Eksperimen Meselson-Stahl

Hasil dari tes kritis pertama proposal Watşon dan Crick yang mereplikasi DNA secara
semikonservatif yang diterbitkan pada tahun 1958 oleh MS Meselson dan FW Stahl. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa kromosom dari basil usus besar Escherichia col direplikasi secara
semikonservatif Meselson dan Stahl menumbuhkan sel-sel colt E selama beberapa generasi dalam
suatu medium di mana liotop nitrogen yang berat, "N, telah digantikan dengan isotop ringan yang
normal," basa purin dan pirimidin dalam DNA mengandung nitrogen, dengan demikian, DNA sel
yang tumbuh pada media yang mengandung memiliki kepadatan yang lebih besar (berat per unit
volurne). Karena molekul dengan kepadatan yang berbeda dapat dipisahkan oleh prosedur yang
disebut sentrifugasi gradien densitas kesetimbangan, Meselson dan Stahl wee membedakan antara
tiga mode kemungkinan replikasi DNA dengan mengikuti perubahan densitas DNA sel yang
ditumbuhkan pada media 1N dan kemudian ditransfer ke "media N untuk berbagai periode waktu
(disebut eksperimen transfer densitas. Kepadatan dari sebagian besar DNA adalah sama dengan
kepadatan larutan konsentrasi dari garam berat seperti sebagai sesium klorida (CsCI). Misalnya,
kepadatan 6 M CsCI adalah sekitar 1,7 g / cm. Escherichia coli DNA con-Watsontaining 'N
memiliki kerapatan 1,710 g / cm3 Pergantian molekul I untuk N meningkatkan 8 / kerapatan DNA
E. coli menjadi 1,724 / cm Ketika larutan garam berat seperti 6 M CsCl dititrifikasi pada sangat
tinggi kecepatan (30.000-50.000 revo lusi per menit) selama 48-72 jam, gradien kepadatan
kesetimbangan terbentuk (Gbr. 5.14). Gaya sentrifugal yang disebabkan oleh pemintalan larutan
dengan kecepatan tinggi mengendapkan garam ke bagian bawah tabung. Difusi, di sisi lain,
menghasilkan pergerakan molekul garam kembali ke atas (konsentrasi garam rendah) dari tabung.
Setelah periode yang cukup tinggi sentrifugasi kecepatan, tercapai keseimbangan antara sedasi
menengah dan difusi, di mana saat itu terdapat gradien linier peningkatan kepadatan dari bagian
atas tabung ke botuom tabung (Gbr, 5 14) Jika DNA hadir dalam gradien seperti itu, ia akan
bergerak ke posisi di mana kepadatan larutan garam sama dengan densitasnya sendiri. Jadi, jika
campuran DNA E. coli yang mengandung SN "DNA berat" dan DNA E. coli yang mengandung
"N (" ringan "DNA) dikenai sentrifugasi CsCl equilibrium densipy-gradlent, molekul DNA akan
terpisah menjadi dua" pita, "satu berisi DNA" berat "dan satu berisi" ringan "DNA (Gbr. 5.14).
Meselson dan Stahl mengambil sel yang telah tumbuh dalam medium yang mengandung 1SN
selama beberapa generasi (dan dengan demikian mengandung DNA "berat"), dicuci untuk
menghilangkan media yang mengandung 1SN, dan memindahkannya ke media yang mengandung
N. Setelah membiarkan sel-sel untuk tumbuh di hadapan N untuk periode waktu yang bervariasi,
DNA diekstraksi dan dianalisis dalam gradien kepadatan kepadatan CsCl. Hasil percobaan
sebelumnya pada (Gambar 5.15) hanya konsisten dengan replikasi serviks semicon 14, tidak
termasuk model konservatif dan dispersif sintesis DNA. Semua DNA dipisahkan dari sel setelah
satu generasi pertumbuhan di concen- medium yang mengandung "N memiliki kepadatan setengah
jalan antara kepadatan" berat "DNA dan" ringan "DNA. Kepadatan menengah ini biasanya disebut
sebagai kepadatan" hibrida ".

Satu generasi replikasi semikonservatif dari double parental yang ia lengkapi dengan 'N dalam
medium yang hanya mengandung N akan menghasilkan dua heliks ganda progeni yang keduanya
memiliki 1SN dalam satu untai (untai "lama") dan 1N pada untai lainnya (yang' baru ' "strand).
Molekul tersebut molekul DNA dengan kepadatan" hibrida ", setelah satu generasi replikasi
konservatif dari DNA" berat "dalam medium" ringan ", setengah dari DNA masih akan" berat dan
separuh lainnya akan menjadi "ringan. " Jika replikasi tersebar, Meselson dan Stahl akan
mengamati pergeseran DNA dari "berat" ke "cahaya" di setiap generasi (yaitu, "setengah berat"
atau "hibrida" setelah satu generasi, "seperempat berat" setelah dua generasi, dll.) Hasil Meselson
dan Stahl jelas tidak konsisten dengan kepadatan "hibrid". Replikasi konservatif tidak akan
menghasilkan apa pun dari kedua kemungkinan ini. Kepadatan menengah ini biasanya disebut
sebagai kepadatan" hibrida ", Setelah dua generasi pertumbuhan dalam medium mengandung. ng"
N, setengah DNA memiliki kerapatan "hibrida" dan separuhnya "ringan". Resi'l ini persis seperti
yang diprediksi oleh modus replikasi semikonservatif Watson dan Crick (Gambar 5.15). Satu
generasi replikasi semikonservatif dari double parental yang ia lengkapi dengan 'N dalam medium
yang hanya mengandung N akan menghasilkan dua heliks ganda progeni yang keduanya memiliki
1SN dalam satu untai (untai "lama") dan 1N pada untai lainnya (yang' baru ' "strand). Molekul
tersebut molekul DNA dengan kepadatan" hibrida ", setelah satu generasi replikasi konservatif
dari DNA" berat "dalam medium" ringan ", setengah dari DNA masih akan" berat dan separuh
lainnya akan menjadi "ringan. " Jika replikasi tersebar, Meselson dan Stahl akan mengamati
pergeseran DNA dari "berat" ke "cahaya" di setiap generasi (yaitu, "setengah berat" atau "hibrida"
setelah satu generasi, "seperempat berat" setelah dua generasi, dll.) Hasil Meselson dan Stahl jelas
tidak konsisten dengan kepadatan "hibrid". Replikasi konservatif tidak akan menghasilkan apa pun
dari kedua kemungkinan ini. Studi selanjutnya telah memverifikasi Meselson dan berguna dalam
mempelajari metabolisme DNA karena DNA dapat secara khusus dilabeli dengan menumbuhkan
sel-sel pada Hjthy midine, deoxyribonucleoside tritiated thymine Thymidine dimasukkan secara
eksklusif ke dalam DNA; tidak ada dalam komponen utama sel lainnya. Cairns menumbuhkan sel
E. coli dalam medium yang mengandung [Phithymidine untuk periode waktu yang berbeda,
melisiskan sel dengan sangat lembut agar tidak merusak kromosom (molekul DNA panjang sangat
peka terhadap geser), dan dengan hati-hati mengumpulkan kromosom pada filter membran. Filter-
filter ini ditempelkan pada slide kaca, dilapisi dengan emulsi yang peka terhadap partikel-ß
(elektron berenergi rendah yang dipancarkan selama peluruhan tritium), dan disimpan dalam gelap
selama periode waktu untuk memungkinkan cukup peluruhan radioaktif. Autoradiograf yang
diamati ketika film dikembangkan (Gambar 5.16) menunjukkan bahwa semikonservatif
kromosom E coll adalah struktur melingkar yang ada sebagai zat antara 6-bentuk selama replikasi.
Autoradiograf ini lebih lanjut menunjukkan bahwa tidak berliku dari dua helai orangtua yang
saling melengkapi diamati (yang diperlukan untuk pemisahan mereka) dan replikasi
semikonservatif mereka terjadi secara bersamaan atau sangat erat. Karena penggandaan heliks
ganda orangtua. harus berputar 360 untuk melepaskan setiap pilin dari heliks, ini mengharuskan
adanya semacam "putar" dalam kromosom. Bukti yang ada menunjukkan bahwa transient single-
strand break (pembelahan satu phos. ikatan phodiester dalam satu helai double helix) Interpretasi
Cairns terhadap autoradiograf adalah bahwa replikasi semikonservatif dilakukan di sebuah situs
pada semua kromosom, yang dia beri nama "asal", dan memberikan sumbu rotasi untuk
memungkinkan gulungan berjalan secara berurutan dan tanpa arah di sekitar struktur lingkaran.
Bukti berikutnya pada satu titik: replikasi sebenarnya menghasilkan bidirecional, bukan tanpa
arah. Setiap struktur berbentuk Y adalah garpu replikasi, dan dua garpu replikasi telah
menunjukkan penafsiran aslinya tidak benar bergerak ke arah yang berlawanan secara berurutan
di sekitar kromosom sirkular.
