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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS


Práctica Aislamiento del DNA de origen vegetal y
su caracterización espectrofotometrica
Bioquímica General. Grupo 4QM1 Sección 4
Equipo: Rosales Vázquez Maria Luisa Perea Alcala Fernando

INTRODUCCIÓN e) Se agrega el cloroformo: alcohol isoamilico para


Los ácidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado desnaturalizar proteínas y el isoamilico va a bajar
peso molecular que se pueden encontrar en las células la constante dieléctrica.
asociados a proteínas formando complejos llamados nucleo- f) Se centrifuga para separar los compuestos que
proteinas. precipitaron debido a la desnaturalización y el cambio
del constante dieléctrica que se llevó acabo en el
La función biológica de los ácidos nucleicos es fundamental el paso “e”.
DNA está asociado con el material genético de las células
g) Se recupera el sobrenadante ya que en este se
pudiendo encontrarse con una sola cadena almacena
información genética y sirve de molde para la síntesis de encuentra el DNA y RNA.
proteínas. El RNA participa en la síntesis de proteínas y se h) El sobrenadante se agrega a un frasco con
distribuye en toda la célula mayormente en citoplasma en forma alcohol al 96 para que los ácidos nucleicos
soluble o en los ribosomas.
floculen y se puede llevar acabo la extracción de
Una hidrolisis acida remueve todas las bases puricas sin afectar estos, el alcohol se utiliza frio para que este no
las uniones fotodiester del esqueleto nucleotidico y se obtiene
se evapore.
ácidos nucleicos sin bases puricas.
i) Se recupera el DNA del sobrenadante y el
alcohol.
OBJETIVOS
j) El citrato de sodio disuelve el DNA para poder
Separar las bases nitrogenadas del RNA y DNA por manejar de mejor manera
cromatografía en capa fina a partir de hidrolizados de los
k) Se diluye la solución de citrato con DNA para
mismos identificándolas por la propiedad que tienen de
absorber la luz UV. poder leer en el espectofotometro.

DIAGRAMA DE AISLAMIENTO DE DNA DE ESPINACA O RESULTADOS

GUAYABA Tabla 1. Espectro de absorbancia del DNA de espinaca.

a) La espinaca se tritura con Tris/EDTA/NaCl. El Tris Longitud de Absorbancia Absorbancia


pH 8.5 mantiene el pH alcalino, el DNA se onda (nm) blanco problema
desnaturaliza a pH ligeramente alcalino, el EDTA 200 0.101 0.737
secuestra los cationes Mg y Ca provocando que la 205 0.064 1.823
membrana plasmática se desnaturalice y activa las 210 0.017 2.501
DNA asas, el NaCl rompe el equilibrio electrolítico 215 0.008 2.200
provocando una ruptura en la pared por osmosis, se 220 0.008 1.684
tritura para poder obtener un macerado y poder 225 0.011 1.343
separar de mejor manera los componentes.
230 0.009 1.112
b) Se adiciona 0.3 ml de amilasa para desnaturalizar el 235 0.008 0.990
almidón que contiene la estructura del vegetal, esto
240 0.008 0.974
se hace a temperatura ambiente ya que la amilasa al
245 0.006 1.056
ser una enzima puede funcionar bien a esa
temperatura y un aumento en la temperatura la podría 250 0.005 1.168
desnaturalizar. 255 0.005 1.243
c) Se agrega 10 ml de solución saturada de NaCl y 5 ml 260 0.004 1.250
de SDS, el NaCl rompe el equilibrio electrolítico 265 0.004 1.175
provocando una ruptura en la pared por osmosis y el 270 0.004 1.061
SDS es un detergente que va a solubilizar las 275 0.005 0.909
membranas y los aminoácidos. 280 0.006 0.751
d) Se filtra el homogenizado para separar los 285 0.005 0.605
compuestos más grandes como carbohidratos 290 0.005 0.465
295 0.005 0.357
algunas proteínas y restos de células.
300 0.006 0.279
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Figura 1: Grafica de longitud de onda contra absorbancia


de extracto de DNA de espinaca.

Cálculos:

PUREZA
A260/A280= 1.250/0.751=1.6644
2.00 -------- 100%
1.6644 ----- X
X= 83.22% de pureza de DNA de la espinaca Figura 3: cromatografía en capa fina de DNA y RNA pool en
CONCENTRACION DE DNA comparación con las bases
C= (A260/22500)(factor de dilución) nitrogenadas(RNApool,C,G,A,U,T,DNApool).
C= 1.250/22500 (10)= 5.55X10-4 g/ml=5.55mg/ml
Tabla 2: Resultados de la Cromatografía en capa fina de
RNA Y DNA pool.

Distancia Distancia Rf Rf bases


recorrida por el recorrida por la nitrogenadas
problema (cm) fase móvil (cm)
DNA POOL DNA
3.4 0.44 Citosina=0.44
3.9 0.50 Guanina=0.49
7.7
4.2 0.54 Adenina=0.55
5.4 0.70 Timina=0.71
RNA POOL RNA
3.4 0.44 Citosina=0.44
3.8 0.49 Guanina=0.49
4.3 0.55 Adenina=0.55
4.9 0.63 Uracilo=0.62

Figura 2: Nomograma para el cálculo de las


concentraciones de DNA y proteínas en un extracto de
ácidos nucleicos
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y 0.22mg/ml de proteínas que al multiplicarlo por nuestro factor de


dilución nos da para DNA 0.48mg/ml el cual es muy parecido al que
obtuvimos mediante la fórmula.

Para la identificación de bases puricas y pirimidicas de DNA


presente en las hojas de espinaca se realizó una cromatografía en
capa fina (Figura 3) donde nosotros ocupamos una muestra de
RNA y DNA denominado pool el cual solo es una mezcla de las
bases nitrogenadas en la solución por lo que al no encontrarse
unidas mediante enlaces fosfodiester en la cromatografía se
pudieron identificar de manera eficiente comparándolos con los Rf
de las bases nitrogenadas puras presentes en nuestra placa. Caso
contrario observado en otros equipos donde se usó un DNA y RNA
hidrolizado (Figura 4) donde el la parte de RNA hidrolizado ubicada
del lado derecho de la placa se observa que no hubo una hidrolisis
total o efectiva de esta muestra ya que solo se alcanzan a percibir
algunas manchas de manera individual y todo un complejo en la
parte inferior de la placa donde se podrían encontrar aun restos de
la cadena principal o de bases aun unidas mediante enlace
fosfodiester por lo que no correrían de manera individual en la
placa.

Las bases que observamos en el caso de DNA y RNA pool en la


Figura 4: cromatografía en capa fina de DNApool y cromatografía al revelarlas con luz UV ,fueron para DNA un
RNAhidrolizado en comparación con las bases parecido en el corrimiento con las manchas de Adenina Guanina
nitrogenadas (RNApool,C,G,A,U,T,DNApool). Citosina y Timina y en RNA con Adenina Guanina Citosina y
Uracilo, todo esto basándonos en los Rf de cada muestra y
DISCUSIONES comparándolos con nuestros testigos puros de cada base
nitrogenada (Tabla 2).
Se obtuvieron las absorbancias del extracto de DNA a diferentes
longitudes de onda (Tabla 1), el espectro de absorbencia del DNA CONCLUSIONES
puro tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de
260nm correspondiente a ácidos nucleicos y una longitud de onda Se aisló purifico e identifico el contenido de DNA presente en un
de 280 correspondiente para proteínas o enlaces peptídicos. En macerado de hojas de espinaca.
nuestra curva (Figura 1) es muy pequeña la elevación en 260 nm
Se comprobó la presencia de las bases nitrogenadas específicas
por lo que nuestro DNA o RNA no se encuentra cien por ciento
para RNA y DNA a partir de la propiedad que tienen estas para
puro, ya que se observan otras curvas en longitudes de onda
absorber la luz ultravioleta.
adyacentes a la de 260 nm especifica de DNA, estas longitudes de
onda podrían corresponder a proteínas presentes en la muestra ya El DNA tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de
que estas absorben la luz UV a longitudes de onda de entre 240 y 260 nm, las proteínas a 280nm y algunos fosfolípidos a 210nm.
280 nm, o bien a fosfolípidos ya que estos tiene la capacidad de
absorber la luz UV a longitudes de onda de 210 nm donde podemos El DNA presente en nuestra muestra no se encontraba 100% puro
observar que la elevación más pronunciada corresponde a la ya que tenía presencia de proteínas y algunos fosfolípidos
cercana a 210nm, por lo que podemos decir que nuestra muestra presentes en las células de la espinaca desde un principio.
se encuentra contaminada con alta cantidad de fosfolípidos.
BIBLIOGRAFÍA
Para comprobar que tan pura es nuestra muestra de DNA aislado
de hojas de espinaca se sacó el porcentaje de pureza como se 1. Lehninger Albert L. PRINCIPIOS BIOQUÍMICA. 2ª Edición.
muestra en el apartado de cálculos, dándonos un porcentaje de Ediciones Omega. (p.584).
pureza de 83.22%, lo que verifica que nuestra muestra aparte de 2. Garrido A. & Teijon J.M. (2006) FUNDAMENTOS DE
BIOQUÍMICA ESTRUCTURAL. 2ª Edición. Editorial Tébar
contener bases nitrogenadas puede contener proteínas e incluso
S.L. Madrid, España. (p.317)
fosfolípidos. También se determinó la concentración de DNA que
3. V. Melo & O. Cuamatzi. Bioquímica de los procesos
había presente en nuestra muestra el cual nos dio de 0.55mg/ml
metabólicos” Lípidos. Estructura y función biológica. (pp. 348-
usando la formula presente en el apartado de cálculos; aunque 350). Editorial Reverté. (2006) México.
también se utilizó el Nomograma (Figura 2)el cual no es un método 4. McKee T. y McKee J. R. “bioquímica” la base molecular de la
exacto porque depende mucho del trazo que se realice , pero es un vida. Ed. McGraw-Hill- Interamericana, pp. 76, (2003).
método mucho más rápido para sacar resultados aproximados, en 5. Ondarza R.N., “Biotecnologia Basica” Editorial Trillas pp 89-
este método obtuvimos una concentración de DNA de 0.048mg/ml 96 (2002)

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