LAPORAN MIKROBIOLOGI FARMASI

Disusun oleh :

Teori : 1-B

1. Rasyid Dananjaya (20144059A)

2. Siti Fatimah (20144071A)
3. Helmy Azuhri (20144072A)
4. Dinny Fitriani (20144076A)

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SETIA BUDI

SURAKARTA

2015
 PENGECATAN GRAM & TETES GANTUNG

II.Tujuan
Adapun tujuan yang ingin dicapai pada praktikum kali ini adalah untuk membedakan
bakteri gram positif dan bakteri gram negative , serta melihat aktivitas bakteri

III. DASAR TEORI

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu
basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah
bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur.
Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.

Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan
warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore
yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena
kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi
menjadi baik (Rudi, 2010).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan

kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya
praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. Habitat
endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan
nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin,
difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers
seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada
siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan
pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna
endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006).

Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah
dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri
gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
 Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negative (Manurung, 2010).
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Kandungan lipid rendah (1-
Komposisi dinding sel 4%) Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap
penisilin Lebih sensitif Lebih tahan
Penghambatan oleh
pewarna basa (VK) Lebih dihambat Kurang dihambat
Kebanyakan spesies relatif
Kebutuhan nutrisi kompleks Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres
situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan
panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein.
Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah
besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

IV.ALAT & BAHAN

A.ALAT:
- mikroskop
- jarum inoculum (ose)
- objek glass & deglass
- buncen burner
- korek api & spiritus

B.BAHAN
- biakan bakteri
- lugol’s iodine
- Safranin
- Crystal violet
- etanol 96%
- Minyak imersi

V. CARA KERJA

VI. HASIL PENGAMATAN

a.Pewarnaan sederhana (positif)

Objek Keterangan
1.Nama: Bacillus
2.Pengecatan: Diferensial (gram)
3.Bentuk: Batang (Basil)
4. Warna: ungu
5. Susunan: Berderet
6. Jenis: Gram positif (+)
1.Nama: Tetracoccus
2.Pengecatan: Diferensial (gram)
3.Bentuk: Bulat ( coccus)
4. Warna: Ungu
5. Susunan: 4 bulatan bergerombol
6.Jenis: gram positif (+)
 1.Nama: Streptococcus
2.Pengecatan: Diferensial (gram)
3.Bentuk: Bulat (coccus)
4. Warna: Ungu
5. Susunan: Bulat tidak beraturan

1.Nama: Providen
2.Pengecatan: diferensial (gram)
3.Bentuk: batang
4. Warna: merah
5. Susunan: Batang tidak beraturan dan
menyebar
6.Jenis: gram negative (-)

b.Tetets gantung

Objek Keterangan
1.Nama: Bacillus
2.Bentuk: Batang
3. Warna: putih hampir transparan
4.Motilitas: bergerak (+)

VII.PEMBAHASAN
 Laporan praktikum mikrobiologi kali ini adalah pewarnaan dan pengamatan morfologi
pada bakteri. Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang dikerjakan di
laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi
mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pewarnaan tertentu
(pewarnaan gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pewarnaan gram dibagi menjadi dua
hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta
safranin atau Kristal violet.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri
sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang
disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci
dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak
diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan
supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol.
Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri
murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu
banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat
diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan
bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses
fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri
tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi
adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (crystal violet)
sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 2 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan
bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna
dari crystal violet.
Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan lugols iodine. Gram B
merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh
bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna
tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan
menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat
warna crystal violet akan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit
untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna
oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
Alkohol ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke
dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek crystal violet dan safranin
pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap
mempertahankan warna ungu karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsi
untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori
sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan crystal violet .Perlakuan ini
dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan
pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.
Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanya dan diamkan
selama 2 menit. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri
positif karena persenyawaan kompleks crystal violet tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri
gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah
karena warna ungu yang dihasilkan oleh crystal violet telah luntur dengan lisisnya membran sel
sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai
pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan
kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat
ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai
spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara
diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Pemberian crystal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu.
Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian
alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
 gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna biru.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna ,
substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah
meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini
dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1994).
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi bakteri
jenis Bacillus sp. merupakan bakteri berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram
positif.

VIII. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat digunakan untuk membedakan
antara bakteri gram negatif dan gram positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi
dan klasifikasi bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram
negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna crystal violet sewaktu proses
pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warnacrystal violet sewaktu
prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis.
4. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diidentifikasi bahwa bakteri Bacillus sp. merupakan bakteri
berbentuk batang (basil), dan tergolong dalam bakteri gram positif .
5. Tetes gantung dapat menggambarkan aktivitas suatu bakteri

IX.DAFTAR PUSTAKA
1. Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali
2. Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
3. Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta.