Uma nova xilanase termoestável e halotolerante de Colletotrichum graminicola

O uso de biocombustíveis tem atraído considerável atençãdo mundo nos últimos anos, e muito
esforço de pesquisa tem sido dedicado ao desenvolvimento de processos industriais para a
produção de etanol de 2ª geração (etanol 2G) a partir de resíduos [1,2]. Atualmente, os
principais desafios para o etanol 2G compreendem dar o salto tecnológico para uma produção
em larga escala com preços altamente competitivos em relação ao atual, e superando a
barreira da recalcitrância da biomassa lignocelulósica

A lignocelulose é composta principalmente de celulose, hemicelulose e lignina, dispostos em

uma matriz tridimensional complexa dentro dos quais os polissacarídeos são protegidos
contrae degradação biológica [4,5]. Xylan, a principal hemicelulose em resíduos agroindustriais
[5,6], é predominantemente composto por xilose resíduos. O esqueleto da xilose pode ser
substituído por arabinose, ácido glucurônico e / ou ácido metilglucurônico, que afetam alguns
importantes características físico-químicas do polímero como solubilidade, conformação e
reatividade. Embora os métodos químicos estejam disponíveis, a enzima A hidrólise da
biomassa lignocelulósica é mais ambientalmente alternativa amigável [3,9,10]. Além disso,
existe um consenso na comunidade científica que a produção de etanol 2G de forma eficiente
e a um preço competitivo depende da eficiência hidrólise de celulose e hemicelulose a
açúcares fermentáveis (pentoses e hexoses), e fermentação destes açúcares, bem como o uso
de lignina [2,10]

A hidrólise completa do xilano requer um sistema enzimático complexo atuando

sinergicamente na cadeia principal e ramos [11]. As principais enzimas envolvidas na hidrólise
são as endo -1,4-xilanase (-1,4-xilanxil-hidrolase, EC 3.2.1.8), que libera xiloligossacarídeos,
xilobiose e xilose dos principais cadeia [11,12], e a -d-xilosidase (-d-xilosido xil-hidrolase, EC
3.2.1.37), que hidrolisa xiloligossacarídeos e xilobiose a xilose [8,13]. Algumas enzimas
acessórias funcionam em ramos, contribuindo para a despolimerização completa da xilana
[8,13-15].

Diferentes etapas de pré-tratamento são usadas para reduzir a recalcitrância da biomassa

lignocelulósica, permitindo a ação de enzimas hidrolíticas nos polissacarídeos e aumentando a
eficiência da hidrólise. Para a produção de etanol 2G, algumas pré-tratamentos alcalinos e o
pré-tratamento com organossolv são interessantes, pois a lignina é removida com baixa perda
de celulose e hemicelulose [3,4]. No entanto, solventes residuais, assim como altas
concentrações e alguns subprodutos do pré-tratamento alcalino, como acetato, são potenciais
inibidores de etapas subsequentes [16,17]. Assim, as etapas de lavagem da biomassa pré-
tratada são necessárias, aumentando consideravelmente o consumo de água em etanol
industrial 2 g plantas [18].

Devido à preocupação global com a escassez de água potável a possibilidade de utilizar a água
do mar para as etapas de lavagem da biomassa pré-tratada e mesmo para a hidrólise
enzimática está atraindo considerável interesse [19]. No entanto, os sais na água do mar
podem também inibem a maioria das enzimas lignocelulolíticas, incluindo xilanases, gerando
um interesse crescente na identificação de enzimas tolerantes a altas concentrações de sais e
solventes orgânicos.
Na natureza, uma grande variedade de microorganismos é capaz de produzir xilanases,
incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos. [12,13,20]. No entanto, os fungos
filamentosos são conhecidos por produzir xilanases extracelulares em níveis mais elevados em
comparação com leveduras e bactérias, tornando-as atraentes para a produção dessas
enzimas em escala industrial [6,13]. O fungo filamentoso Colletotrichum Graminicola provou
ser um excelente produtor de um extracelular xilanase termoestável quando cultivada sob
fermentação em estado sólido (SSF) em meio de cultura composto por farelo de trigo, espiga
de milho moída e sulfato de amio [21]. O objetivo deste estudo foi a purificação e
caracterização de uma endo-xilanase de C. graminicola (Excg1), com ênfase na tolerância da
enzima purificada para concentrações elevadas de NaCl e solventes orgânicos.

2. Materiais e métodos

2.1. Manutenção de organismos e de tensão

A cepa Colletotrichum foi isolada e classificada como descrita por Zimbardi et al. [21] O fungo
foi mantido em meio de cultura Potato Dextrose Agar (PDA, Oxoid, UK), a 25 ◦C, e subcultivado
periodicamente.

