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Misión del programa: “La formación de profesionales químicos que lideren el desarrollo, potencien la

investigación y apoyen el aprovechamiento de los recursos naturales del entorno mediante procesos científicos
y tecnológicos”.

UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA


FACULTAD DE CIENCIAS, Escuela de Ciencias Químicas

Laboratorio de Biotecnología
Compilador: Angélica María García T. PhD.

8. SEPARACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y GRADO DE PUREZA OBTENIDO EN EL ÁCIDO


RIBONUCLEICO-ARN

Material a traer por parte del estudiante: hígado de pollo congelado, gasa, bandas de caucho,
arena limpia (o lavada, 50 g), bisturí o tijeras quirúrgicas (preferiblemente quirúrgica para cortes
más finos), 5 toallas de papel absorbente, papel de aluminio, cinta de enmascarar, gotero (2),
guantes, tapabocas, jabón, toalla (2, una para uso personal y otra para el trabajo práctico).

INTRODUCCIÓN
Los ácidos nucleicos son polímeros de alto peso molecular, sus monómeros son nucleótidos que se
polimerizan al formar enlaces fosfodiéster 3'-5'. Los ácidos nucleicos presentes en las células son el
ácido Desoxirribonucleico (ADN) y el ácido Ribonucleico (ARN), los cuales desempeñan diferentes
funciones. El ADN es el “asiento” de la información genética. Del ARN existen tres tipos: RNA
mensajero (ARNm), que lleva la información del ADN a los ribosomas, ARN ribosomal (ARNr)que
forma junto con las proteínas a los ribosomas y el ARN de transferencia (ARNt), responsable de
trasladar a los aminoácidos del citoplasma a los ribosomas.
Al efectuar la aislación de los ácidos nucleicos, es necesario considerar que éstos presentan su
mayor estabilidad y solubilidad en soluciones salinas. Los enlaces fosfodiester y N-glucosídicos son
estables hasta temperaturas mayores que 100ºC. Durante el proceso de aislación de un tejido, es
importante eliminar las proteínas no solo porque impurifican los ácidos nucleicos, sino que para
eliminar las ribonucleasas y desoxirribonucleasas que los degradan. La separación de las proteínas
(especialmente las básicas con las que forman complejos), se facilita por la adición de detergentes
aniónicos y/o de sales concentradas (NaCl ó NaClO4 1-3 M). También es necesario eliminar los lípidos
mediante extracciones con solventes orgánicos. Los ácidos nucleicos se precipitan de sus soluciones
por adición de etanol.
Para comprobar que se aisló efectivamente ADN y/o ARN se recurre a la propiedad de las
bases nitrogenadas de absorber en la región de los 260 nm. Una manera de estimar la
contaminación de los ácidos nucleicos con proteínas es la relación A260 nm/A280 nm. Si esta razón es
igual a 2 se considera que la muestra tiene una pureza excelente; si esta razón se encuentra entre 2
y 1,6 se considera una contaminación aceptable con proteínas y si es menor que 1,6 se considera
una contaminación no aceptable.
Cuando se trata de aislar ARN, debe decidirse primero si se va a extraer ARN total o un tipo
especial de RNA (ARNm, ARNr, ARNt), de esta decisión dependerá la técnica a seguir. La extracción
de RNA total puede realizarse de dos formas diferentes, ya sea utilizando NaCl ó fenol. Para
reconocer la presencia de ARN se utiliza una reacción específica para la ribosa (pentosa) a través del
test de BIAL, donde la 2-desoxiribosa da negativo a este test.

