%) 7 (10,61%) 12 (18,18%) 19 (28,79%) 66 (100%)
142
Em relação à distribuição da freqüência de casos entre os FAs
observados com o tipo de linhagem celular (B ou T) e a faixa etária, o grupo das
crianças foi o mais prevalente, com 45/66 casos (68,18%), onde a maioria ocorreu nas
LLA de linhagem B (39/66 casos – 59,09%), principalmente com o marcador aberrante
sCD13 (19/66 casos – 28,79%). Já no grupo dos adultos a expressão de FAs foi bem
inferior, 18/66 (27,27%), e novamente a quase totalidade dos casos ocorrendo nas LLA
de linhagem B (17/66 casos - 25,76%), porém de forma equilibrada para os três
marcadores aberrantes. No grupo dos idosos a expressão de FAs foi ínfima, 3/66
(4,55%), sendo distriuídos exclusivamente nas LLA de linhagem B (Tabela 31).
Analisando as LLA de linhagem B, as mais acometidas por FAs,
ficou evidente, independente da faixa etária, a maior predominância para o subtipo
Calla+ (Figura 31).

Tabela 31 - Associação entre os fenótipos aberrantes e a faixa etária
Fenótipos Aberrantes (FA)
Crianças Adultos Idosos TOTAL

Diagnóstico
Total Total Total n (%)
sCD13 cCD13 CD33 sCD13 cCD13 CD33 sCD13 cCD13 CD33
Crianças Adultos Idosos
n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)
n (%) n (%) n (%)
LLA pró-B 2 (3,03%) 0 (-) 0 (-) 2 (3,03%) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 2 (3,03%)
LLA Calla+ 17 (25,76%) 8 (12,12%) 10 (15,15%) 25 (37,88%) 3 (4,55%) 5 (7,58%) 5 (7,58%) 13 (19,70%) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 0 (-) 2 (3,03%) 40 (60,61%)
LLA pré-B / cIgM+ 0 (-) 2 (3,03%) 0 (-) 2 (3,03%) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 1 (1,52%) 3 (4,55%) 0 (-) 1 (1,52%) 0 (-) 1 (1,52%) 6 (9,09%)
LLA B 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-)
Total linhagem B 19 (28,79%) 10 (15,15%) 10 (15,15%) 39 (59,09%) 4 (6,06%) 6 (9,09%) 7 (10,61%) 17 (25,76%) 1 (1,52%) 2 (3,03%) 0 (-) 3 (4,55%) 59 (89,40%)
LLA pré-T 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-)
LLA T intermediária 3 (4,55%) 1 (1,52%) 2 (3,03%) 6 (9,09%) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 6 (9,09%)
LLA T medular 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%)
Total linhagem T 3 (4,55%) 1 (1,52%) 2 (3,03%) 6 (9,09%) 1 (1,52%) 0 (-) 0 (-) 1 (1,52%) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 0 (-) 7 (10,61%)
TOTAL 22 (33,33%) 11 (16,67%) 12 (18,18%) 45 (68,18%) 5 (7,58%) 6 (9,09%) 7 (10,61%) 18 (27,27%) 1 (1,52%) 2 (3,03%) 0 (-) 3 (4,55%) 66 (100%)
144
6 DISCUSSÃO
O presente estudo é a primeira pesquisa realizada no Estado do Rio

Grande do Norte no emprego da citometria de fluxo na caracterização do perfil
imunofenotípico da leucemia linfoblastica aguda (LLA), determinando assim os diversos
subtipos imunológicos bem como suas características clínicas, hematológicas e
epidemiológicas.
A LLA caracteriza-se pelo desenvolvimento de células imaturas,
denominadas linfoblastos que, rápida e progressivamente infiltram a MO causando uma
redução na produção nos elementos sanguíneos normais, tais como eritrócitos,
leucócitos maduros e funcionais e plaquetas, resultando nas complicações clínicas
comumente observadas nessa doença, tais como anemia, infecções e fenômenos
hemorrágicos (Emerenciano, 2004; Oliveira, 2004; Elman, 2007; Onciu, 2009;
Hamerschlak, 2010).
Com o tempo, os blastos leucêmicos tendem a circular no SP e,
eventualmente infiltram-se nos linfonodos, baço e outros órgãos vitais. Nestas
leucemias as infiltrações, testicular, na região mediastinal e no sistema nervoso central
(SNC) também podem ser observados em alguns casos (Hamerschlak, 2010).
Embora a LLA possa ocorrer em qualquer idade, sua incidência é
maior entre crianças de 2 a 5 anos, ocorrendo em torno de 70% dos casos, sendo mais
comuns naquelas de cor branca e do sexo masculino. Entre os adolescentes e os
adultos jovens a incidência das LA ocorre em torno de 20% dos casos, aumentando
após os 60 anos de idade (Tabela 9) (Pui, 2004; Pui, 2008; Onciu, 2009; Hamerschlak,
2010).
Em nossa pesquisa a maioria dos diagnósticos dos casos de LLA foi
em crianças (58,85%) (Tabela 10), o que condiz com os dados epidemiológicos já
descritos na literatura, os quais também relatam uma menor incidência de LLA em
adultos (Pui, 2004; Pui, 2008; Onciu, 2009; Hamerschlak, 2010).
Em nossa casuística também foi observado o modelo bimodal de
incidência, sendo, no entanto, detectado o segundo pico de freqüência em uma faixa
etária mais jovem na população adulta, contrastando com os relatos desses
pesquisadores (Tabela 10 e Figura 13). Tal fato pode ser justificado pelo pequeno

número de casos de LLA em idosos presentes em nossa amostragem. No entanto,
resultados, de certa forma, similares ao nosso foram observados em um estudo
epidemiológico divulgado pela Fundação Oncocentro de São Paulo em 2006 (FOSP,
2006).
Ao analisarmos a correlação entre os subtipos de LLA e o gênero
observou-se uma maior freqüência geral para o sexo masculino (56,77%), dados que
concordam com a Fundação Oncocentro de São Paulo (FOSP, 2006) e o Instituto
Nacional de Câncer (INCA, 2012). A maior freqüência do sexo masculino também se
manteve nos subtipos das linhagens B, diferente do observado nas LLA-T, que
apresentou dados com uma distribuição das freqüências equilibrada para ambos os
sexos, porém o que de fato pode ser observado a partir desses resultados é que com o
p-valor obtido de 0,4151 a um nível de significância de 5% (0,05) não há diferença
entre os gêneros quanto ao diagnóstico, isto é, as populações são homogêneas
(Tabela 9).
A maioria dos casos avaliados em nosso trabalho foram LLA de
linhagem B (84,38%), em que o subtipo Calla+ foi o que apresentou maior freqüência.
O grupo de idade variando entre 1 a 5 anos foi o mais acometido por esse subtipo de
LLA, resultado semelhante ao observado em países em desenvolvimento (Tabelas 9 e
10) (Eden, 2010).
A LLA do tipo Comum (Calla+) representa 75% dos casos da LLA
infantil e 50% dos casos em adultos. Nessas leucemias as células expressam o
antígeno CD10, o que causa um impacto favorável no prognóstico, além dos antígenos
pan B, como o cCD22 e/ou sCD22, CD19 e cCD79a (Figura 4) (Consolini, 1998;
Reynolds, 2002;, Murray, 2002; Maguer-Satta, 2011).
Embora com freqüências bem menores, as LLA da linhagem T foram
notificadas em algumas faixas etárias desse estudo, mas de forma geral, o
acometimento dos pacientes foi um pouco mais freqüente no grupo das crianças mais
velhas (>10 a 18 anos) e nos adultos jovens (>18 a 45 anos) (Tabela 11), dados estes
condizentes com o descrito na literatura que reportam uma freqüência menor de
ocorrência de LLA-T (De Zen, 2000; Oliveira, 2004).
Ainda segundo esses autores, o fenótipo T está presente em 25%
dos adultos e 15% das crianças com LLA, ocorrendo mais freqüentemente em
indivíduos do sexo masculino, estando mais relacionadas a fatores de mau prognóstico, tais

como leucometria elevada por ocasião do diagnóstico, presença de massa mediastinal,
linfadenopatia generalizada e envolvimento do SNC na maioria dos casos (De Zen, 2000;
Oliveira, 2004).
Nossos resultados referentes aos dados epidemiológicos
compartilham dos dados descritos em várias literaturas, onde a idade do paciente ao
diagnóstico representa um importante fator preditivo da evolução da doença. No estudo
mostrado por Pui CH, 2008, a idade ao diagnóstico tem um forte efeito prognóstico. Em
um trabalho realizado no Hospital Infantil St Jude de pesquisa, 847 crianças com LLA
foram inscritos em quatro protocolos de tratamentos consecutivos de 1991 a 2006.
Crianças entre 1 a 9 anos tiveram uma melhor resposta do que lactentes ou
adolescentes (Pui, 1998; Pui, 2001).
A estimativa de sobrevida livre da doença por 5 anos foi de 88%
para crianças com idades entre 1 a 9 anos, 73% para adolescentes com idades entre
10 a 15 anos, 69% para indivíduos com idades maiores que 15 anos, e 44% para
bebês com idade inferior a 12 meses. Bebês com idades menores que 6 meses tiveram
uma especialmente pior resposta (Hilden, 2006; Pieters, 2007). A resposta ao
tratamento em adultos piora com o aumento da idade (Pui, 2006; Larson, 2006;
Landau, 2006).
As manifestações clínicas das LA decorrem basicamente de dois
processos: a inibição da hematopoese pelas células leucêmicas e o efeito das
infiltrações leucêmicas de diversos órgãos e sistemas – fígado, baço linfonodos, rins e
sistema nervoso central dentre outros (Oliveira, 2004; Silva, 2006).
Em relação aos sinais clínicos extra-medulares observados ao
diagnóstico nos pacientes com LLA, o baço, o fígado e os linfonodos exibem acentuada
infiltração, aumento de tamanho e, posteriormente, fibrose. De acordo com Elman I et
al., 2007 e Hamerschlak N, 2010, a hepatoesplenomegalia é tipicamente mais comum
do que a linfadenopatia e o próximo local mais importante de comprometimento é o
sistema nervoso central (SNC), porém em nosso estudo a linfadenopatia foi o sintoma
clínico mais freqüente ocorrendo predominantemente nas LLA da linhagem B. Nossos
resultados mostraram concordância com os dados desse pesquisador, em que a
maioria dos sintomas relacionados foram mais freqüentes nas LLA da linhagem B,
especialmente nos subtipos Calla+, pró-B e pré-B cμ+; enquanto que nas LLA de
linhagem T, o tipo T intermediária apresentou maior nível de significância para a

maioria dos sintomas, destacando-se a presença de massa mediastinal, que se
mostrou específica para este grupo de LLA (Tabelas 12 e 13).
Outros sintomas clínicos também ocorreram em diversos pacientes
em conjunto ou isolados, determinando assim, o possível grau de extensão da doença
(Tabelas 12 e 13).
De acordo com Hamerschlak N, 2010, a presença de vômitos,
cefaléia, tontura e torpor são sintomas sugestivos de envolvimento do sistema nervoso
central, também conhecida como meningite leucêmica, porém nossos resultados
mostraram que os dados referentes a essa informação ocorreram em um número muito
pequeno de casos.
O importante é ressaltar que sinais e sintomas geralmente
inespecíficos, quando avaliados em conjunto, pode-se suspeitar de uma neoplasia
hematológica (Oliveira, 2004; Ikeuti, 2006).
Como dito inicialmente a maioria dos pacientes com LA ao
diagnóstico apresenta um quadro geral devido a sintomas inespecíficos: fadiga, perda
de peso e febre (Majhail, 2004). O hemograma não apresenta um padrão único e o
diagnóstico de leucemia é sugerido morfologicamente pela presença de células
blásticas na distensão sanguínea.
De acordo com a WHO (World Health Organization Classification of
Tumours), a leucometria em pacientes com LLA pode se apresentar diminuída, normal
ou bastante elevada (Swerdlow, 2008). Nossos dados corroboram com alguns
trabalhos encontrados na literatura, além de seguir os parâmetros adotados pela WHO
e outros autores (Friedmann and Weinstein, 2000; Oliveira, 2004; Swerdlow, 2008)
onde observou-se predomínio de casos com leucometria elevada. Destes, 62,50%
dos casos apresentou valores acima de 50 000/mm3 e 27,60% contagens variando
entre de 20 000 a 50.000/mm3 (Tabela 14).
Trabalhos encontrados na literatura mostram que crianças com LLA
apresentam, em sua maioria, uma contagem de leucócitos acima de 10.000 céls/mm3.
Um estudo feito por MA SK et al., em 1997, observou que 20% dos pacientes
apresentavam leucometria acima de 50.000 céls/mm3. Outro estudo realizado na
Inglaterra por Chessells JM et al., em 2003, mostrou que 21% dos pacientes
apresentavam valores acima de 50.000/ mm3.