RETROVIRUS
Retrovirus mempelajari penyebab jenis tumor tertentu pada hewan seperti ayam, kucing,
dan tikus. Dalam kasus virus RNA terlibat dalam produksi tumor. Virus tersebut datang pada tahun
1970 ketika David Baltimore, Howard Temin, dan Satoshi Mizutani menemukan DNA polimerase
yang bergantung pada RNA — yaitu, transkriptase terbalik yang memungkinkan virus ini untuk
menyalin RNA ke dalam DNA. Penemuan ini mengawali penelitian pada proses transkripsi
terbalik dan memberikan gambaran sekilas tentang apa yang mungkin terjadi disebut "dunia-retro"
kumpulan sekuens DNA yang sangat besar yang berasal dari kebalikannya transkripsi. Kita ketahui
bahwa transkripsi balik bertanggung jawab untuk mengisi genom dengan banyak jenis sekuens
DNA, termasuk, tentu saja, retrovirus.
Penemuan reverse transcriptase karena itu membuka pandangan ke komponen genom
yang sebelumnya belum dijelajahi. Berbagai jenis retrovirus telah diisolasi dan diidentifikasi.
Namun, lambangnya adalah human immunodeficiency virus (HIV), yang menyebabkan kekebalan
tubuh didapat sindrom defisiensi, atau AIDS, penyakit yang sekarang menyerang puluhan juta
orang. AIDS pertama kali terdeteksi pada kuartal terakhir abad 20. Hal ini merupakan penyakit
serius dari sistem kekebalan tubuh. Seiring perkembangannya, seseorang kehilangan kemampuan
untuk melawan infeksi oleh bermacam-macam patogen, termasuk organisme yang biasanya jinak.
Tanpa pengobatan, orang yang terinfeksi menyerah pada infeksi ini, dan akhirnya mereka mati.
AIDS ditularkan dari satu orang ke orang lain melalui cairan tubuh seperti darah atau air mani
yang telah terkontaminasi dengan HIV. Gejala awalnya dari penyakit ini seperti flu. Individu yang
terinfeksi mengalami sakit, demam, dan kelelahan. Setelah beberapa minggu, gejala-gejala ini
mereda dan kesehatan tampaknya pulih. Ini keadaan tanpa gejala dapat berlangsung beberapa
tahun. Namun, virus terus bertambah banyak dan menyebar ke seluruh tubuh, menargetkan sel-sel
khusus yang memainkan peran penting sistem kekebalan tubuh. Akhirnya, sel-sel ini sangat
terkuras oleh aksi pembunuhan virus bahwa sistem kekebalan tubuh gagal dan patogen
oportunistik menegaskan diri mereka sendiri. Banyak jenis penyakit, seperti pneumonia, dapat
terjadi. AIDS adalah penyebab utama kematian di antara subpopulasi di banyak negara —
misalnya, di antara intravena pengguna narkoba dan pekerja industri seks — dan di Afrika sub
Sahara, itu adalah penyebab utama kematian dalam populasi pada umumnya.
1. HIV berlabuh dengan sel target melalui interaksi antara protein virus gp120 dan protein
reseptor CD4 seluler.
 2. Selaput virus dan seluler berfusi, memungkinkan inti virus memasuki sel.
3. RNA dan protein terkait dilepaskan dari inti virus.
4. Reverse transcriptase mengkatalisis sintesis DNA virus untai ganda dari RNA virus untai
tunggal dalam sitoplasma.
5. Integrase mengkatalisasi penyisipan DNA virus ke dalam DNA seluler di dalam nukleus.
6. RNA polimerase seluler mentranskripsi DNA virus menjadi RNA virus.
7. Beberapa viral RNA berfungsi sebagai mRNA untuk sintesis protein virus.
8. Beberapa viral RNA membentuk genom virus progeni.
9. Partikel virus progeni berkumpul di dekat membran sel.
10. Partikel virus progeni diekstrusi dari sel dengan cara pemula.
11. Partikel virus progeni bebas menginfeksi sel lain.
Karena sifatnya yang mematikan dan status pandemi, HIV / AIDS menjadi fokus utama
sejumlah besar penelitian. Salah satu hasil dari upaya ini adalah detail pemahaman tentang siklus
hidup HIV. Virus bola memasuki host sel dengan berinteraksi dengan protein reseptor spesifik,
yang disebut reseptor CD4, yaitu terletak di permukaan sel. Interaksi ini dimediasi oleh
glikoprotein (protein gula yang telah dilampirkan) disebut gp120, yang tertanam di dalam lipid
membran yang mengelilingi partikel virus. Setelah gp120 "berlabuh" dengan CD4 reseptor,
membran virus dan seluler berfusi dan partikel virus diterima sel. Di dalam sel, membran lipid
dan mantel protein yang mengelilingi partikel virus dihapus, dan bahan-bahan di dalam inti virus
dilepaskan ke dalam sitoplasma sel. Inti ini mengandung dua molekul RNA untai tunggal yang
identik genom virus dan sejumlah kecil protein yang memfasilitasi replikasi genom, termasuk
dua molekul dari virus reverse transcriptase, satu terikat pada masing-masing untai RNA virus.