2.2. Condições de cultura e preparação de extratos brutos

Colletotrichum graminicola foi cultivada sob condições de fermentação em estado sólido (SSF)
em frascos Erlenmeyer de 250 mL, conforme descrito por Zimbardi et al. [21] Seções (0,50
cm2) de micélio de 8-umidade inicial de 2,0 mL de água por g de farelo seco. Os frascos foram
incubados por 8 dias a 25 underC sob umidade constante de 70%, monitorados por um termo-
higrômetro MT-240 (Minipa, São Paulo, Brasil).

Após o crescimento, a cultura foi suspensa em 25 mL de água fria esuavemente com uma
vareta de vidro mantendo o frasco em um gelo banho. A suspensão resultante foi filtrada
através de uma peneira de nylon e centrifugado a 10.000 × g e 4 forC por 20 min. O
sobrenadante (extrato bruto rico em xilanase) foi mantido a 4 forC por até 30 dias sem perda
substancial de atividade.

2.3. Ensaios enzimáticos

Salvo indicação em contrário, a atividade da xilanase foi avaliada a 65 inC em tampão

McIlvaine [22], pH 5,5, contendo 1% (p / v) xilana de faia (Sigma-Aldrich Chem. Co., St. Louis,
MO, EUA), num volume final de 0,6 mL. A hidrólise do xilano de madeira de vidoeiro (Sigma-
Aldrich Chem.), Carboximetilcelulose (CMC, SigmaAldrich Chem. Co.) e celulose microcristalina
(Avicel® Fluka Chemical Co., Seelze, Alemanha), a 1% (p / v) de concentração final, foi ensaiado
como acima. Os açúcares redutores liberados foram quantificados pelo método do ácido
dinitrossalicílico (DNS) [23]. A atividade em xilana de madeira de faia também foi determinada
em água do mar. O ensaio condições foram as mesmas descritas acima, mas todos os
reagentes foram preparado na água do mar (32 ‰ salinidade) da Baía de Ubatuba (23◦30? S,
45◦ 08? W), Estado de São Paulo, Brasil.

A atividade da -xilosidase foi determinada sob o mesmo condições usando p-nitrofenil-d-

xilopiranósido (pNP-Xyl) (Sigma-Aldrich Chem. Co.) como substrato, a 2,0 mmol L-1 final
concentração. As reações, iniciadas pela adição do enzima numa diluição conveniente, foram
interrompidos após intervalos de tempo convenientes pela adição de 1,0 mL solução de
tetraborato de sódio. As taxas de hidrólise foram determinadas pela quantificação da liberação
do íon p-nitrofenolato (410nm, pH12 = 17.500 mol-1 L cm-1), como descrito por Souza et al.
[24]

Controles com enzima inativada pelo calor foram incluídos em todos ensaios enzimáticos para
quantificar a hidrólise não enzimática do substratos. As condições experimentais (tempos de
reação, enzimas unidades) empregadas foram ajustadas para garantir a estimação das
velocidades iniciais (resposta linear da formação do tempo de reação). Uma unidade de
enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de produto por min. O
específico a atividade foi definida como unidades por miligrama de proteína total (U mg − 1).

Todos os ensaios enzimáticos foram realizados em duplicata culturas de um dia em meio PDA
foram inoculadas em sólido estéril meio composto de 5,0 g de farelo de trigo suplementado
com 0,9% (m / m) sabugo de milho moído e 0,1% (p / p) de sulfato de amônio,

Todos os ensaios enzimáticos foram realizados em duplicado.

2.4. Purificação do Excg1

O extrato bruto rico em xilanase foi ajustado para 1,0 mol L-1 NaCl e aplicado numa coluna
Phenyl Sepharose CL-4 B (10,0 × 1,0 cm) equilibrada e eluída com 10,0 mmol L-1 de tampão de
acetato de sódio, pH 5,0 contendo 1,0 mol L-1 de NaCl (tampão A). A coluna foi lavado com
tampão A até proteína (A280nm) e / ou xilanase atividade não foram mais detectados no
eluato. O mais ativo fracções (1,0 mL cada) foram reunidas e concentradas num concentrador
de vácuo (Concentrator Plus / Vacufuge® mais Eppendorf Nova Iorque, EUA).

A amostra concentrada foi dessalinizada usando um Coluna Sephadex G-25 (35,0 × 2,0 cm)
equilibrada com 10,0 mmol L-1 de tampão Tris, pH 9,0 (tampão B). Frações mostrando
atividade da xilanase foram agrupadas e aplicadas em um DEAE-Fractogel coluna (10,0 × 2,0
cm) equilibrada e eluída com tampão B. A a coluna foi lavada com tampão B até a proteína e /
ou xilanase atividade não foram mais detectados no eluato, e os mais ativos fracções (1,0 mL
cada) foram reunidas, aliquotadas e armazenadas a 4 ° C.