A contagem leucocitária é uma variável prognóstica contínua, onde
uma contagem aumentada confere um pior desfecho, especialmente em pacientes com
LLA precursora B (Pui, 1998; Landau, 2006). Esta apresentação deve ser considerada
uma emergência médica. Se não for reconhecida e tratada rapidamente, a taxa de
mortalidade pode ser de até 40%. A conduta terapêutica deve ser iniciada antes que o
paciente seja encaminhado para tratamento da leucemia subjacente (Majhail, 2004).
Considerando o estudo de Pui CH et al., 1998, que ressalta que
crianças portadoras de LLA derivada de precursores de células B com uma contagem
inicial de leucócitos inferior a 50.000/mm3 e a idade ao diagnóstico entre 1 e 9 anos
têm sido consideradas como fatores prognósticos favoráveis na evolução desses
pacientes, nossos resultados mostraram que a maioria dos pacientes dessa pesquisa
(62,50%) apresentaram leucocitose acima de 50.000/mm3, sugerindo um provável
curso desfavorável (Tabela 14).
Anemia é um achado clínico/laboratorial comente observado em
pacientes com diagnóstico recente de leucemia linfoblástica aguda (LLA) infantil. Vários
estudos têm demonstrado que os pacientes com LLA na infância apresentando-se com
certo grau de anemia, mesmo com concentrações baixas de hemoglobina, a anemia
observada é do tipo normocítica e normocrômica e a contagem de reticulócitos é baixa
(Swerdlow, 2008). Em relato feito por Teuffel O et al em 2008, descreveram que 80%
dos pacientes estudados com LLA apresentaram valores de hemoglobina inferiores a
10 g/dL. No entanto, não tem sido relatado se existe qualquer correlação entre o grau
de anemia e o subtipo de leucemia, assim nossos resultados mostraram que a grande
maioria dos pacientes apresentou níveis de dosagem de hemoglobina abaixo de 10
g/dL, corroborando com a instalação de um quadro de anemia (Tabela 15).
A contagem de plaquetas é um importante teste de rastreamento da
função plaquetária no diagnostico uma doença hemorrágica ou uma doença primária
da MO, como LA (Comar, 2009). Os doentes que padecem de doença que acometem a
MO, como leucemias, apresentam muitas vezes fenômenos hemorrágicos devido a
uma baixa significativa da contagem de plaquetas no SP (trombocitopenia), resultante
da substituição dos elementos normais da MO pelo infiltrado leucêmico, levando
conseqüentemente a uma falência medular (Comar, 2009).
A quase totalidade dos pacientes do nosso estudo apresentou
plaquetopenia, porém predominando entre mais de 20.000/mm3 e 100.000/mm3

células. Quando a contagem de plaquetas atinge níveis inferiores a 20.000/mm3 pode
ocorrer hemorragias espontâneas que podem manifestar-se com sangramento cutâneo
(petequias, equimoses), mucoso (sangramento gengival, epistaxe, metrorragia,
hemorragia digestiva) ou no sistema nervoso central. Contagens abaixo destes valores
são considerados fatores de risco para a doença, assim, nossos resultados mostraram
que apenas 6,77% dos pacientes analisados apresentaram esse perfil ao diagnóstico
(Tabela 16).
A MO normal é normocelular com representação de todos os
elementos da hematopoese em diversos estágios maturativos, contendo menos de 5%
de células blásticas. As LLA são leucemias caracterizadas pelo acúmulo de
precursores linfóides neoplásicos (linfoblastos) na MO e/ou no SP. O diagnóstico deve
sempre ser confirmado pelo exame citológico do aspirado de MO, exame obrigatório na
suspeita de LA em qualquer situação, pois é o exame que melhor demonstra a
presença dos blastos nesse órgão. A WHO-World Health Organization ou Organização
Mundial de Saúde (OMS) considera uma contagem de células blásticas na MO maior
que 20% o suficiente para o diagnóstico dessa doença (Onciu, 2009, Wandt, 2010). O
grupo FAB, no entanto, considera um valor mínimo de 30% (Lilleyman, 1986;
Hamerschlak, 2010).
A quase totalidade dos casos analisados em nossa pesquisa
corroborou com a literatura de referência, em que a frequência de blastos no SP foram
superiores a 30%, o que caracteriza um quadro importante para os estados leucêmicos
agudos, porém foram observados em alguns casos pacientes com percentuais de
blastos inferiores a esse valor, porém dentro da contagem blásticas leucêmica
estabelecida pelos órgãos mundiais de saúde (Tabela 17).
O grupo French-American-British (FAB) classifica morfologicamente
as LLA e as distingue em três subtipos morfológicos: L1 (variante da infância); L2
(variante de adultos) e L3 (tipo Burkitt), embora essa classificação não reflita a grande
diversidade biológica da doença (Kebriaei, 2003; Oliveira, 2004; Hamerschlak, 2010).
O subtipo L1 foi o mais freqüente dentre os três subtipos
encontrados (Figura 14), ressaltando sua expressão nas linhagens celulares B,
principalmente no subtipo Calla+ (Tabela 18). Também foram observadas expressões
em menores freqüências dos outros subtipos de LLA dessa mesma linhagem,
principalmente pró-B com 13,02% e pré-B cμ+ com 6,25%. Quanto às linhagens T, o

subtipo L1 teve uma expressão discreta, com uma distribuição de casos homogênea
(Tabela 19).
O subtipo L2 também esteve presente em um percentual
importante de pacientes (35,94%), e assim como na LLA L1 também apresentou maior
predominância nas linhagens B (23,44%), especialmente no subtipo Calla+ (13,02%).
Também foi expresso com menores freqüências nos outros subtipos, pró-B (4,17%) e
pré-B cμ+ (6,25%) (Tabela 19). Quanto às linhagens T, predominou na T intermediária
(7,29%), e sobretudo, destacou-se dentre os três subtipos FAB nessa linhagem (Tabela
19)
O subtipo L3 foi muito pouco constatado e todos os pacientes que
o expressaram foram da linhagem B, mais especificamente da LLA-B madura (3,65%)
(Tabela 19).
Analisando a correlação entre as diversas faixas etárias e os
subtipos morfológicos da classificação FAB observou-se que o subtipo L1 foi mais
frequente no grupo das crianças a partir de 1 ano, e no grupo dos adultos jovens.
Distribuição semelhante de casos foi observada para o subtipo L2 entre os dois
grandes grupos, sendo que com uma freqüência bem inferior (Tabela 20). Os dados de
nosso estudo referentes à expressão mais evidenciada do subtipo L1, seguida pelo L2
e à menor expressão do subtipo L3 concordam com os descritos na literatura (Tabela
19).
A imunofenotipagem por citometria de fluxo foi o método empregado
nesse estudo para melhor caracterização da linhagem celular dessas leucemias. Na
análise dos nossos resultados a análise inicial do tubo com a combinação de três
diferentes AcMo: CD3FITC/CD19PE/CD45PERCP, que possibilitou a distinção entre dois
grandes grupos de LLA, observando a forte expressão do CD19 nas LLA de linhagem
B e do CD3 nas LLA-T, na maioria dos casos. Posteriormente, uma análise e
interpretação mais cuidadosa desses anticorpos possibilitaram também a exclusão dos
casos de LMA pela ausência ou baixa expressão destes antígenos na maioria dos
casos (Tabela 20).
Ainda em relação ao perfil imunofenotípico das LLA investigadas
podemos constatar que com o painel de AcMo empregado foi possível definir a
linhagem celular de todas as LLA de linhagem B.

Os primeiros antígenos associados á diferenciação linfóide B normal
a serem expressos após o amadurecimento precursor hematopoiético inicial CD34+, é
o CD22, primeiramente no citoplasma e depois na membrana, o CD18 na superfície, o
CD10, o antígeno nuclear Terminal deoxinucleotidil Transferase (TdT) e o CD79a no
citoplasma (Figura 4) (Ciudad, 1999; van Lochem, 2004).
Em nossa casuística, constatou-se que o marcador específico de
linhagem B, CD19 foi um dos mais sensíveis, com taxa de positividade de 73,44% dos
casos, tendo também os cCD79a e cCD22 com taxas elevadas de positividade de
73,98% e 59,09%, respectivamente (Tabela 20). Desta forma podemos concluir que
todos esses marcadores são bons indicadores na caracterização dessa linhagem e,
portanto importante na composição de um painel de AcMo para LA (Ciudad, 1999; van
Lochem, 2004; Xiong, 2010).
Nossos resultados também concordam com os estudos de Kurec
AS, 1991, que diz que o CD19 está presente nas células da linhagem B muito
precoces, além disso, demonstrou que a expressão desse marcador é muito confiável
para a linhagem B e por isto estava presente em 98% dos casos de LLA-B. Outros
marcadores dessa linhagem não tão específicos, porém não menos relevantes também
foram expressos, como o sCD22, cCD22 e cCD79a (Tabelas 20 e 21).
O CD19, embora classicamente descrito como antígeno pan B,
embora raro, pode se apresentar negativo em alguns casos de LLA, além de poder se
expressar de forma aberrante em alguns casos de LMA (van Dongen, 2012).
A detecção dos antígenos CD10, IgM (de citoplasma e superfície) e
do CD20 foram úteis para caracterização das LLA de linhagem B quanto ao grau de
maturação. O CD10 Identifica uma glicoproteína de 100 kDa semelhante a uma
endopeptidase humana, associada à membrana (NEP, metaloendopeptidase e
encefalinase). Ele é conhecido como antígeno comum da leucemia linfoblástica aguda
ou CALLA do termo em inglês Common Acute Lymphocytic Leukemia Antigen
(Greaves, 1975). Este antígeno é expresso no estágio precoce dos linfócitos B, sendo
relatada sua expressão em 75% das células precursoras das LLA de linhagem B, em
mais de 90% dos casos de LMC em crise blástica linfóide, sendo também útil no
diagnóstico diferencial do linfoma folicular (van Dongen, 2012)
O CD10 também é encontrado em tecido não-hematopoiético, como
epitélio glomerular e tubular proximal, células mioepiteliais da mama, fibroblastos,

epitélio do intestino delgado fetal, podendo também está expresso em células tumorias
não-hematopoéticas, tais como no melanoma, retinoblastoma, carcinoma de mama e
cólon (van Dongen, 2012).
Conforme já relatado, nesse estudo o CD10 mostrou-se expresso na
maioria dos casos das LLA (Tabelas 20, 21 e 24), dados que convergem com as
informações obtidas por Consolini R et al., 1998, Bene MC, 2005 e Maguer-Satta et al.,
2011. Segundo estes autores o CD10 mostra-se transitoriamente expresso durante o
processo inicial de maturação da ontogenia dos linfócitos B, sendo atualmente
largamente empregado no diagnóstico e classsificação das LLA. Quando analisado
isoladamente, a expressão do CD10 se correlaciona com os pacientes com taxas de
sobrevida maior que 5 anos e em crianças constitui um bom indicador molecular de
melhor prognóstico (Greaves, 1975; Dakka, 2009; Maguer-Satta, 2011).
A detecção da cadeia pesada da imunoglobulina IgM de citoplasma
e superfície foi importante na caracterização das LLA pré-B cμ+ e B madura,
respectivamente (Tabelas 25 e 26). O CD20 por sua vez, mostrou-se positivo na
maioria dos casos de LLA-B, mostrando-se pouco expressos ou negativos nos casos
mais imaturos, estando esses resultados condizentes com o descrito na literatura
(Tabela 26) (van Dongen, 2012).
Em relação às LLA-T, nossos resultados corroboraram com os
estudos de Xiong H et al., 2010, que mostraram que o marcador linfóide T mais
freqüente foi o sCD3/cCD3 e CD7 com taxas de positividade de 30%, 93,33% e 96,67%
respectivamente (Tabela 22). Achado importante, pois se tratam de marcadores mais
específicos dessa linhagem de leucemia. O CD5 e CD2, por sua vez, apresentaram-se
positivo em 73,33% e 50% (Tabela 22).
O CD3 é um complexo glicoprotéico formado por quatro estruturas
polipeptídicas distintas. Nos humanos, o complexo contém a cadeia gama, cadeia delta
e duas cadeias épsilon. Estas cadeias associam-se com uma molécula chamada de
receptor de células T (TCR) e com a cadeia zeta, levando a ativação dos linfócitos T. O
antígeno CD3 determina a linhagem específica dos linfócitos T e sua expressão no
citoplasma (cCD3) caracteriza células T imaturas e, quando na membrana, o linfócito T
maduro (Call, 2002)
O CD7 é uma glicoproteína de 40 kDa que se expressa na superfície
de células T maduras e imaturas. O gene que codifica para CD7 divide homologia de