Reverse transcriptase HIV dan reverse transcriptase lainnya juga — bertobat RNA untai
tunggal menjadi DNA untai ganda. Menghasilkan double-stranded Molekul DNA kemudian
dimasukkan pada posisi acak dalam kromosom sel yang terinfeksi, akibatnya mengisi genom sel
itu dengan banyak salinan virus genom. Salinan ini kemudian dapat ditranskripsi oleh RNA
polimerase biasa sel untuk menghasilkan sejumlah besar RNA virus, yang berfungsi untuk
mengarahkan sintesis protein virus dan juga menyediakan RNA genomik untuk perakitan partikel
virus baru. Partikel-partikel ini diekstrusi dari sel dengan proses tunas melalui sel selaput. Partikel
yang diekstrusi kemudian dapat menginfeksi sel lain dengan berinteraksi dengan Reseptor CD4
pada permukaannya. Dengan cara ini, materi genetik HIV direplikasi dan disebarkan melalui
populasi sel imun yang rentan.
Genom HIV, panjangnya sedikit lebih dari 10 kilobase, mengandung beberapa gen. Tiga
dari gen-gen ini, dinyatakan gag, pol, dan env, ditemukan di semua retrovirus lainnya. Gen gag
mengkode protein dari partikel virus; gen pol mengkodekan sebaliknya transkriptase dan enzim
lain yang disebut integrase, yang mengkatalisis penyisipan Bentuk DNA dari genom HIV ke dalam
kromosom sel inang mengkodekan glikoprotein yang tertanam dalam amplop lipid virus.
Proses replikasi genom, dikatalisasi oleh reverse transcriptase, dimulai dengan sintesis
DNA tunggal untai komplementer dengan RNA untai tunggal dari genom virus. Itu prima oleh
tRNA yang melengkapi urutan yang disebut PBS (situs pengikatan primer) terletak di sebelah kiri
pusat dalam RNA HIV (langkah 1 pada Gambar 17.12). TRNA ini Dikemas sudah terikat dengan
PBS di inti HIV. Setelah membalikkan transkriptase mengkatalisasi sintesis 3 ujung DNA virus,
ribonuklease H (RNase H) mendegradasi RNA genomik dalam dupleks RNA-DNA (langkah 2).
Degradasi ini meninggalkan urutan berulang (R) dari untai DNA yang baru lahir bebas untuk
hibridisasi dengan urutan R pada ujung 3 RNA HIV. Hasil bersihnya adalah bahwa wilayah R dari
untai DNA yang baru lahir “melompat” dari 5 ujung RNA HIV ke ujung 3 RNA HIV (langkah 3).
Reverse transcriptase selanjutnya memperluas salinan DNA dengan menggunakan 5 wilayah RNA
HIV sebagai templat (langkah 4).
Pada langkah 5, RNaseH mendegradasi semua RNA dalam dupleks RNA-DNA kecuali
yang kecil wilayah, saluran polipurin (PPT), yang sebagian besar terdiri dari purin adenin dan
guanin. Saluran polipurin ini digunakan untuk mengunggulkan sintesis DNA untaian kedua bagian
dari genom HIV (langkah 6). Setelah tRNA dan RNA genom hadir dupleks RNA-DNA
dihilangkan (langkah 7), "lompatan" DNA kedua terjadi selama dimana PBS pada ujung 5 untai
DNA kedua berhibridisasi dengan PBS komplementer pada ujung 5 untai DNA pertama (langkah
8). 3-hidroksil termini dari dua untai DNA kemudian digunakan untuk sintesis DNA utama untuk
menyelesaikan sintesis DNA HIV untai ganda (langkah 9). Perhatikan bahwa konversi virus RNA
ke DNA virus menghasilkan urutan tanda tangan di kedua ujung molekul DNA. Urutan ini, disebut
long terminal repeats (LTRs), diperlukan untuk integrasi genom virus ke dalam DNA sel inang.