Este procedimento de purificação foi repetido 5 vezes usando cinco extratos brutos ricos em
xilanase de C. graminicola, resultando em cinco diferentes preparações da enzima pura
(Excg1).

2.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida e focagem isoeléctrica

A eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (PAGE) foi realizada de acordo com
o método de Reisfeld et al. [25] em géis de acrilamida a 7%. Dodecil sulfato de sódio (SDS) -
PAGE foi realizado em géis de 10% de acrilamida como descrito por Laemmli [26]. O bandas de
proteínas foram reveladas com nitrato de prata [27].

Focalização isoelétrica (IEF) da Excg1 foi realizada a 500V por 5 h em géis de bastão de
acrilamida a 6% (0,6 × 13 cm) contendo transportador a 5% (v / v) anfito (Pharmalyte, Sigma-
Aldrich Chem. Co.), pH 8,0-10,0, de acordo com Venturi et al. [28] As bandas de proteínas
foram reveladas com Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma- Aldrich Chem. Co.).

2.6. Determinação de carboidratos neutros e proteína

Os carboidratos neutros totais de Excg1 foram determinados de acordo com o procedimento

descrito por Dubois et al. [29], usando glicose como padrão. As concentrações de proteína
foram estimadas pelo método de Read e Northcote [30], utilizando albumina de soro bovino
(BSA, SigmaAldrich Chem. Co.) como padrão.

2.7. Estimativa da massa molecular aparente do produto purificado enzima A massa molecular
aparente do Excg1 foi estimada por SDS-PAGE tal como descrito acima, utilizando um
marcador de massa molecular de proteína previamente conservada (6-204 kDa) (Bio-Rad,
Laboratories, Hercules, CA, EUA).

A massa molecular nativa aparente do Excg1 foi estimada por filtração em gel de
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), usando um columm Bio-Sil SEC 400 (Bio-Rad)
de acordo com Souza et al. [24] Os marcadores moleculares de massa utilizados foram? -
Globulina bovina (158 kDa, Bio-Rad), BSA (67 kDa, Sigma-Aldrich Chem. Co.), ovalbumina (44
kDa, Bio-Rad) e mioglobina equina (17 kDa, Bio-Rad)

2.8. Caracterização do Excg1 purificado por espectrometria de massa análise Excg1 foi
submetido à digestão com tripsina seguida de Análise de EM conforme descrito por Souza et
al. [24]

A análise foi realizada utilizando uma espectrometria de dessorção a laser / ionização-tempo-

de-voo / tempo-de-voo da matriz Axima Performance (Shimadzu-Kratos, Shimadzu Corp.,
Kyoto, Japão). O perfil de massa dos peptídeos trípticos (MS fingerprint) foi obtida e as
seqüências desses peptídeos foram deduzidos com base no padrão de fragmentação dos íons
b- e y de alguns peptídeos selecionados em experimentos de dissociação induzida por colisão
de alta energia (CID-MS / MS).

Os espectros CID foram diretamente submetido a análise comparativa com o banco de dados
NCBInr (banco de dados não redundante no Centro Nacional de Informações sobre
Biotecnologia, EUA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando o Algoritmo MASCOT
(http://matrixscience.com). Comparação do peptídeos seqüenciados com o banco de dados
contendo o genoma de C. graminicola foi realizada utilizando a ferramenta Blastp disponível
no Plataforma NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

2.9. Efeito do pH na atividade e estabilidade do Excg1

O pH ótimo para a atividade de xilanase foi determinado a 65 ◦C em tampão McIlvaine

ajustado para pH 3,0-8,0 contendo 1% (p / v) xilana de madeira de faia, na ausência ou na
presença de NaCl em Concentrações de 0,5 e 2,5 mol L − 1.

A estabilidade do pH foi avaliada incubando Excg1 por 24 h a 4 inC em tampão McIlvaine

ajustado para pH 2,0–8,0, ou tampão de glicilglicina ajustado para pH 8,5–10,0, na ausência na
presença de NaCl nas concentrações finais de 0,5 e 2,5 mol L − 1. As atividades residuais foram
estimadas conforme descrito o item 3.3.

2,10. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade do Excg1

A temperatura ótima para a atividade da xilanase foi determinada na faixa de 50 a 85 ,C, na

ausência e no presença de NaCl nas concentrações de 0,5 ou 2,5 mol L − 1. O meio reaccional
consistiu em tamp de McIlvaine contendo 1% (p / v) xilana de faia. O tampão foi ajustado para
pH 5,5 na ausência de sal e na presença de 0,5 mol L − 1 de NaCl, e para pH 6,0 na presença de
2,5 mol L − 1 de NaCl. A estabilidade térmica foi avaliada por incubando Excg1 em Millipore
MilliQ (EMD Millipore Co., Billerica, MA, EUA) água apirogênica ultrapura por diferentes
intervalos de tempo temperaturas variando de 50 a 65 ◦C, na ausência e no presença de NaCl
nas concentrações finais de 0,5 e 2,5 mol L − 1.