seqüência com a cadeia δ do TCR. Acredita-se ser o primeiro antígeno associado à
linhagem T a se expressar nas células precursoras dessa linhagem. A sua expressão
nas células progenitoras ocorre antes e durante o desenvolvimento dessas células no
timo, portanto, presente ainda em estágios de pré-timócito, no córtex subcapsular.
(Hao, 2008) A ausência de CD7 em crianças com imunodeficiência sugere que tem
papel importante nos estágios iniciais do desenvolvimento da célula T (Hao, 2008). O
CD7 está expresso na maioria das células T periféricas estando ausente em outras
populações. Está fortemente presente na maioria das células precursoras da leucemia
linfoblástica agudas e negativo nas LLA de linhagem B (van Dongen, 2012), fato este
também constatado no presente trabalho (Tabela 21).
O CD7 também pode se expressar em uma pequena proporção de
LMA e LMC, especialmente na LMA-M4 e M5, e na maioria das neoplasias linfóides T
pós-tímicas. Como outros antígenos pan T (CD2, CD3, CD5), a expressão do CD7
também pode ser perdida em alguns casos de neoplasias T periféricas, como na
síndrome de Sézary e na leucemia/linfoma T do adulto (van Dongen, 2012).
O CD1a, caracterizado como antígeno cortical tímico, assim como
outros antígenos de células T podem ser expressos com padrões variados de
positividade e têm sido utilizados em conjunto com outros marcadores de células T,
para caracterizar a LLA-T intermediária (van Dongen, 2012). No presente estudo esse
antígeno manteve-se expresso em todos os casos de LLA-T intermediária, mostrando
negativo nos outros subtipos de LLA-T, confirmando também a elevada especificidade
desse marcador na caracterização imunofenotípica das LLA-T (Tabela 27 a 29).
O CD2 (cluster of differentiation 2) é uma molécula de adesão celular
encontrada na superfície de linfócito T e células NK (Natural Killer). É também
chamada de antígeno de superfície de células T T11/Leu-5, LFA-2, receptor LFA-3,
receptor de eritrócitos e receptor em roseta de carneiro (van Dongen, 2012).
O CD5 (Cluster of Differentiation 5) é uma molécula de superfície
celular encontrada nos linfócitos T e precursores e em um sutipo de células B
secretoras de imunoglobulina, chamadas de células B1, as quais são potencialmente
auto-reativas. Nos humanos, o gene que codifica esta proteína está localizado no braço
longo do cromossomo 11. A sua expressão pode ocorrer nas neoplasias agudas e
crônicas de células T, podendo também se expressar de forma anômala em doenças

linfoproliferativas crônicas de células B, tais como no linfoma não-hodgkin de células do
manto e a leucemia linfocítica crônica (van Dongen, 2012).
Em relação aos marcadores de linhagem não-específica e de células
progenitoras, o HLA-DR, apresentou maior frequência nas LLA de linhagem B do que
nas LLA-T com positividade de 88,08% e 16,67% respectivamente, resultados similares
foram descritos por outros autores (Tabelas 21 e 22) (van Dongen, 2012). O HLA-DR é
comumente expresso nas LLA de linhagem B, fato que ocorre em apenas uma minoria
das LLA-T, ocorrendo em predominância nos casos mais imaturos. Desse modo, para
o diagnóstico diferencial de uma LA a negatividade do HLA-DR fala mais a favor de
uma LLA-T do que um HLA-DR positivo para uma LLA de linhagem B (van Dongen,
2012).
O CD45 ou antígeno leucocitário comum é um marcador pan
leucocitário. Sua principal justificativa na composição de um painel de doenças onco-
hematológicas é o padrão de positividade distinto nas diferentes linhagens celulares,
bem com a fraca expressão nas células leucêmicas imaturas (Cascavilla, 1997;
Saunders, 2010). Este fato serve como estratégia de análise para identificação dos
blastos, através da SSC (granulosidade) X CD45, que exibe a posição específica
destas células, em relação aos linfócitos residuais, monócitos e granulócitos maduros,
permitindo identificar mais precisamente a área delimitada para análise da população
dos blastos em estudo (gate) (Bene, 2005).
Embora o papel biológico do CD45 ainda não esteja bem elucidado,
acredita-se ele induza apoptose nos linfócitos B normais (Law, 1996) e que a perda do
CD45 contribua para um subgrupo funcional e imunologicamente diferente das LLA
com regulação alterada do crescimento celular, apoptose, diferenciação e ativação
celular. Nestas leucemias, esta perda tem sido associada com uma resposta favorável
á quimioterapia com múltiplas drogas (Riley, 2002). Nas células da linhagem
granulocitária também se observa o aumento da intensidade de marcação para este
antígeno ao longo da maturação celular, contrário do observado nas células da
linhagem eritrocitária e megacariocitária que perdem a expressão deste antígeno no
processo de diferenciação celular (Riley, 2002
Neste trabalho o CD45 foi expresso em 83,33% dos casos de LLA
de linhagem B. Nas LLA-T esse marcador foi expresso em 86,67% dos casos, de
acordo os achados de Behm FG et al em 1992 (Tabelas 21 e 22).

Estudos atuais de citometria de fluxo têm recomendado a adição
desse marcador em todos os tubos, em combinação com todos os AcMo: na terceira
cor em um citômetro que avalia até três cores diferentes ou na quarta ou quinta cores
nos citômetros com capacidade para leitura com quatro ou cinco diferentes
fluorocromos respectivamente (van Dongen, 2012), porém a utilização desse estratégia
não foi empregada no presente estudo.
O Marcador de linhagem não específica e de células imaturas CD34
é descrito na literatura com importância prognóstica nas LA (van Dongen, 2012). Neste
trabalho foi avaliada a expressão desse antígeno que apresentou uma taxa de
positividade de 55,28% nas LLA de linhagem B com valores mais expressivos nos
grupos mais imaturos quando comparadas com os subtipos mais maduros (Tabelas 21,
23 a 26 e Figura 17). Nas LLA-T a expressão desse marcador mostrou-se menor que
nos casos de LLA de linhagem B totalizando 36,67 % dos casos (Tabelas 22, 27 a 29).
Na comparação entre os grupos de pacientes CD34 positivos ou
negativos não observamos diferença estatisticamente significativa entre pacientes
adultos ou crianças.
A Deoxinucleotidil transferase Terminal (TdT) é uma enzima de
replicação (DNA polimerase) que se liga a desoxinucleotídeos na terminação 3’ do
DNA e atua no rearranjo dos genes que codificam as imunoglobulinas e os receptores
de células T. A TdT está presente nos estágios iniciais da diferenciação celular,
participando na determinação da diversidade antigênica dos receptores de células
precursoras T e B por ocasião da recombinação somática (van Dongen, 2012).
Está presente nas células imaturas das LLA de linhagem T e B e na
crise blástica linfóide da leucemia mielóide crônica (LMC). Nas leucemias mielóides de
crianças, a co-expressão de CD2 e TdT, em metade dos casos, está associada à
falência na indução da quimioterapia (van Dongen, 2012). O TdT tem localização
intranuclear, podendo ser identificada por outras técnicas além da citometria de fluxo,
como imunofluorescência, imunocitoquímica e imuno-histoquímica (van Dongen, 2012).
De acordo com a caracterização imunofenotípica, os marcadores
sCD13/cCD13 e o CD33 foram os mais evidenciados. Dados semelhantes foram
observados em outros estudos, como o de Campana D et al., 2000, o de Emerenciano
M et al., 2004 e o de dos Santos et al., 2011, em que a expressão dos marcadores
CD13 e o CD33 foram os mais freqüentes. Também podemos observar nos estudos de

Vitale A et al., 2007 que os antígenos CD13 e CD33 foram expressos em 25% e 23%
dos 377 casos analisados, respectivamente. Assim, a expressão dos antígenos
mielóides aberrantes (CD13 e/ou CD33) foram observadas em 35% de todos os casos
de LLA, concordando com nossos resultados e os dados da literatura (Figuras 27 e 28).
Em relação à linhagem celular, a expressão aberrante foi bem
evidenciada nos pacientes da linhagem B (89,39%) (Figuras 19 e 20). Dados
semelhantes foram observados nos estudos de Vitalle A et al., 2004, em que os
antígenos mielóides foram significativamente mais freqüentes associados com as LLA
da linhagem B (38%) do que com as LLA da linhagem T (24%) (p=0,02). Além disso,
observa-se que a distribuição das freqüências entre os três FA analisados nas duas
linhagens ressalta a expressão do marcador CD13 (superfície e citoplasmático)
(Figuras 27 e 28).
De acordo com Emerenciano M et al., 2004, em relação a gêneros
a leucemia é uma doença que acomete o sexo masculino com maior freqüência do que
o feminino, portanto seria esperada uma maior frequência de FA entre os homens,
porém analisando nossos resultados observa-se que o masculino apresentou maior
frequência que o feminino em relação ao CD13 (superfície e citoplasmático), e contrário
ao esperado foi observada uma inversão para o feminino no CD33. Já em relação à
linhagem celular afetada, a B foi a mais evidenciada em ambos os sexos, tendo o
subtipo Calla+ como o subtipo mais freqüente e que novamente observou-se que o
sexo masculino se sobressaiu quanto à expressão do CD13 (superfície e
citoplasmático), enquanto que houve uma inversão para o sexo feminino em relação ao
CD33 (Tabela 30).
O fator idade parece influenciar as proporções de FA, ou seja, na
faixa etária em que a LLA é mais comum, são também mais comuns os casos
aberrantes. Nossos resultados concordam com Emerenciano M et al., 2004, que
evidenciaram uma maior freqüência de FAs nas crianças, que foi o grupo com maior
número de casos nesse estudo, nas linhagens B. No estudo de dos Santos JHT et al.,
2011, observou-se o predomínio de FAs em pacientes adultos, o que pode ter
contribuído para a maior freqüência de FA nesta faixa etária, uma vez que não há
relatos na literatura de predominância de FAs na LLA-T em nenhum grupo etário
(Kurec AS et al., 1991) (Tabela 31).