CONSULTA PREVIA A LA PRÁCTICA


a. Dibuje la estructura del ARN. Explique los componentes básicos del ARN con su estructura.
b. Consulte el fundamento químico de cada uno de los procesos de separación necesarios para el
aislamiento de ARN.
c. Consulte el fundamento químico de las pruebas de Bial y Dische.
d. Dibuje el espectro de absorción del ARN.
e. Realice un diagrama de flujo de la práctica a realizar.
MATERIALES Y REACTIVOS
Materiales: vidrio de reloj, espátula, mortero con mango, 2 varillas de agitación, 2 pipetas de 5 mL,
pipeta de 2 mL, pipeta de 10 mL, pipeteador, probeta, 12 tubos de centrífuga, gradilla, 12 tubos de
ensayo, 2 vasos de precipitados de 100 mL, vaso de precipitados de 250 y 400 mL, vaso de
precipitados de 1 L, pinzas para tubos de ensayo, balanza, plancha de calentamiento,
espectrofotómetro.
Reactivos: NaCl al 0,9% y al 10%, solución de sacarosa y CaCl2 (sacarosa 0,25 M y CaCl2 0,003M en
400 mL y refrigerada), TCA al 20% y fría, acetona fría, acetona, éter etílico, etanol al 96%, buffer
citrato salino (citrato 0,015M y NaCl 0,15M pH 7.0), butanol, HCl 1N, KOH 1M, reactivo de Bial (1,5g
de Orcinol en 500 mL de HCl concentrado y agregar 20-30 gotas FeCl3 al 10%), Reactivo de Dische
(1,5g difenilamina en 300 mL ácido acético glacial y adicionar 7,5 mL H2SO4 concentrado-preparar
al momento de usar y mantener en oscuridad), hielo.

PROCEDIMIENTO

1. Aislamiento de los ácidos nucleicos.


1.1. Lavar el hígado con suero fisiológico (NaCl 0,9%) y secarlo con toallas absorbentes limpias.
Cortarlo en trocitos pequeños y pesar aproximadamente 5 g. Transfiera la muestra a un
mortero y adicione 0,5-0,8 g de arena lavada, homogenice y adicione dos volúmenes de
solución de sacarosa-CaCl2 refrigerada (sacarosa 0,25M y CaCl2 0,003M). Homogenice hasta
formar una pasta suave. Filtre el homogenizado a través de 3-4 capas de gasa. Las partículas
celulares se lavan con 5 mL de la solución Sacarosa-CaCl2 y se descartan. Centrifugue el
filtrado durante 10 minutos a 3500 rpm. El sobrenadante, constituye la fracción
citoplasmática y el residuo la fracción nuclear. Conserve únicamente la fracción citoplasmática
en donde se encuentra una mayor cantidad de ARN.
2. Aislamiento de ARN.
2.1. Traspasar la fracción citoplasmática a uno o más tubos de centrífuga. Adicione un volumen
igual de TCA al 20% frío. Agite muy suavemente y deje en reposo durante 10 minutos.
Posteriormente, centrifugue durante 5 minutos a 3500 rpm. Descarte el sobrenadante.
Agregar al residuo 3 mL de acetona fría y agite con una varilla de vidrio. Centrifugue durante
5 minutos a 3000 rpm. Elimine el sobrenadante y al residuo adicione 3 mL de una mezcla de
acetona: éter (1:1). Agite y centrifugue nuevamente bajo las mismas condiciones. Descarte el
sobrenadante. Al residuo, agregar 3 mL de éter, homogenizar suavemente, centrifugar y
eliminar el sobrenadante. Dejar secar al aire (bajo campana) el residuo final.
2.2. Traspasar el residuo seco a un tubo de ensayo y agregue 3 mL de NaCl al 10%. Marque la
altura alcanzada en el tubo. Tape el tubo con una bolita de vidrio y coloque en baño maría a
ebullición durante 30 minutos. Si hay pérdida de volumen por evaporación adicione agua
destilada hasta completar el volumen original. Deje enfriar y traspase la muestra a un tubo de
centrífuga. Centrifugue durante 5 minutos a 3500 rpm. Separe cuidadosamente y conserve el
sobrenadante en otro tubo de centrifuga. Adicione dos volúmenes de etanol al 96%
homogenice y deje en reposo durante 10 minutos en baño con hielo. Centrifugar y eliminar el
sobrenadante. Al residuo agregar 2 mL de éter. Agitar y centrifugar 5 minutos a 3500 rpm y
eliminar nuevamente el sobrenadante. Dejar evaporar el resto de éter al aire.
3. Caracterización del ARN.
3.1. Espectro de absorción del ARN. Disuelva la muestra de ARN en 5 mL de buffer citrato salino
(buffer Citrato 0,015 M y NaCl 0,15 M, rectifique que el pH sea de 7.0). Tomar 1 mL de la
muestra y hacer las respectivas diluciones para la lectura espectrofotométrica (el valor de
A260nm debe estar entre 0,5 y 1,0). Trazar el espectro de absorción entre los 220 y 320
nm. Determinar la razón A260/A280 y establezca el grado de pureza de la extracción.
3.2. Pureza del ARN. Determínela a partir de la relación A260nm/A280nm
3.3. Hidrólisis ácida. Tome 0,5 mL de la solución original de ARN (la que está en buffer citrato),
adicione 1 mL de HCl 1 N y 1 mL de TCA al 20%. Poner en baño maría en ebullición durante
20 minutos. Posteriormente, neutralice con KOH 1M y ajuste pH entre 5-6. A continuación,
realice las pruebas de Bial y Dische
3.4. Test de Bial. Tomar 0,5 mL de la solución de ARN y adicionar 1,5 mL del reactivo de Bial.
Calentar suavemente hasta que aparezcan las primeras burbujas. Adicione 4 mL de agua
destilada, homogenice y adicione ahora 1 mL de n-butanol. Si hay pentosa presente, aparece
una coloración azul-verdosa en la capa alcohólica. Analice los resultados obtenidos e incluya
la ecuación de la reacción química ocurrida.
3.5. Test de Dische. Tomar 1 mL de la solución de ARN y agregar 2 mL del reactivo de Dische.
Homogenice y coloque la muestra en baño maría en ebullición durante 10 minutos. Analice
los resultados obtenidos.

RESULTADOS
Analice y discuta los resultados obtenidos. Presente sus resultados de la forma más clara posible
apoyándose en el uso de tablas, gráficos, etc.

NO OLVIDE ENTREGAR COPIA DE LA HOJA DE RESULTADOS AL PROFESOR.

BIBLIOGRAFÍA

La presente práctica fue diseñada tomando como pauta base:

EDWARDS, A.M., GARCÍA, A.M., SOTO, M., FUENTEALBA, D. 2010. Prácticas de Laboratorio
de Bioquímica. Pontificia Universidad Católica de Chile, Facultad de Química, Programas de Química y
Química y Farmacia, Santiago de Chile, Chile.
HIDALGO, M.B., et al. 2002. Laboratorio de Bioquímica II. Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla, Facultad de Ciencias Químicas, Programa de Química Farmacobiólogo. Puebla, México.
MIGUEZ, J.B.1997. Prácticas de bioquímica. Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia,
Facultad de Ciencias, escuela de Química. Tunja, Colombia.

Textos de apoyo:

LEHNINGER, A., NELSON; D.; COX, M. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. Macmillan
Higher Education, 4a ed.
VOET, D., VOET, J. 2002. Biochemistry. Wiley & Sons. 2ª ed. Canada.
BOHINSKI, R.C. 1991. Bioquímica. Addison-Wesley-Longman, 5ª ed. México D.F. México.

Visión del programa: “El programa de química de la UPTC para el año 2019 se proyecta en el ámbito nacional como uno de los
líderes en la gestión y desarrollo de procesos de investigación, apropiación, adaptación e innovación de ciencia y tecnología en
química”.
UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA
PROGRAMA DE QUÍMICA
LABORATORIO BIOTECNOLOGÍA

HOJA DE RESULTADOS

8. SEPARACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y GRADO DE PUREZA OBTENIDO EN EL ÁCIDO


RIBONUCLEICO- ARN

Nombres:___________________________________________________________________
Sección/grupo: ________________

w. hígado de pollo (trozos): ________________

1. Espectro de absorción del ARN

A260nm A280nm Grado de pureza del


aislamiento de ARN

2. Pruebas de reconocimiento

Test Observaciones
Test de Bial

Test de Dische

3. Observaciones adicionales:

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