Depois de resfriamento em banho de gelo por 1 min, as atividades residuais foram

determinadas a 65 ◦C conforme descrito no item 3.3. O mesmo procedimento foi empregado
para avaliar a estabilidade térmica da enzima em 50 ◦C em água contendo xilano de madeira
de faia a 1% (p / v), na ausência e na presença de 0,5 e 2,5 mol L − 1 de NaCl.

A estabilidade à halo à temperatura ambiente foi examinada incubando Excg1 a 25 forC por 48
h em água ou soluções de NaCl no final. concentrações na faixa de 0,5 mol L − 1 a 3,0 mol L − 1.
O residual As atividades foram determinadas conforme descrito no item 3.3.

2.11. Determinação dos parâmetros cinéticos (Km) para a hidrólise de xilano de faia por Excg1
na presença e ausência de NaCl foram calculados utilizando o programa SigrafW, que ajusta os
dados experimentais à equação de Hill por regressão não linear [31]. Três repetições do
procedimento de purificação (item 3.4) foram realizadas, a partir de três extratos brutos ricos
em xilanase, resultando em três preparações separadas de Excg1 pura. As experiências
cinéticas foram repetidas 3 vezes usando cada preparação pura de Excg1, e cada ensaio
enzimático foi realizado em duplicado. Os parâmetros cinéticos são apresentados como média
± dp dos valores calculados para as três repetições (n = 3). 2.12.

Effect of ions, organic solvents and sodium acetate on the enzymatic activity

The effect of various salts (Pb(NO3)2, CuSO4, HgCl2, AlCl3, NiCl2, ZnCl2, MnCl2, MgCl2, CoCl2,
CaCl2, Cr(NO3)3, KCl, NaCl, SrCl2, FeCl3 and AgNO3), ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA,
SigmaAldrich Chem. Co.) and -mercaptoethanol (Sigma-Aldrich Chem. Co.) on the activity of
Excg1 against beechwood xylan was determined as described in the item 3.3. The different
effectors were added to the reaction medium at final concentrations of 1.0 and 10.0 mmol
L−1.

The effect of different organic solvents (ethanol, methanol, buthanol, propanol, glycerol,
toluene and acetone) and sodium acetate on the activity of Excg1 was also assessed under the
conditions described above, exceptthatthe experiments were conducted at 50 ◦C, in
hermetically closed tubes. The different solvents were added to the reaction medium to a final
concentration of 5% (v/v); sodium acetate was added at final concentrations of 50 and 200
mmol L
2,13. Análise por cromatografia em camada delgada (TLC) da reaçãoprodutos da hidrólise de
ilano de faia por Excg1

Os ensaios enzimáticos foram realizados a 50 andC e 180 rpm tubos plásticos cônicos
hermeticamente fechados. As condições da reação foram tampão McIlvaine, pH 5,5, contendo
1% (p / v) de madeira de faia xilana e 5 U de Excg1 em um volume final de 1,0 mL, na ausência
e na presença de 0,5 mol L-1 NaCl ou em água do mar natural (32 ‰ salinidade). Após
intervalos de tempo adequados, as reações foram interrompido pela adição de 1,0 mL de
tricloroacético a 20% (p / v) ácido para precipitar proteínas e carboidratos de cadeia longa.

Depois de permanecendo à temperatura ambiente por 30 min, as misturas foram cen os

sobrenadantes (5 µL) foram analisados por TLC em gel de sílica G-60 placas (10 × 20 cm, DC-
Alufolien Kieselgel 60, Merck, Darmstadt, Alemanha). Uma alíquota de 2 μL de uma mistura
contendo xilose (X1), xilobiose (X2), xilotriose (X3), xilotraose (X4), xilopentose (X5) e
xilohexose (X6) (Sigma-Aldrich Chem. Co) a 1% final concentração foi empregada como padrão.

A fase móvel foi composto por acetato de etilo / ácido acético / ácido fórmico / Millipore
MilliQ água (9: 3: 1: 4; v / v / v / v). Após duas execuções, os produtos foram detectados
pulverizando as placas com 0,4% (p / v) de orcinol em ácido sulfúrico / etil álcool (1: 9 v / v)
seguido de aquecimento a 150 ◦C até o aparecimento de manchas.