Analisando cada marcador observa-se que o CD13 (superfície e
citoplasmático) é o mais freqüente em relação ao CD33 independente da faixa etária,
porém ressaltando a maior freqüência no grupo das crianças e nas LLA das linhagens
B. Dados semelhantes aos nossos foram observados nos estudos de Khalidi HS et al.,
1999 e Emerenciano M et al., 2004, que mostraram que nas LLA de células
precursoras B em casos pediátricos obteve-se uma freqüência maior de expressão de
antígenos mielóides do que nos casos de adultos. Eles também ressaltaram que as
LLA de linhagens B predominam na faixa etária de 0 a 18 anos, onde de acordo com a
literatura ocorre a maior freqüência de FA; já de acordo com Zago MA et al., 2004, no
adulto a observação de antígenos aberrantes também é freqüente sendo acompanhada
muitas vezes por alterações genotípicas como a presença do cromossomo
Philadelphia. Dados conflitantes foram observados nos estudos de Vitalle A et al.,
2007, que mostraram que a expressão de antígenos mielóides em adultos com LLA
não está associada com a presença de características clínicas e biológicas adversas
(Tabela 31).
Portanto, ainda continua controverso o papel da expressão dos FA
nas LLA. Os mecanismos pelos quais ocorre a expressão de FA no desenvolvimento
das LA ainda permanecem obscuros, no entanto, já é possível estabelecer associações
entre essas expressões incomuns e outras características biológicas da doença, como
as associações com translocações cromossômicas e fatores prognósticos. A presença
de antígeno aberrante nos blastos linfóides de pacientes com LLA não são infreqüentes
e podem ser a manifestação de uma característica significativa na diferenciação das
células precursoras ou uma transformação anormal da informação genética durante o
processo leucêmico (Kurec, 1991; Putti, 1998). Além disso, os imunofenótipos
aberrantes são reconhecidamente instrumentos de grande importância na detecção da
doença residual mínima (DRM) (Emerenciano, 2004; dos Santos, 2011).
A avaliação da expressão desses antígenos e o nível de expressão
antigênica permanecem disponíveis para uma caracterização mais precisa da
população leucêmica em cada paciente individual. Isto tem implicações clínicas em
termos de decisões terapêuticas (ex. tratamento anti-CD33) e para monitorização da
doença residual mínima durante o curso da doença (Vitale, 2007).
Deve-se lembrar que essas discrepâncias nas porcentagens de
casos positivos para os marcadores em geral, o valor prognóstico dos fenótipos

aberrantes encontrados, se devem ao fato de que os estudos não são realizados da
mesma maneira em todos os serviços, com variação do tipo de análise, anticorpo
empregado, o número de casos e as características dos pacientes estudados.
Os dados obtidos no presente trabalho demonstraram, de um modo
geral, a importância do delineamento de um painel de AcMo, não apenas na
caracterização imunofenotípica da LLA, mas por ter a possibilidade de fazer
correlações com a classificação morfológica FAB, que até o momento não se observou
ter a mesma importância diagnóstica do que se observa na LMA (Cavalcanti Júnior,
1997); e também na diferenciação preliminar entre a LLA e LMA, na distinção entre os
subtipos de LLA de linhagem T e B, e por fim no diagnóstico das leucemias
bifenotípicas. A combinação dos diferentes tipos de AcMo tornou possível a
caracterização da maioria dos casos investigados.
Além disso, os resultados obtidos em nosso estudo deram
informações determinantes tanto para o diagnóstico quanto para um possível
prognóstico. Nossos dados reafirmaram a necessidade de que para um diagnóstico
confirmatório é preciso haver um bom contexto profissional, mas também tecnológico,
pois disso depende o desenvolvimento e o acompanhamento do paciente.
Assim, a imunofenotipagem é uma técnica eleita quando é preciso
diferenciar células que tem o aspecto físico muito semelhante ao microscópio óptico,
mas que tem moléculas diferentes em sua membrana e/ou citoplasma, atribuindo-lhes
funções diferentes (Matutes, 1995).

7 CONCLUSÕES
• A associação entre os subtipos imunológicos das leucemias linfobláticas agudas

B e T, e os dados demográficos, clínicos e hematológicos forneceu informações,
que avaliadas em conjunto com a imunofenotipagem, possibiltaram um
diagnóstico seguro;
• O emprego sistemático de anticorpos monoclonais tem se confirmado útil no
diagnóstico diferencial das LA;
• A associação entre os subtipos imunofenotípicos das leucemias linfobláticas
agudas B e T com os subtipos morfológicos FAB (L1, L2 e L3) auxiliou na
avaliação diagnóstica;
• A presença de fenótipo aberrante, expresso principalmente pelos marcadores
celulares sCD13, cCD13 e CD33, mostra a complexidade do desenvolvimento
dessa doença e a necessidade de um maior entendimento sobre as leucemias
linfoblásticas agudas, sendo necessário ampliar o fornecimento de dados que
em associação com outras técnicas moleculares (biologia molecular,
citogenética) possibilitem o desenvolvimento de tratamentos individualizados;
• A imunofenotipagem por citometria de fluxo apresentou-se eficaz na
caracterização das LA, em particular da leucemia linfoblástica aguda.

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ABSTRACT
The acute lymphoblastic leukemia is a malignant disease of the immune system and
hematologic characterized by accumulation of neoplastic B lymphoid precursors or T
(lymphoblasts) in the bone marrow and / or peripheral blood. The diagnosis of these leukemias
occurs by morphological classification of French-American-British (L1, L2 or L3) associated with
features of immunological profile T or B cell malignancies, based on the expression profile of
monoclonal antibodies directed against the antigens of cell differentiation. Several studies have
shown that blast cell immunophenotypes of cases of acute lymphoblastic leukemia does not
always exhibit characteristics of lymphoid differentiation normal, but exhibit aberrant
immunophenotypes. Thus, blasts some cases of acute lymphoblastic leukemia of B lineage may
show myeloid or T antigens. Also blasts of cases of acute lymphoblastic leukemia T cell
determinants may possess B or myeloid cells. Objective: To determine the immunophenotypic
profile in 192 patients with acute lymphoblastic leukemia (B or T) diagnosed in the Laboratory of
Flow Cytometry Blood Center of Dalton Barbosa Cunha - HEMONORTE, based on clinical,
laboratory and immunophenotyping by flow cytometry. Methods: All samples from peripheral
blood and / or bone marrow imunfenotipagem were subjected to flow cytometry using a panel of
monoclonal antibodies specific for acute leukemias directly conjugated with three different
fluorochromes per tube: fluorescein isothiocyanate, fluorescein isothiocyanate English (FITC)
and / or Phicoeritrina (PE) and / or protein Pyridine chlorophyll, of the English term of peridinin
chlorophyl protein (PerCP). Results: The acute lymphoblastic leukemia of B lineage were the
most prevalent, 84.38%. There was a slight predominance of males (56.77%). Children were
the most affected by the disease accounting for 58.85%. The evaluation of morphological
subtypes identified L1 with 116 patients (60.42%) as the most predominant. The three
morphological subtypes French-American-British were detected in acute lymphoblastic
leukemia of B lineage, being the types L1 and L2 more frequently observed in acute
lymphoblastic leukemia Calla + with 72 and 25 cases, respectively. The levels of expression of
T antigen showed mainly CD3 (surface and cytoplasmic) with 8.33% and 11.17% respectively.
For B antigens showed a higher frequency of expression for pan B antigens: CD19, sCD22, and
cCD22 cCD79a. Detected the presence of aberrant phenotypes in 66 cases. Conclusions: The
systematic use of monoclonal antibodies and their use in flow cytometry has been confirmed
useful in the differential diagnosis of acute leukemia, in addition to morphological diagnosis.
Keywords: Acute Lymphoblastic Leukemia, Flow Cytometry, Immunophenotyping.

9 ANEXOS
Anexo 1: Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com seres
humanos do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP/HUOL – Protocolo 359/09).

Anexo 2: Questionário realizado pelo Hemonorte/RN para a coleta de dados dos
pacientes com leucemias:
Data:
Nome do paciente:
Data de Nascimento: Idade:
Médico (a):
Origem:
Material:
Indicação Clínica:
RESULTADO
Hemograma:
Leucócitos /mm3; Hematócrito %; Hemoglobina g/dL; Contagem Plaquetas /mm3.
Núm Segmentados: %; Núm Bastões: %; Núm Eosinófilos: %; Núm Linfócitos: %; Núm
Linfócitos Atípicos: %; Núm Monócitos: %.
Imunofenotipagem
Linfócitos T e Precursores Antígenos Mielóides Células Progenitoras

CD1a: CD33: CD34:
CD2: sCD13: TdT:
sCD3: cCD13: CD117:
CD5: MPO: Outros
CD7: CD65: HLADR:
CD3/CD4: CD15: CD45:
CD3/CD8: CD36: CD45RA:
Linfócitos B e Precursores Antígenos Monocitários CD38:
CD10: CD14: KI-67:
CD19: CD11b: NG2:
CD20: CD11c: CD16/56:
sCD22: Antígenos Megacariocitários CD3/CD16-56:
cCD22: CD41: CD123:
cCD79a: CD61: GPP:
sIgM: CD42a: P53:
cIgM: Antígenos Eritrocitários MRP:
Anti-Kappa: CD71:
Anti-Lambda: G-alfa:
Diagnóstico:

Anexo 3: Trabalhos apresentados em congressos com resumos publicados em
anais.
Cavalcanti GBJ, Vasconcelos RC, Fernandes ALAC, Lopes MCA, Sales VSF, Cordeiro
KA, Silva DGKS, Farkatt IG., Júnior FFN, Leão MD, Alves GVA, Gonzaga MFG, Moura
ZMAM, Gois VGF, Cesário MSV, Leitão RLTS, Medeiros WC. Contribution of
Immunophenotyping by Monoclonal Antibody by Flow Cytometry in Diagnostic of
Acute and Chronic Leukemias. In: II Encontro de Avaliação do Programa REDE
NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – RENORBIO, 30. Congresso Brasileiro de
Biotecnologia (SBBiotec 2010), Fortaleza – CE: Sociedade Brasileira de Biotecnologia
2010.
Cavalcanti GBJ, Alves GVA. Immunophenotypic Profile of Lymphoblastic Leukemia

Diagnosed by Flow Cytometry. In: II Encontro de Avaliação do Programa REDE
NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – RENORBIO, 30. Congresso Brasileiro de
Biotecnologia (SBBiotec 2010), resumo. Fortaleza – CE: Sociedadde Brasileira de
Biotecnologia 2010.

Anexo 4: Artigos publicados
1. Alves GVA, Fernandes ALAC, Freire JM, Paiva AS, Vasconcelos RC, Sales
VSF, Lemos TMAM, Gil EA,1 Freire FHMA, Silva DGKC, Maciel JF, Farkatt IG
and Cavalcanti Jr GB. Flow Cytometry Immunophenotyping Evaluation in Acute
Lymphoblastic Leukemia: Correlation to Factors Affecting Clinic Outcome.
Journal of Clinical Laboratory Analysis 2012, 00: 1 – 10.

JCLA
FLOW CYTOMETRY IMMUNOPHEMOTYPING EVALUATION IN

ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA: CORRELATION TO
FACTORS AFFECTING CLINIC OUTCOME
Fo
Journal: Journal of Clinical Laboratory Analysis
Manuscript ID: Draft
Wiley - Manuscript type: Original Article

r
Date Submitted by the Author: n/a

Pe
Complete List of Authors: Andrade, Gabriela; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Análises
Clínicas e Toxicológicas
Fernandes, Andreia; Universidade fedral do Rio Grande do Norte, Análises
er
Freire, Juliana
Paiva, Aldair; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Análises
Vasconcelos, Roberto; Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Re
Análises Clínicas e Toxicológicas

Sales, Valéria; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Análises
Moura Lemos, Telma; Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
vi
Gil, Erica; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Análises Clínicas e

Toxicológicas
Freire, Flavio
ew
Cavalcanti e Silva, Dany; Universidade fedral do Rio Grande do Norte,

Maciel, James; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Análises
Farkatt, Irian; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Análises
Cavalcanti Jr, Geraldo; Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
Flow cytometry, Immunophenotyping, Acute Lymphoblastic leukemia,

Keywords:
Clinic Outcome
John Wiley & Sons

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4 FLOW CYTOMETRY IMMUNOPHEMOTYPING EVALUATION IN ACUTE
5
6 LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA: CORRELATION TO FACTORS
7 AFFECTING CLINIC OUTCOME
8
9
10
11
12
13
14
15
16 (a)
Gabriela Vasconcelos de Andrade Alves ; Andrea Luciana Araújo da Cunha
17
18 Fernandes (a,b); Juliana Mendonça Freire (a); Aldair de Souza Paiva (a, b); Roberto
Fo
19 (a)
20
Chaves de Vasconcelos ; Valéria Soraya de Farias Sales(a); Telma Maria de
21 Araújo Moura Lemos (a); Erica Aires Gil (a); Flávio Henrique Miranda de Araújo
22
Freire (c); Dany Geraldo Kramer Cavalcanti e Silva (a); James Fallley Marciel (b);
r
23
24
Irian Guedes Farkatt (b); Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior (a,b)
Pe
25
26
27
28 a
er
29 Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia da