2,12. Caracterização dos produtos de hidrólise por massa espectrometria

A hidrólise do xilano de madeira de faia foi realizada como descrito no item 3.13, exceto que o
buffer foi de 10 mmol L-1 de amônio tampão acetato, pH 5,5. Além disso, o tempo de reação
foi de 48 horas e as reações foram interrompidas pelo aquecimento da água durante 5 min,
seguido por centrifugação durante 10 min a 10.000xg. Os produtos de hidrólise foram
analisados por espectrometria de massa de inserção direta (MS-ID) em um Xevo® Instrumento
TQ-S (Waters Corporation, Milford, MS, EUA) com uma fonte de ionização por
electropulverização operada em modo positivo. Alíquotas de 5 µL das amostras de reação
foram introduzidas no espectrômetro de massa por inserção direta em um fluxo de 0,1% ácido
fórmico e acetonitrilo / ácido fórmico a 0,1% (v / v) regulado a um caudal de 0,1 mL min − 1. As
condições da interface ESI foram as seguintes: tensão capilar 3.2 kV, tensão cone 40V, de MS /
MS foram realizadas por CID usando gás argônio como a colisão gás para os íons precursores
de interesse. A energia de colisão acabou o intervalo de 10 e 50 eV. Aquisição e
processamento de dados foram realizado usando o MassLynx V4.1 (Waters Corporation).

3 Resultados e discussão

3.1. Purificação de enzimas e propriedades moleculares

Excg1 foi purificado por um método simples de duas etapas de cromatografia em coluna de
fenil-Sepharose e DEAE-Fractogel (Tabela 1). A enzima foi purificada 5,0 vezes, com um
rendimento de cerca de 34%, atingindo uma atividade específica de 276,0 U mg − 1. A
atividade de A Excg1 purificada permaneceu inalterada durante pelo menos 6 meses foi
mantida em tampão Tris 10 mmol L – 1, pH 9,0, a 4 ◦C.
Uma única banda de proteína foi revelada quando a xilanase purificada foi submetido a PAGE
(Fig. 1A) ou SDS-PAGE (Fig. 1B), indicando a homogeneidade da preparação. O molecular
aparente A massa de Excg1 estimada por filtração em gel foi de 17,3 ± 1,9 kDa, em boa
concordância com o estimado por SDS-PAGE (20,0 ± 2,4 kDa, Fig. 1B), sugerindo que a enzima
nativa era um monómero.

Xilanases mais conhecidas de fungos endofíticos mesófilos são monomérica, com pesos
moleculares na faixa de 8 a 45 kDa [11,13,32–40]. Uma única banda de proteína também foi
revelada após o IEF em uma faixa estreita de pH (8,0 a 10,0), com um pI estimado de 9,20 ±
0,02 (Fig. 1C).

Excg1 foi fortemente glicosilado, com um teor estimado de carboidratos de 97 ± 3,7% (p / p).
Assim, a focalização relativamente fraca da enzima após o IEF pode ser devido à glicosilação
diferencial [41,42], embora a faixa estreita de pH combinada com um gel consideravelmente
longo possa ter contribuído para uma faixa mais larga. Muitos dos xilanases conhecidas de
fungos endofíticos mesófilos são glicoproteínas, incluindo algumas com um conteúdo de
carboidratos acima de 60% (p / p)

A Excg1 foi submetida a hidrólise tríptica e caracterizada por espectrometria de massa. Três
peptídeos foram detectados no espectro MALDI-TOF / TOF-MS, e seus respectivos íons
precursores e as sequencias de aminoácidos foram: m / z 1,762.8 (LYINDYNLDSATYAK); m / z
2.157,0 (IYAWDVVNEIFNEDGSMR) e m / z 2.265,1 (GHTTVWHSQLPSWVSSITDK). Uma pesquisa
o banco de dados revelou que esses peptídeos compartilhou 77,4% de similaridade de
seqüência e cobriu cerca de 12,4% uma família GH10 glicosil-hidrolase de C. graminicola
M1.001: GLRG 08914.1 (Sequencia de Referencia NCBI: XP 008097790.1). Além disso, cerca de
60% das substituições encontradas nos peptídeos foram conservador. Tomados em conjunto,
estes dados sugerem que o Excg1 pode ser categorizado na família GH10. Embora a maioria
das xilanases esta família apresenta massas moleculares acima de 30 kDa [43] exceções a esse
padrão geral foram relatadas [44].

3.2. Efeito do aumento das concentrações de NaCl na atividade e estabilidade do Excg1 a 25 ◦C

A atividade de xilanase de Excg1 diminuiu gradualmente como o sal concentração no meio de

reação aumentou (Fig. 2), alcançando cerca de 50% da atividade de controle (ausência de sal)
na presença de NaCl 3,0 mol L-1. No entanto, a 0,5 mol L − 1 NaCl, uma concentração próxima
da encontrada na água do mar (0,46 mol L − 1) [19], cerca de 85% da atividade de controle foi
mantida. Da mesma forma, atividade de xilanase determinada em água do mar natural (32 ‰
salinidade) correspondia a cerca de 85% da atividade de controle. O enzimático atividade
permaneceu quase constante após 48 h de incubação do Excg1 25 ◦C na presença de NaCl na
faixa de 0 a 3,0 mol L − 1 (fig. 2).