30
31
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal - RN, Brazil.
32 b
Laboratório de Hematologia Hemocentro Daltom Barbosa Cunha
Re
33
34 (HEMONORTE), Natal-RN, Brazil
35
36 a
Departamento de Estatística da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
vi
37
38 Natal - RN, Brazil.
39
ew
40
41
42 Correspondence:
43
44 Prof. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, MSc, PhD
45
46 Laboratório de Imunologia Clínica
47 Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas
48
49 Faculdade de Farmácia, 1th floor; Centro de Ciências da Saúde; Universidade Federal do Rio
50
Grande do Norte.
51
52 Avenida Gustavo Cordeiro de Farias S/N, CEP: 59010-180
53
Natal-RN, Brazil / FAX: + 55 (84) 3215-4226
54
55 E-mail: gbcjunior@hotmail.com
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5
6 ABSTRACT
7 The authors conducted a study of immunophenotyping by flow cytometry in 126
8
9 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) newly diagnosed, with a panel of
10
11 monoclonal antibodies specific for acute leukemias containing CD1a, CD2, CD3,
12 CD4, CD7 , CD8, CD10, CD13, CD33, CD14, CD19, CD22, CD79a, CD117, CD34
13
14 and also anti-IgM anti-TdT. At the same time were also investigated as information
15
16 regarding the patients' age and gender, as well as clinical and laboratory data among
17 which the presence of tumor masses, lymphadenopathy, hepatomegaly, splenomegaly,
18
Fo
19 leukemic infiltration in the central nervous system (CNS) and also blast cell count in
20
21 peripheral blood. The results showed that 71 cases (56.7%) were B-lineage ALL the
22 pro-B, Common, cm + pre-B and B-cell ALL and 55 T-cell ALL, pre-T, T-middle and
r
23
24 T ALL-cord. Relating these data to gender, we found that males were more affected
Pe
25
26 by the disease, regardless of classification immunology. The correlation between the
27 age of subtypes immunological, noted that the B-lineage ALL were more frequent in
28
er
29 patients aged below 15 years while of T-cells ALL were more present in adults. The
30
31 frequency of the correlation of immunophenotyping with the morphological subtypes
32 of FAB classification showed a direct correlation between the L3 and subgroup B-cell
Re
33
34 ALL, while the L1 and L2 subgroups correlated more often with B cell lineage ALL
35
36 and T-cell ALL respectively. The analysis of correlation between
vi
37 immunophenotyping and clinical profile, showed that the T-cells ALL were more
38
39 associated with tumor forms of the disease with a higher incidence of
ew
40
41 lymphadenopathy, hepatomegaly, splenomegaly, and infiltration of tumor masses and
42 CNS leukemic infiltration, also showing a greater blast cell count in peripheral blood
43
44 than the other subgroups. Finally, these data suggest that immunophenotyping is an
45
46 important method in the diagnosis, monitoring and prognostic assessment in
47 determining the pathological mechanisms of evolution of acute lymphoid leukemia
48
49
50
51 Key Word: Flow Cytometry, Immunophenotyping, Acute Lymphoblastic leukemia,
52
53
54
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Re
33
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35
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vi
37
38
39
ew
40
41
42
43
44
45
46 Introduction
47 Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a malignant clonal proliferation of
48
49 lymphocytes expressing an immature phenotype. It is currently diagnosed and
50
51 classified primarily according to cytomorphology, immunophenotypic and genetic
52 characteristics. ALL is currently diagnosed with a peripheral blood (PB) or bone
53
54 marrow blast percentage of 20% or more (1-4).
55
56 The primary purpose of the morphological classification is to separate the
57 acute leukemias in acute myelogenous leukemia (AML) and acute lymphoblastic
58
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2 leukemia (ALL).The French-American-British (FAB) system, which was based
3
4 primarily on the microscopic appearance of the leukemic cells, as seen on Wright-
5
6 Giemsa stained smears and classified the ALL in three different morphologic
7 subtypes such us: ALL-L1: small uniform cells, ALL-L2: varied and large cells and
8
9 ALL-L3: varied large basofilic cells with large vacuoles (Burkitt-like ALL) (4-6).
10
11 Immunophenotyping by flow Cytometry is a key factor in the diagnosis and
12 prognosis of ALL, making a morphological analysis method completing or the initial
13
14 screening when combined cytochemical staining methods (4). It is a more accurate
15
16 method based on the principle of the expression of antigens of cell differentiation
17 (Cell Markers) determined by panel of monoclonal antibodies (MoAb) in the process
18
Fo
19 of maturation of T and B lymphocytes (4, 7-9).
20
21 Based on the principle that in the process lymphocyte maturation, surface and
22 cytoplasm antigens are acquired and lost, the European Group for the Immunological
r
23
24 Characterization of Leukemias (EGIL), proposed immunological classification for
Pe
25
26 acute leukemias were standardized, according to the expression of antigens and can
27 detect, in addition to cell line, the level of differentiation of the leukemic process (10)
28
er
29 These expressions are to predict, from the B or T phenotypes, the biological changes
30
31 associated with therapeutic response, monitoring of minimal residual disease and
32 stratification of groups at higher or lower risk and today are known to be far more
Re
33
34 important that the criteria strictly morphological (3, 9-10).
35
36 As for the cell line, the ALL are classified into B-lineage ALL and T-cell
vi
37 ALL. Approximately 20% of cases are of T-cell, 75% of B cell precursors, and 5% of
38
39 mature B cells (3-4, 9-11).
ew
40
41 The B-cell lineage ALL were divided according to the stages of normal
42 differentiation of B progenitors in the BM, classifying them into: Pro-B, Pre-B and B-
43
44 cell mature ALL. The Pro-B ALL represents 5% of pediatric cases and 10% of cases
45
46 of ALL in adults (3-4, 9-12). The leukemic cells express HLA-DR, Terminal
47 deoxynucleotide Transferase (TdT), CD34 and CD19 (3-4, 9-12). A Common pre-B
48
49 ALL expressed CD10, cytoplasmatic CD22 (cCD22), CD19 and CD20 (3-4, 9-12).
50
51 This leukemia represents 75% and 50% of childhood and adults respectively. The Pre-
52
B leukemia express cytoplasm mü chain (cµ+) in addition to CD19, CD22 and CD10
53
54 (3-4, 9-12), representing approximately 15% and 10% of children and adults with
55
56 ALL (3-4, 9-12). Lastly, the mature B-cell ALL, present in 2% to 5% of children and
57
adults, presents an unusual phenotype, characterized by expression of surface
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immunoglobulin IgM (sIgM) and light chains kappa (κ) or lambda (λ) of
3
4 immunoglobulin on the surface membrane (3-4, 9-13). The blasts have the same
5
6 morphology FAB ALL-L3 and chromosomal translocations associated with malignant
7
cell of Burkitt's lymphoma (3-4, 9-12). This type of ALL has poor prognosis because
8
9 there is a high incidence of involvement in the central nervous system (CNS), poor
10
11 response to therapy and shortened survival (3-4, 9-13).
12
The T-Cell ALL is divided into three subgroups, according to the
13
14 differentiation antigens corresponding to the normal levels of intrathymic
15
16 differentiation, which are: pre-T, T-intermediate and mature or medullar ALL (9, 11,
17
14). In pre-T ALL, the blastic cells expressing CD3 in the cytoplasm (cCD3) but not
18
Fo
19 on the cell surface, characteristically expressing CD7, CD34 and strongly TdT (9, 11,
20
21 14). In intermediate ALL, the cells begin to express strongly CD7, cCD3, CD2, CD1a
22
and can co-express CD4 and CD8 simultaneously (cells double positive or
r
23
24 CD4+\CD8+) (9, 11, 14). In mature T-lineage ALL, thymocytes correspond to the
Pe
25
26 medullary cells express CD2, CD5, CD7 and surface CD3 (mCD3), occurring for the
27
dichotomy CD4 and CD8 antigens (9, 11, 14). The T-cell ALL is present in 25% of
28
er
29 adults and 15% of children with ALL and occurs very frequently in males, being
30
31 associated with a high white blood cell count (WBC) at diagnosis, mediastinal mass
32
and involvement in the CNS (9, 11, 14). The immunophenotypic profile of ALL is
Re
33
34 summarized in Table 1.
35
36 Given this information, the purpose of this study is to investigate a group of
vi
37
patients with ALL based on morphological classification, cytochemical analysis and
38
39 immunophenotypic antigen expression and intracytoplasmic and surface membrane
ew
40
41 detected by flow cytometry, as well as the correlation of these data with clinical and
42
43
laboratory characteristics of patients.
44
45
46 PATIENTS AND METHODS
47
48
Patients
49 Blast cells from peripheral blood (PB) and bone marrow (BM) derived from
50
51 126 newly diagnosed patients with ALL enrolled in the Department of Hematology
52
of Hemocentro Dalton Barbosa Cunha (HEMONORTE), Natal City located in
53
54 Northeastern Brazil, were included in this study. The demographic and clinical
55
56 features of these patients are shown in table 2. The diagnosis of ALL was initially
57
based on clinical presentation, peripheral blood (PB) and BM smears analyzed by the
58
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2 FAB criteria for morphological classification of ALL (5-6) and conventional
3
4 immunophenotyping according to WHO classification (9-11, 15-18). All patients
5
6 gave their written informed consent for the analysis according to the Helsinki
7 Declaration.
8
9 The diagnosis of acute leukemia was followed by the criterion of observation
10
11 of more than 20% blast cells in BM aspirate, which followed the morphological
12 criteria of the FAB classification as subtypes L1, L2 and L3 of PB and BM smear
13
14 stained with May-Grunwald-Giensa (MGG) and immunophenotyping by flow
15
16 cytometry.
17
18
Fo
19 Methods
20
21 Hematological analysis from peripheral blood
22 To hematological analysis from PB, ten milliliters (10 mL) of peripheral
r
23
24 venous blood was collected into vacutainer tubes containing EDTA and mixed
Pe
25
26 immediately. The white blood cells count (WBC); platelet count and hemoglobin
27 dosage was accomplished in the hematological analyzer (Cell-Dyn 3.000) and
28
er
29 cytomorphologic analysis was in blood films stained by MGG. There were 100
30
31 leukocytes counted and the result scored in percentage. Cytomorphologic alterations
32 were properly written down in the record of results.
Re
33
34
35
36 Bone Marrow Cytomorphology:
vi
37 Bone marrow (MB) aspirate smears were stained with MGG for
38
39 morphological analysis. Additional cytochemical staining of Sudan Black (SB) was
ew
40
41 performed with the aim of excluding cases of AML (3).
42
43
44
45
46
47 Flow Cytometry Analysis of Immunological Profile
48
49 Leukemic cells immunostain
50
51 The Immunophenotyping was performed by three-color flow cytometry
52 analysis of PB and /or BM samples. Cytoplasmatic and surface cell markers were
53
54 identified using a panel of MoAbs based on the EGIL (10, 11). The reactivity with
55
56 fluorescent conjugated MoAb against T-cell related antigens: CD1a, CD2, CD3,
57 CD4, CD5, CD7 and CD8; B-cell differentiation markers: CD10, CD19, CD20,
58
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2 CD22, CD79a; myeloid cell antigens: CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33, CD117
3
4 and MoAb anti-myeloperoxidase (MPO); non-lineage restrict molecules: nuclear
5
6 enzyme Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT), CD45, HLADR and CD34
7 and also monoclonal antibodies against heavy chains of IgM (mü chain), light chains
8
9 of immunoglobulin κ and λ. All MoAbs are from Becton Dickinson
10
11 Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA.
12
13
To stain of cell surface markers, one hundred microliliters (100 µL) of total
14 BM previously homogenized were incubated with the 20 µL of MoAb for 30 minutes
15
16 at room temperature and in darkness. Then, the suspension was homogenized and the
17
18 same increased to 1 mL of a 1 in 10 dilution of Becton Dickinson's FACS Lysing
Fo
19 solution in distilled water, having new incubation for more 10 minutes at room
20
21 temperature. After this period, the cellular suspension was centrifuged for 5 minutes
22
r
23 at 1.500 RPM, the supernatant fluid was discarded, and the cell pellet was
24 resuspended in cold phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2) and centrifuged again at
Pe
25
26 1,500 rpm, this last stage was repeated twice. At last, the cell pellet was resuspended
27
28 in one mL of cold 1% paraformaldehyde in PBS and the cell suspensions cold were
er
29 kept in the dark until flow cytometry analysis.