Em conjunto, esses resultados caracterizaram o Excg1 como um halotolerante enzima.

Até onde sabemos, este é o primeiro relatório sobre um fungo xilanase halotolerante. No
entanto, esta característica interessante tem sido investigado em xilanases bacterianas. Os
resultados observados para o Excg1 foram muito semelhantes aos descritos para as xilanases
halotolerantesde Planococcus sp. [45] e a glaciecola mesophila KMM241 [46], que
mantiveram, respectivamente, cerca de 60% e 50% do controle atividade na presença de 3,0
mol L-1 de NaCl, e cerca de 85-90% em 0,5 molL-1 de NaCl. Em contraste, uma xilanase de
Bacillus sp. SN5 retiveram 75% da atividade de controle a 3,0 mol L-1 de NaCl, apresentando
uma estimulação de cerca de 25% em 0,5 mol L-1 NaCl [47]. Da mesma forma como observado
para Excg1, as xilanases de Bacillus haludorans [20,48] apresentaram boa estabilidade na
presença de sal em um faixa de concentração, a 25 ◦C.

As enzimas mais conhecidas são severamente inibidas ou inativadas a presença de sais em

altas concentrações. Aparentemente, isso é essencialmente devido ao sequestro de moléculas
de água pelo íons, limitando as moléculas de água livre disponíveis para a enzima hidratação.
Além disso, os íons desestabilizam as cascas de hidratação cercar as regiões hidrofóbicas da
superfície da proteína e perturbar as interações eletrostáticas entre grupos carregados
adjacentes.

Como conseqüência, a estrutura e a função das enzimas são drasticamente afetados, assim
como a solubilidade e estabilidade [18,49]. Caso contrário, as enzimas halotolerantes
competem com os íons pelo moléculas de água, preservando a estrutura e atividade. Pelo
visto, isso está relacionado a um maior conteúdo de resíduos de aminoácidos carregados e um
menor conteúdo de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais hidrofóbicas volumosas na
superfície da proteína, permitindo a hidratação do molécula [49].

A halotolerância é uma característica muito interessante para uma possível aplicação de Excg1
em processos de sacarificação de biomassa lignocelulósica usando água do mar para substituir
água doce, ou em que a biomassa pré-tratada tem altas concentrações de sais. 3.3. Efeito do
pH e temperatura na atividade xilanásica de Excg1

Na ausência de sal, a Excg1 apresentou um patamar máximo atividade de pH 4,5-6,0 (Fig. 3A).
Um perfil de atividade de pH mais nítido foi observado na presença de 0,5 mol L − 1 de NaCl,
com atividade em pH 5,5 e uma diminuição acentuada no pH mais ácido, atingindo cerca de
75% e 20% da atividade máxima em pH 4,5 e 4,0, respectivamente. Acima de pH 5,5, no
entanto, a diminuição do atividade foi semelhante na presença e na ausência de sal. perfil
diferente foi observado na presença de NaCl 2,5 mol L -1.

O pH ótimo foi 6,0, e abaixo desse valor a atividade foi diminuiu, atingindo 55% e 6% do
máximo em pH 5,0 e 4,5, respectivamente. Acima do pH ótimo, entretanto, a xilanase
atividade diminuiu gradualmente para atingir 45% do máximo em pH 8,0

Os diferentes perfis de atividade de pH observados para o Excg1 na presença de NaCl podem

ser tentativamente atribuídos a mudanças no pKa valores dos grupos carboxilo dos resíduos de
glutamato catalítico, conservada em todas as xilanases das famílias GH10 e GH11 [6,11].

O pKa alterado possivelmente reflete mudanças no microambiente dos resíduos catalíticos em

resposta a mudanças conformacionais nas moléculas de enzima associadas à presença de íons
elevados concentrações.

O pH ideal das xilanases de fungos mesofílicos é geralmente na faixa de 4,0 a 6,5 [13,32-38,40].
Em contraste, os mais conhecidos xilanases halotolerantes bacterianas apresentam pH ótimo
na faixa alcalina (7,0–12,0). No entanto, algumas enzimas descritas recentemente apresentou
pH ótimo próximo ao estimado para Excg1, como as xilanases de Massilia sp. RBM26 [50],
Bacillus subtilis [51] e Bacillus sp. [52]. O pH óptimo de cerca de 5,0 determinado para Excg1
na presença de 0,5 mol L − 1 NaCl é uma característica muito interessante para uma possível
inclusão em coquetéis enzimáticos para a sacarificação de biomassa usando a água do mar.

Em ambas as concentrações de sal testadas, os perfis de temperatura-atividade foram

similares àqueles observados na ausência de sal, com um aumento gradual da actividade
acima de 50 ,C, atingindo um máximo a 65 andC e diminuindo acima de 70 ◦C (Fig. 3B). Além
disso, o sal pouco efeito sobre a atividade da Excg1 a 50 ◦C, o que correspondeu cerca de 60-
70% do máximo.

As temperaturas ótimas das xilanases de plantas mesofílicas os fungos geralmente estão na

faixa de 40 a 65◦C [13,32–40]. Em contraste, algumas xilanases halotolerantes bacterianas
mostram temperaturas ótimas elevadas (60-70 ◦C), conforme determinado para Excg1
[20,45,48,51-53].

Entretanto, algumas enzimas halotolerantes com atividade máxima no faixa 35-45 haveC
também foram descritas [46,47,50].

3.4. Efeitos da temperatura e pH na estabilidade do Excg1

Excg1 era totalmente estável a 50 andC e 55 ◦C por 120 min em água e semi-vidas de cerca de
90,0 ± 6,3 e 25,0 ± 1,7 min foram determinadas em 60 ◦Cand65 ◦C, respectivamente (Fig. 4A)
.A maioria das xilanases de fungos endofíticos mesófilos são estáveis na faixa de 35-55 ◦C [32-
37], com poucas exceções mostrando boa estabilidade em temperaturas de até 65 ◦C [38-40].

Assim, o Excg1 está entre os mais xilanases termoestáveis produzidas pelos microrganismos
deste grupo. O uso de enzimas termoestáveis em processos industriais tem um número de
vantagens bem conhecidas, contribuindo para a sua viabilidade econômica [54-56].
Concentrações salinas elevadas aumentaram ainda mais a estabilidade térmica do Excg1at 50
◦C. Na presença de 2,5 mol L − 1 de NaCl, um resíduo

A atividade de 75% foi determinada após 48 h, muito maior do que observada na ausência de a
a 0,5 mol L − 1 de concentração (46%) (Fig. 4B). Além disso, o Excg1 foi totalmente estável a 50
forC por 48 h na presença de xilano de madeira de faia a 1% quer na ausência ou na presença
de NaCl nas duas concentrações testadas (dados não apresentados), sugerindo que o substrato
tem um efeito protetor mais forte na atividade da enzima, em comparação com o sal.

Similarmente como observado para Excg1, uma xilanase de Zunongwangia profunda exibiu
maior estabilidade térmica no presença de altas concentrações salinas [57].

Embora o aumento da estabilidade térmica de uma enzima na presença de sal seja desejável
para uma aplicação biotecnológica, os mecanismos físico-químicos subjacentes a este efeito
não são bem entendido.Aparentemente, a estabilização de conformações proteicas por
redução da repulsão entre grupos carregados e / ou aumento de interações hidrofóbicas
podem estar envolvidos [58]
Na ausência de sal, o Excg1 era totalmente estável em uma ampla faixa de pH, de 3,0 a 10,0
(Fig. 4C). A presença de NaCl exerceu menor efeito sobre a estabilidade da enzima na faixa de
pH 4,0–10,0, mas foi severamente prejudicada em pH 3,0 e 3,5 em ambas as concentrações de
sal testadas, com atividades residuais de cerca de 54-64% em pH 3,5 e 5-20% a pH 3,0. Há
ampla evidência de que o pKa de ionizável cadeias laterais de resíduos de aminoácidos na
superfície da proteína são modificada por altas concentrações de sal, favorecendo as formas
neutras[59]. A menor estabilidade de Excg1 a pH 3,0 e 3,5 pode então ser tentativamente
atribuída ao aumento de pKa das cadeias laterais de resíduos de ácido, interrompendo
interações estruturalmente relevantes. Ao contrário de resultados mais conhecidos xilanases
halotolerantes bacterianas são estáveis em um faixa estreita de pH, mais freqüentemente na
região alcalina [20,47,48,53].

3.5. Especificidade do substrato do Excg1

Os melhores substratos para o Excg1 foram xilano de madeira de faia e xilano de madeira de
vidoeiro (Tabela 2). Além disso, a enzima hidrolisou a substrato pNP-Xyl com baixa atividade.
Em contraste, foi incapaz de hidrolise CMC e Avicel®, indicando alta especificidade para o -
configuração anomérica da ligação glicosídica de resíduos de xilose. [34,60,61]. Estes
resultados sugerem que o Excg1 é uma endo-xilanase

Propriedades semelhantes foram descritas para outras xilanases fúngicas 34,60,61]. Estes
resultados sugerem que o Excg1 é uma endo-xilanase livre de atividade de celulase.

3.6. Parâmetros cinéticos

Na ausência de sal a hidrólise da xilana de madeira de faia por Excg1 ocorreu com Vmax de
481,3 ± 34,0 U mg − 1 e Km de 3,7 ± 0,3 mg mL − 1, resultando em uma eficiência catalítica
(kcat / Km) de 36,9 ± 1,5 mL s-1 mg − 1 (Tabela 3). Parâmetros semelhantes foramdeterminado
na presença de 0,5 mol L − 1 de NaCl, mas a uma concentração de sal de 2,5 mol L − 1, o Vmax
o foi cerca de 50% maior. Como conseqüência, uma redução de cerca de 56% na eficiência
catalítica para a hidrólise de xilano de madeira de faia ocorreu na maior concentração de sal.