30
31 To detection of TdT and of cytoplasmatic (c) antigens: CD3, CD13, CD22, mü
32
chain and MPO, the leukemic cells were previous permeabilized by Becton
Re
33
34 Dickinson’s FACS lysing solution diluetdet 1:10 in distilled water for 10 minutes at
35
36 room temperature. It is a diethylene glycol-based solution that causes lysis of red blood
vi
37
38 cells and leads to a mild permeabilization of the other cells (19, 20). After this period,
39 the cellular suspension was centrifuged for 5 minutes at 1500 RPM, the supernatant
ew
40
41 fluid was discarded, and the cell pellet was resuspended and incubated with the 20 µL
42
43 of MoAb for 30 minutes at room temperature and in darkness. Then, the suspension
44
was homogenized, resuspended in cold phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2) and
45
46 centrifuged again for 5 minutes at 1.500 RPM, this last stage was repeated twice. At
47
48 last, the cell pellet was suspended in 1 mL of cold 1% paraformaldehyde in PBS and
49
the cell suspensions cold were kept in the dark until FC analysis. For each test, isotype-
50
51 matched antibodies was used as negative control (IgG1FITC\ (IgG1PE\IgG1PerCP).
52
53
54
55
Flow Cytometry analysis
56 A total of 20.000 events per sample were acquired with Fluorescence
57
58 Activated Cell Analyzer (FACScan, San Jose, CA, USA) with Cell Quest software
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8
1
2 (Cell Quest TM
Software, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose,
3
4 CA, USA). The samples were analyzed around the gated in population of blastic
5
6 cells, taking into account the parameters Forward Scatter (FSC) in linear scale that
7 evaluates the cellular size, Side Scatter (SSC) also in linear scale, which evaluates the
8
9 cellular complexity and cell marker expression analysis by fluorescence in FL1, FL2,
10
11 and FL3 channels in logarithmical scale that detects green, orange, and red
12 fluorescence, respectively which represents the antigen-antibody reaction conjugated
13
14 to Isohtiocyanate Fluorescein (FICT), Phycoerythrin (PE), and Peridin Chlorophyll
15
16 Protein (PerCP), respectively. The immunophenotyping was positive considered
17 happened were there more than 25% of positive cells for all MoAb. The Results were
18
Fo
19 supplied in the form of histograms in percentage of the cellular population with
20
21 positive or negative reaction and fluorescence intensity (Figures 1, 2 and 3).
22
r
23
24 RESULTS:
Pe
25
26 Immunophenotyping finding
27 The present study comprehends 126 patients’ newly diagnosed and untreated
28
er
29 patients with ALL. The data about of immune subsets of ALL are showed in table 2,
30
31 demonstrating 55 patients with T-cell ALL and 71 with B-lineage ALL.
32 The T-cell ALL diagnosis is based on their reactivity with various MoAbs
Re
33
34 anti- T antigens (Table 3). All diagnosed T-cell ALL have surface CD7 and cCD3
35
36 antigens. CD5 antigen was found in 50% of T-intermediate and in all T medullar
vi
37 ALL. In this group of patients, 14 (11.1%) had a characteristic phenotype of Pre-T

38
39 ALL: CD7+, cCD3+, HLADr+, CD34+ and strongly TdT+. The T-intermediate ALL
ew
40
41 were 12 cases (9.5%), whose phenotype were characterized by positivity to CD1a,
42 CD2, and also double-positive cells (CD4+/CD8+), maintaining the expression of
43
44 CD7, and cCD3 and also CD34+, TdT+ and HLADr+ in most cases. Still in this group
45
46 of T cell ALL, 29 cases (25%) were T medullar ALL whose main features were the
47 selective expression of CD4+ or CD8+ in the same way as mature T lymphocytes and
48
49 the expression of surface CD3 (sCD3) and negativity expression to CD1a, TdT,
50
51 HLADR and CD34 antigens. In this group of ALL, CD10 was found in 17 (31%)
52 cases and absent in 69 cases.
53
54 The characteristic of B-lineage ALL is also showed in table 3. These
55
56 leukemias were so named when more than 25% of leukemic cells expressing pan-B
57 cells markers (CD19). In this group, 6 cases (4.8%) had a phenotype characteristic of
58
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9
1
2 Pro-B ALL, expressing only CD19, HLA-DR, CD34 and TdT. The Common ALL
3
4 accounted for 48 cases (38.1%), whose phenotype showed the acquisition of CD10, as
5
6 well as expression of CD19, cCD22, and HLADr in most cases. The Pre-B cµ+ ALL
7
8
represented the total of 6 cases (4.8%) which characteristically expressed cµ+ in
9 addition to CD19, HLA-Dr, CD10 and cCD22. Finally, 11 cases (8.7%) were B-cell
10
11 ALL blast cells which presented the complete expression of surface IgM
12
13 immunoglobulin (sIgM+), expressing this way also the κ or λ light chains of
14 immunoglobulins.
15
16 Myeloid antigens expression as CD13 and CD33 was examined. The CD13
17
18 was more frequent than CD33. It was found in 5 cases of pre-B lineage and T-cell
Fo
19 ALL and the CD33 was found in 2 cases of pre-B ALL and one case of T-cell ALL.
20
21 MoAb against MPO and CD117 were negative in all cases analyzed.
22
r
23
24 Clinical and demographic Finding
Pe
25
26 In Table 4 are summarized the data relating to general groups, including age,
27
28 sex and some clinical characteristics of patients at diagnosis. Thus, one can observe a
er
29 predominance of males, regardless of immunophenotyping. Thus, the Pro-B ALL, it

30
31 was observed that 83.3% were males and 16.7% female. In 48 cases of Commom
32
Re
33 ALL, 27 (56.2%) were male and 21 (43.8%) female. In six cases of Pre-B cµ+ ALL 4
34
(66.7%) were male and two (33.3%) females, and in 11 ALL diagnosed as B-cell
35
36 ALL, eight (72.7%) were male and 3 (27.3%) were female. In T-cell ALL, we found
vi
37
38 the same trend, where the 55 patients studied, 39 (70.9%) were male and 16 cases
39
(29.1%) were female.
ew
40
41 The age of the study group studied ranged from 1 to 63 years. Thus, the Pro-B
42
43 ALL, ages ranged from 4 to 40 years, with a median of (15 years), in Commom ALL,
44
45 4 to 25 years with a median of 8 year, in Pre-B cµ+ ALL ranged from 1 to 25 with 18
46 of median, in B-cell ALL, 4 to 21 with a mean of 6 years and in T-cell ALL, however
47
48 ages ranged from 1 to 63 years with median 32.
49
50 In relation to clinical and tumor characteristics, indicated by presence of
51 lymphadenopathy, hepatomegaly, splenomegaly, tumor mass and leukemic infiltration
52
53 of the central nervous system (CNS). There was lymphadenopathy present in most
54
55 cases of ALL. In Pro-B ALL, this clinical finding was present in 4 cases (66.6%), in
56 25 cases (52.1%) of Commom ALL, in 3 cases (50.0%) of Pre-B cµ+ ALL in 9 cases
57
58 (81.8%) of B-cell and in 30 cases (54.5%) of T-cell ALL. The splenomegaly and
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2 hepatomegaly were also observed in most cases. Thus, the splenomegaly was
3
4 observed in 3 cases (50%) of Pro-B ALL, in 24 cases (50%) of Common ALL, in 4
5
6 cases (66.7%) of Pre-B cµ+ ALL, in 10 cases (90%) of B-cell ALL, and in 31 cases of
7
T-cell ALL. The hepatomegaly was observed in 3 cases (50%) of Pro-B ALL, 24
8
9 cases (41.7%) of Commom ALL, 4 cases (66.7%) of Pre-B cµ+ ALL, in 4 cases
10
11 (36.4%) of B-cell ALL and in 27 cases of T-cell ALL cells of T. The presence of
12
13 tumor mass were observed only in B-cell ALL and T-cell ALL. The presence of
14 abdominal mass was detected in 10 patients (90.9%) with B-cell ALL and in 1 case
15
16 with T-cell ALL. The presence of a mediastinal mass was observed only in 50 cases
17
18 (90.9%) individuals with T-cell ALL. The CNS involvement at diagnosis was
Fo
19 observed in 8 cases (11.7%) of the Common ALL, in 02 cases (18.2%) of B-cell ALL
20
21 and in 11 cases (20%) of T-cell ALL.
22
r
23
24 Laboratorial finding
Pe
25
26 The laboratorial finding of patients such as WBC, blast cell counts in
27
28 peripheral blood (BCC), FAB classification determined in cytomorphologic analysis
er
29 of bone marrow smear are showed in table 5. The WBC ranged from less than
30
31 5×109/L to values more than 100×109/L. WBC with values below 5x109/L was
32
observed in all groups except the T-cell ALL, although a small number of cases. Thus,
Re
33
34 it was observed in 1 case (16.7%) of Pro-B ALL, in 4 cases (8.3%) of Commom ALL,
35
36 in one case (16.7%) of Pre-B cµ+ ALL and in 02 cases (18.2%) of B-cell ALL.
vi
37
38 Samples with WBC between 10 and 50×109/L were observed in 3 cases (50%) of the
39
Pro-B ALL, 12 cases (25%) of Common ALL, 3 cases (50%) of Pre-B ALL cµ+, 4
ew
40
41 cases (36.4%) of B-cell ALL and 12 cases of T-cell ALL. WBC ranged 50.000 to
42
43 100×109/L were observed in 02 cases (33.3%) of Pro-B ALL, 09 cases (18.8%) of the
44
Common ALL, one case (9.0%) of B-cell ALL and 14 cases (25.4%) of T-cell ALL.
45
46 Finally, patients with WBC more than 100×109/L was observed in 12 cases (25%) of
47
48 Commom ALL, two cases (33.3%) of Pre-B cµ+ ALL, two cases (18.2%) of B-cell
49
50 ALL and 20 (36.4%) of T-cell ALL. The percentage of BCC ranged from 10 to 100%
51 in most patients. The percentage of BCC lass to 20% was observed in 6 cases (12.5%)
52
53 of Commom ALL, in one case of Pre-B cµ+ ALL and also B-cell ALL, totaling
54
55 16.7% and 9.1% respectively and in 4 cases (7.3%) of the T-cell ALL. BCC ranging
56 from 21 to 30% were found in 2 cases (4.2%) of Commom ALL, one case (16.7%) of
57
58 Pre-B cµ+ ALL, one patient with B-cell ALL and in 4 cases (7.3%) of the T-cell
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2 ALL. Already values understood between 31 and 60% was observed in 2 cases
3
4 (33.3%) of Pro-B ALL and also Pre-B cµ+ ALL, 5 cases (10.4%) of Commom ALL,
5
6 4 cases (36.4%) of B-cell ALL and 11 cases (20%) of the T-cell ALL. Finally, levels
7
of scores greater than 60% were observed in 4 cases (66.7%) of Pro-B ALL, 35
8
9 patients (72.9%) of Commom ALL, 2 cases (3.3%) of Pre-B cµ+ ALL 5 (45.5%) in
10
11 B-cell ALL and 36 cases (65.4%) of T-cell ALL.
12
13 The cytomorphological analysis of bone marrow aspirate of patients with ALL
14 according to the criteria proposed by the FAB group for the classification of ALL
15
16 showed 57 cases characterized as ALL-L1, 58 ALL-L2 and 11 ALL-L3, being
17
18 observed in the prevalence of type L1 in ALL of B progenitors cells and L2 in T-cell
Fo
19 ALL. All cases of ALL morphology L3 were classified as B-cell ALL, with 8 males
20
21 and 3 female with ages between 4 to 21 years. The blast cells were positive to CD19;
22
cCD79a; mCD22; HLADr, sIgM, negative to CD34 and TdT in all cases and showed
r
23
24 dimity express of CD10 in one case. The surface light chain immunoglobulin κ and λ
Pe
25
26 was expressed in 6 and 5 cases respectively.
27
28
er
29 Discussion
30
31 We see the results of this study we analyzed 126 patients with ALL, neoplastic
32
proliferation of immature lymphocytes, characterizing the early stages of
Re
33
34 differentiation. The prognosis and clinical course of patients with ALL depend on a
35
36 number of factors which attempt to stratify patients into different risk groups, leading
vi
37
38 them to different treatment strategies. The main variables include: age, sex, initial
39 WBC, race, cytogenetic abnormalities, immunophenotypic profile and response to
ew
40
41 treatment. The combination of these factors has been used to define risk factors and
42
43 therapy (1-4, 9, 11, 13).
44 Within this context, the use of MoAb has allowed a better knowledge of this
45
46 process, also enabling a better definition of the lineage and stage of differentiation of
47
48 cells involved in the process of leucemogese.(4, 9-11, 15-17).
49 The B-lineage ALL represent about 80% of cases and are defined
50
51 immunologically by the expression of pan-B cell marker (CD19) and also by the
52
53 demonstration of immunoglobulin gene rearrangement by molecular biology
54 techniques (3, 9-11, 14).
55
56 The T-cell ALL represent about 15 to 20% of all cases of ALL diagnosed and
57
58 are more related to poor prognostic factors such as high WBC, presence of tumor
59
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2 masses, generalized lymphadenopathy, and infiltration of the CNS. These leukemias
3
4 were initially identified by the presence of receptors for sheep red blood cells.
5
6 However, the most important immunophenotyping characteristics of these ALL are the
7 expression of pan-T antigens, such us the CD3 and CD7 antigens (3, 9-11, 14).
8
9 Although most of these cell markers are cell differentiation antigen, much of
10
11 these molecules are adhesion molecules or other type of surface glicoprotein with
12 involvement in the intercellular communication as molecules of complement system,
13
14 cytokines, immunoglobulin, growth factors and virus receptors (12, 21).
15
16 Among the factors considered as favorable are the age group between 2 and 10
17 years, WBC below 20×109/L, absence of organomegaly, immunophenotypic profile
18
Fo
19 pre-B Common ALL, hyperdiploidy, female, morphological subtype L1 and small
20
21 count of blast cells in bone marrow (3-4, 9,14, 22).
22 The factors stand out as unfavorable are: age less than 1 and greater than 10
r
23
24 years, WBC greater than 50×109/L, presence of organomegaly, male, L2 and L3 FAB
Pe
25
26 morphologic ALL subtypes, and the high blast cell count in bone marrow and
27 peripheral blood, absence of response to treatment, cytogenetic changes among which
28
er
29 stand out hipodiploidia well as chromosomal translocations, including: t(9;22), t(8;14),

30
31 t(4;11), t(1;19), and finally with respect to immunophenotyping fall into this group
32 subtypes immune Pro-B ALL, B-cell ALL and T-cell ALL (3-4, 9,14).
Re
33
34 Although clinically there appears to be large differences between pre-T, T-
35
36 intermediate or T-medullar ALL, some authors define the subtype early Pre-T ALL
vi
37 (cCD3+,CD7+, CD4-/ CD8-) with a poor prognosis with lower survival and resistance
38
39 to treatment (23, 24). Other authors, however, correlate T-cell ALL corresponding to
ew
40
41 the last stage of differentiation intrathymic (T-medullar ALL with mCD3+) along
42 with T-cell ALL whose blast cells express the transferrin receptor (CD71), as a worse
43
44 clinical outcome (25).
45
46 Literature reports have correlated immunological subtypes of ALL with age.
47 The Common ALL with negative expression of intracytoplasmic immunoglobulin
48
49 (cµ-) is a group of Pre-B ALL that has a better prognosis and better clinical outcome.
50
51 This type of ALL is more frequent in individuals younger than 15 years, which in
52
adults that are most affected by the T-cell ALL and Pro-B ALL (3-4, 9, 14, 22). In
53
54 this work, there was this trend where the 48 individuals with Common ALL was
55
56 observed predominance of this type of ALL in individuals younger than 15 years,
57
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2 with 73% of cases in contrast to the cases of T-cell ALL that struck more patients
3
4 aged greater than 15 years.
5
6 To analyzing the correlation of imunofenotipagens to the FAB classification of
7 blast cells from bone marrow of patents with ALL, was a trend of correlation of
8
9 morphological L1 type to the precursors B-cells ALL (Pro-B, Commom and Pre-B
10
11 cµ+ ALL with 83.3%, 62.5% and 83.3% of cases respectively). Since the T-Cell ALL,
12
however, were more correlated L2 lymphoblasts with 69.1% of cases analyzed. In B-
13
14 cell ALL was characteristically observed morphological type L3 in all cases.
15
16 These results being consistent with that described by several authors. The B-
17
cell ALL correlate directly with the morphological type L3 (3-4, 9-11). The other
18
Fo
19 immunological subtypes (T or pre-B ALL), however, may have blasts with L1 or L2
20
21 morphology, and blast cells with L1 morphology more frequent in Commom ALL and
22
those with more L2 morphology found in T-ALL and in ALL more immature B-
r
23
24 lineage as pro-B ALL (3-4, 9, 14).
Pe
25
26 Hepatomegaly and lymphadenopathy are usually present in most cases of
27
ALL. Other less frequent clinical manifestations fewer may also be present at
28
er
29 diagnosis is usually more related to poor prognosis factors and include: testicular
30
31 infiltration, neurologic manifestations due to infiltration of the SNC by leukemic
32
cells, as well as the presence of tumor masses (3-4. 9, 14).
Re
33
34 In this work, analysis of 126 patients with ALL had a higher incidence of
35
36 infiltration tumor in T-cell ALL and B-cell ALL, showing in some cases these
vi
37
leukemias, large tumor masses (abdominal and mediastinal), leukemic infiltration in
38
39 the CNS, as well as disseminated lymphadenopathy and massive hepatosplenomegaly
ew
40
41 in most cases (Table 4)
42
43
In other groups of ALL, however, some of these manifestations were also
44 present in most cases. Therefore, the lymphadenopathy and splenomegaly were
45
46 observed in most cases the Pro-B, Commom and Pre-B cµ+ ALL, totaling 66.6%,
47
48 52.1% and 50% of cases respectively. Since the SNC involvement was present in 8
49 cases (16.7%) of Commom ALL (Table 4). This situation was a high count of white
50
51 blood cells with high cell counts in peripheral blood blast.
52
53 Literature reports have associated leukemic involvement of CNS directly to the
54 volume of the tumor mass in peripheral blood from patients affected
55
56 (hyperleukocytosis associated with a high count of blast cells in peripheral blood) (26
57
58 -27). Some authors, however, reports that the leukemic cells migrate directly from
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2 bone marrow microenvironment of the bone of the skull inside the CNS, moving
3
4 through the same layer or adventitia of the vessels and migrate through the
5
6 perineurium following the path of the nerves that run through the space into the
7 subdural meninges (28). Another hypothesis also supported by these same authors is
8
9 that these cells penetrate the CNS due to bleeding caused by thrombocytopenia is
10
11 commonly observed in patients with acute leukemias (26-27).
12 Recent researchs have shown that this manifestation was in fact due to the
13
14 biological properties of leukemic cells regardless of the type and immune leukocytes,
15
16 these properties being translated by the aberrant expression of adhesion molecules
17 such as CD44 and the integrin family of molecules as VLA-4 and LFA-1 (21, 28-32).
18
Fo
19 Knowing that the interaction between the CNS and the immune system is regulated by
20
21 the blood-brain barrier, which has in its constitution, specialized endothelial cells that
22 regulate the passage of blood cells to the CNS in order to protect the brain tissue of the
r
23
24 possible attacks immune system. It is also known that inflammatory processes
Pe
25
26 affecting the CNS, there may be the passage of a greater number of leukocytes across
27 the blood-brain barrier due to increased permeability, and also by increased expression
28
er
29 of adhesion molecules on their surface, as well as in lymphocytes, as has been

30
31 observed in multiple sclerosis, viral encephalitis and meningitis. With this assumption,
32 it is believed that this way in leukemias and well as other neoplastic processes, the
Re
33
34 leukemic cells through adhesion molecules would settle to the endothelial cells
35
36 through the blood-brain barrier within the CNS through mechanisms of adhesion (21)
vi
37 The high WBC associated with high leukemic cell counts in peripheral blood
38
39 have also been consistently related to immunophenotypic profile and prognosis in
ew
40
41 ALL. Leukemia with WBC greater than 100×109/L generally have a worse prognosis
42 and is consistently related to T-cell ALL (3-4, 14). In this work, the WBC showed
43
44 different in most groups of ALL, presenting T-cell ALL a more direct correlation with
45
46 WBC more than 100×109/L and high number of blast cells in peripheral blood in most
47 cases, compared with ALL of the other groups, which showed white blood cell count
48
49 at different levels.
50
51 Finally, it is interesting to note that the expression of CD34 and TdT were
52 more observed in acute leukemias with little cellular differentiation. The CD34 is
53
54 more expressed in blast cells with little or no differentiation, as in acute
55
56 undifferentiated leukemia (3-4, 7-12). In this study the expression of this antigen was
57 further restricted to the Pro B ALL and Pre-T ALL (Table 3).
58
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2 The TdT is a nuclear enzyme expressed in B and T lineage progenitor cells and
3
4 plays the same role of the recombinase genes for rearrangement of the T Cell Receptor
5
6 (TCR) and immunoglobulins genes, contributing to the genetic diversity of these cells
7 (3). In this study, analyzing its expression in 42 cases of T-cell ALL, the 27 positives
8
9 cases were more presents in Pre-T and T-medullar ALL T. In B lineage ALL, were
10
11 more present in Pro-B and Commom ALL and negative in all patients with B-cell
12 ALL.
13
14 In conclusion, it is important to emphasize the importance of
15
16 immunophenotyping in the diagnosis of leukemia, relating them to the physio-
17 pathological events, particularly the acute forms, thus assuming immunophenotyping
18
Fo
19 fundamental importance also in research and monitoring of the evolution prognostic as
20
21 well as evaluation of pathological mechanisms of evolution of acute lymphoblastic
22 leukemia.
r
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52
53
54 Table 1- Immunophenotypic subsets of ALL
55
56 Subset of ALL Immunophenotyping
57
58
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1
2
3 Pre-T ALL CD7+; cCD3+/-;CD2-; CD1a-; CD34+; HLADr+;TdT+
4
T-intermediate ALL CD7+; cCD3+; CD2+; CD1a+; CD4+; CD8+; HLADr+/-; TdT+
5
6 T-medullar ALL CD7+; sCD3+; CD2+; CD1a-; CD4+ or CD8+; HLADr-; TdT+/-
7
8 Pro-B ALL HLADr+; CD19+;cCD79a+; CD34+; CD10-; CD20-; cCD22-; cµ-; TdT+
9
10 Commom ALL HLADr+; CD19+; cCD79a+; CD34+; CD10+; CD20+/-; cCD22+/-; cµ-; TdT+
11
12 pre-B (cµ+) ALL HLADr+; CD19+; cCD79a+;CD34+/-; CD10+; CD20+; sCD22+; cµ+; TdT+/-
13
14 B Cell (sIgM+) ALL HLADr+; CD19+; cCD79a+; CD34-; CD10-; CD20+; sCD22+; sIgM+; TdT-
15
16 Obs: cCD3 (cytoplasmatic CD3); sCD3 (surface CD3); cCD22 (cytoplasmatic CD22); sCD22
17 (surface CD22); cµ
µ (cytplasmatic mü heave chain of immunoglobulin); sIgM (surface IgM
18
immunoglobulin); TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase).
Fo
19
20 According to the modifications of Matutes E (11); Bachir E et al (9).
21
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44
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46
47
48
49
50
51 Table 2- Subsets of acute lymphoblastic leukemia in this study
52
53 Immunological subsets of ALL Nº (%)
54
55
T-cell ALL 55 (43.6%)
56 Pre-T ALL 14 (11.1%)
57
58
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2
3 T intermediate ALL 12 (9.5%)
4
T medullar ALL 29 (25%)
5
6 B lineage ALL 71 (43.6%)
7
8 Pro-B ALL 06 (4.8%)
9
10 Commom ALL 48 (38.1%)
11
12 Pre-B cµ+ ALL 06 (4.8%)
13 B cell ALL 11 (8.7%)
14
15 Total ALL 126 (100%)
16
17
18
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34
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37
38
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ew
40 Table 3. Diagnosis of ALL based on reactivity with various monoclonal antibodies

41
42 B-cell linea g e ALL T-cell ALL
43
44 Markers
Pro-B Commom Pré Bcµ
µ+ B-Cell Pre-T T-int. T-med
45
46 NT\+ (%) NT\+ (%) NT\+ (%) NT\+ (%) NT\+ (%) NT\+ (%) NT\+ (%)
47
48 CD10+ 06\00 ( - ) 48\48 (100) 06\06 (100) 11\01 (9.1) 14 \02 (14.3) 12 \ 00 ( - ) 29 \15 (51.7)
49
50 CD19+ 06\06 (100 ) 48\48 (100) 06\06 (100) 11\11 (100) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
51 cCD22 +
06\00 ( - ) 48\32 (66.7) 06\06 (100) 11\11 (100) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
52 +
53 sCD22 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\06 (100) 11\11 (100) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
54 cCD79a+ 06\06 ( 100 ) 48\48 (100) 06\06 (100) 11\11 (100) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
55
+
56 cµ
µ 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\06 (100) NA 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
57
58 sIgM+ 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\11 (100) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
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2
3 κ+
anti-κ NA NA NA 11\06 (54.5) NA NA NA
4 λ+
anti-λ NA NA NA 11\05 (45.4) NA NA NA
5
+
6 CD1a 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - )) 14\00 ( - ) 12\12 (100) 29\00 ( - )
7
CD2+ 06\06 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\00 ( - ) 12\12 (100) 29\29 (100)
8
+
9 cCD3 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\08 (57.1) 12\12 (100) 29 \ 26 (89.7)
10 +
11 sCD3 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\29 (100)
12 CD4-/CD8- 06\06 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\14 (100) 12\00 ( - ) 29\00( - )
13
+ +
14 CD4 /CD8 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\00 ( - ) 12\12 (100) 29\00( - )
15
CD4+/CD8- 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14 \00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\18 (62.1)
16
17 CD4-/CD8+ 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14 \ 00 ( - ) 12 \00 ( - ) 29 \13 (44.8)
18 +
CD5 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14 \ 00 ( - ) 12 \06(50.0) 29 \29 (100)
Fo
19
20 CD7+ 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\14 (100) 12\12 (100) 29\29 (100)
21 +
22 CD13 06\02 (33.3) 48\02 (4.16) 06\01 (16.6 ) 11\00 ( - ) 14\05 (35.7) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
r
23 CD33 +
06\01 (16.6) 48\00 ( - ) 06\01 (16.6) 11\00 ( - ) 14\01 (4,14) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
24
CD117+
Pe
25 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )

26 +
anti-MPO 06\00 ( - ) 48\00 ( - ) 06\00 ( - ) 11\00 ( - ) 14\00 ( - ) 12\00 ( - ) 29\00 ( - )
27
28 HLADR+ 06\05 (83.3) 48\44 (91.7) 06\06 (100) 11\10 (90.9) 14\11 (78.6) 12\09 (75.0) 29\08 (27.6)
er
29
30 CD34+ 06\04 (66.6) 48\17 (35.4) 06\02 (33.3 ) 11\00 ( - ) 14\10 (71.4) 12 \08 (66.6) 29 \ 00 ( - )
31 +
TdT 06\06 (100) 48\46 (95.8) 06\04 (66.6) 11\00 ( - ) 08\07 (87.5) 11\09 (81.8) 25\02 (08.0)
32
Re
33 Obs: cCD3 (cytoplasmatic CD3); sCD3 (surface CD3); cCD22 (cytoplasmatic CD22); sCD22 (surface
34
35 CD22); cµ
µ (cytplasmatic mü heave chain of immunoglobulin); cMPO (cytoplasmatic mieloperoxidasis);
36 sIgM (surface IgM immunoglobulin); TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase); cCD79a
vi
37
38 (cytoplasmatic CD79a); anti-κ
κ (anti ligh chain kappa of immunoglobulin); anti-λ
λ (anti ligh chain lambda
39 of immunoglobulin); NA (no aplicable); T-int (T-intermediate ALL); T-med (T-medullar ALL).
ew
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
Table 4. Clinical and demographic features of the subjects in 126 ALL patients
54
55
56 Pro-B Commom Pre-B cµ+ B-cell T-cell
57 ALL ALL ALL ALL ALL
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n=6 n=48 n=6 n=11 n=55
4
Age. (median) 4-40 (15) 4-21(8) 1-25 (18) 4-21 (6) 2-63 (32)
5
6 Male 5 (83.3%) 27 (56.2%) 4 (66.7%) 8 (72.7%) 39 (70.9%)
7
8 Female 1 (16.7%) 21 (43.8%) 2 (33.3%) 3 (27.3%) 16 (29.1%)
9
Lymphadenopathy 04 (66.6%) 25 (52.1%) 03 (50.0%) 09 (81.8%) 30 (54,5%)
10
11 Splenomegaly 03 (50.0%) 24 (50.0%) 04 (66.7%) 11 (90.0%) 31 (56.4%)
12
13 Hepatomegaly 03 (50.0%) 20 (41.7%) 04 (66.7%) 04 (36.4%) 27 (49.1%)
14
15 Abdominal Mass 0(-) 0(-) 0(-) 10 (90.9%) 01 (1.81%)
16
17
Mediastinal Mass 0(-) 0(-) 0(-) 0(-) 50 (90.9%)
18 CNS involvement 0(-) 08 (16.7%) 0(-) 02 (18.2%) 11 (20.0%)
Fo
19
20 Obs: CNS (Central Nervous System)
21
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36
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40
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42
43
44
45 Table 5. Laboratorial finding of the subjects in 126 ALL patients
46
47
48
Laboratorial Pro-B Commom Pre-B cµ
µ+ B-cell T-cell
49
50 Finding ALL ALL ALL ALL ALL
51 n=6 n=48 n=6 n=11 n=55
52
53 WBC (×109/L) 3.6 to 448.0 1.0 to 400.0 40.6 to 600.0 1.5 to 600.0 10.5 to 720.0
54
55 < 5.0 01 (16.7%) 04 (8.3%) 01 (16.7%) 02 (18.2%) 00 ( - )
56
57
58
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1
2
3 5.0 to 10.0 00 ( - ) 11 (22.9%) 00 ( - ) 02 (18.2%) 09 (16.4%)
4
5 10.0 to 50.0 03 (50.0%) 12 (25.0%) 03 (50.0%) 04 (36.3%) 12 (21.8%)
6
7 50.0 to 100.0 02 (33.3%) 09 (18.8%) 00 ( - ) 01 (9.1%) 14 (25.4%)
8
9 > 100.0 00 ( - ) 12 (25.0%) 02 (33.3%) 02 (18.2%) 20 (36.4%)
10
11
12 % BCC(median) 60 to 100 (80) 10 to 100 (60) 20 to 100 (60) 20 to 100 (80) 10 to 100 (80)
13
14 10 to 20 00 ( -) 06 (12.7%) 01 (16.7%) 01 (9.1%) 04 (7.3%)
15
16 21 to 30 00 ( - ) 02 (4.2%) 01 (16.7%) 01 (9.1%) 04 (7.3%)
17
18 31 to 60 02 (33.3%) 05 (10.4%) 02 (33.3%) 04 (36.4%) 11 (20.0%)
Fo
19
20
61 to 100 04 (66.7%) 35 (72.9%) 02 (33.3%) 05 (45.4%) 36 (65.4%)
21
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23 French American British (FAB) morphologic classification
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25 ALL-L1 05 (83.3%) 30 (62.5%) 05 (83.3%) 0(-) 17 (30.9%)

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Obs: CNS (Central Nervous System); PB (Peripheral Blood); WBC (White Blood Cell).
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Gabriela Vasconcelos de Andrade Alves

Caracterização Hematológica e Imunofenotípica em

Tese apresentada á Universidade Federal do

Caracterização Hematológica e Imunofenotípica em Pacientes

Tese apresentada á Universidade Federal do

Área de concentração: Biotecnologia em Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso

Alves, Gabriela Vasconcelos de Andrade.

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Leucemia Linfóide Aguda - Tese. 2. Citometria de fluxo - Tese. 3.

RN/UF/BCZM CDU 616.155.392

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA - RENORBIO/UFRN

DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS

Chefe do Departamento: Telma Maria Araújo Moura Lemos

Coordenador do Curso de Pós-graduação: Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo

Caracterização Hematológica e Imunofenotípica em Pacientes

Ao meu ex-professor da disciplina de Imunologia Clínica do curso de Farmácia e

percorre igualmente caminhos variados e etapas diversas, também recebe afluentes de

conhecimentos, aqui e ali, avoluma-se em expressão e purifica-se em qualidade, antes de

encontrar o Oceano Eterno da Sabedoria.

Uma existência é um ato.

Um corpo - uma veste.

Um serviço - uma experiência.

Um triunfo - uma aquisição.

“Uma morte - um sopro renovador.”

André Luiz do livro Nosso lar.

Agradeço aqueles que de forma direta ou indireta colaboraram para que a

realização deste trabalho se concretizasse e, portanto, foram fundamentais. Assim,

aqui expresso o meu sincero agradecimento…

proporcionar esperança de cura, melhores dias e melhores tratamentos.

À equipe do Laboratório de Hematologia e Citometria de Fluxo (especialmente

do Rio Grande do Norte possibilitaram o desenvolvimento desta tese.

Aos médicos hematologistas, que compartilharam da responsabilidade de cada

diagnóstico, entregando e confiando parte dos destinos de seus pacientes à equipe

do Laboratório de Citometria de Fluxo (leia-se principalmente “Geraldo”),

nessa pesquisa. Preocupava-se com o andamento do projeto, que teve alguns

À minha sogra, D. Maria, que sempre esteve ao meu lado se disponibilizando em

importante no desenvolvimento desta Tese, e com quem tive a satisfação de poder

compartilhar dos seus conhecimentos.

vou seguir à vida com coragem.

Tese desenvolvida no Hemocentro Dalton Cunha Barbosa no Laboratório

Este trabalho contou com o auxílio financeiro do Programa de Demanda

Figura 1. Representação esquemática do processo de diferenciação da

Tabela 1. Principais antígenos de diferenciação utilizados na hematopoese

Palavras-chaves: Leucemia Linfóide Aguda, Citometria de Fluxo, Imunofenotipagem.

As LA compreendem um grupo de neoplasias caracterizadas pela

Avaliar o perfil imunofenotípico das leucemias linfoblásticas agudas

1. Conhecer a distribuição dos subtipos imunológicos das LLA em cada gênero e em

2. Avaliar as características clínicas e hematológicas nesses pacientes;

3. Correlacionar os subtipos morfológicos da classificação FAB (L1, L2 e L3) com os

4. Avaliar a importância dos diferentes marcadores celulares nos diferentes subtipos B

5. Estudar a incidência de LLA com expressão de fenótipos aberrantes.

2.1 Hematopoese e diferenciação celular

Em humanos a hematopoese, o processo de formação das células

Figura 1 - Representação esquemática do processo de diferenciação da linhagem

A linhagem mielóide origina-se a partir de um precursor multipotente

Fonte: Ruiz-Arguelles, San-Miguel (1996); apud McArtur, Torres-Lopez (1996).

Figura 2 - Marcadores celulares e diferenciação da linhagem mielóide.

O sistema imunológico do homem tem sua atividade exercida por

O linfócito B, por definição, é uma célula capaz de produzir

Os linfócitos T são morfologicamente semelhantes aos linfócitos B

O compartimento I é composto por células blásticas de grande