Poucos autores realizaram a caracterização cinética do hidrólise de xilano de madeira de faia

por xilanases halotolerantes. No ausência de sal, as enzimas de Massilia sp. [50] e Bacillus sp.

[52] mostraram afinidades aparentes para o substrato cerca de 2,6- e 1,6- dobrar mais baixo,
respectivamente, em comparação com Excg1. Além disso, o a hidrólise ocorreu com Vmax
menor, resultando em eficiências catalíticas de 7 e 3,2 vezes menor, respectivamente. Em
contraste, embora Vmax foram determinados para a hidrólise do xilano pelas xilanases de
Planococcus sp. [45], G. mesophilaKMM241 [46] e Bacillus sp. [47], as eficiências catalíticas
foram superiores às determinadas para Excg1.

As diferenças marcantes observadas nos parâmetros cinéticos determinado para hidrólise de

xilano por Excg1 na presença de 2,5 mol L − 1 NaCl, em comparação com aqueles obtidos na
ausência de sal, pode ser atribuída a mudanças conformacionais na enzima

molécula que pode dificultar as interações enzima-substrato e o posicionamento adequado

dos grupos catalíticos, resultando em afinidade aparente diminuída e Vmax. Até à data, um
único similar estudo comparou os parâmetros cinéticos para a hidrólise de xilana de madeira
de faia pela xilanase halofílica da Z. profunda em o na ausência e na presença de sal. Em
contraste com o nosso resultados, aumentos de cerca de 2,6 e 4,4 vezes foram observados no
valores de Km e kcat, respectivamente, na presença de NaCl 3 mol L -1 [57]

3.7. Análise dos produtos de hidrólise de xilano

O modo de ação de Excg1 em xilano de madeira de faia foi investigado através da análise dos
produtos de reação por TLC (Fig. 5A).

Antes de 30 min de reação, apenas os xiloligossacarídeos de alto peso molecular (grau de

polimerização (DP)> 5) foram produzidos mostrando). Após 30 min, os principais produtos
foram X2, X3, X4, vestígios de X5 e X6, e duas espécies próximas a X3 e X4 que possivelmente
correspondiam às formas ramificadas de X3 (X3R) e X4 (X4R). Depois de 1 h, foram observadas
manchas correspondentes a X2, X3, X3R e X4R, mas depois de tempos mais longos (3–15 h) X3
e X4R, mas não X3R, foram gradualmente hidrolisados, com acúmulo de X2 e liberação de
menor quantidades de X1. Finalmente, após 48 h, os únicos produtos foram X2, X3R e vestígios
de X1. Os perfis de hidrólise obtidos das reações realizada na presença de 0,5 mol L − 1 de NaCl
(Fig. 5B) e em 32 ‰ salinidade natural da água do mar (não mostrado) eram obtido na
ausência de sal, reafirmando o potencial deaplicação do Excg1 em processos biotecnológicos
realizados em salinidades elevadas.

A análise de MS-ID (Fig. 6A) da mistura reaccional de 48 h confirmou a presença de três picos
principais de m / z 168, 305, 627, consistente com os adutos [X1 + NH4] +, [X2 + Na] + e X3 com
uma ramificação do ácido 4-O-metil-d-glucurônico [X3-4-O-Me-GlcA + Na] +. Experimentos
CID-MS / MS indicaram ainda que [X2 + Na] + compreendeu duas pentoses (Fig. 6B) enquanto
[X3-4-O-Me-GlcA + Na] + compreendia três pentoses e um ácido 4-Omethyl-d-glucurónico (Fig.
6C). Estes resultados sugerem que Excg1 é uma endo-xilanase que não é capaz de hidrolisar as
ligações glicosídicas da cadeia principal perto de um ponto de ramificação, como descrito para
outras endo-xilanases [62-64]. Além disso, os principais produtos finais formados reforçam a
categorização de Excg1 como uma xilanase de a família GH10, de acordo com a classificação
proposta por [65].

3.8. Efeito de íons e outros efetores na atividade xilanásica de Excg1

A atividade do Excg1 foi insensível à presença de Pb2 +, Ni2 +, Zn2 +, Mn2 +, Mg2 +, Co2 +, Ca2
+, K +, Na + e Sr2 +, nas duas concentrações testadas (Tabela 4). Em contraste, Cu2 +, Al3 +, Cr3
+, Fe3 + e Ag + exerceu pouco efeito sobre a atividade na menor concentração, mas teve um
forte efeito inibitório (47-97%) na concentração de 10 mmol L-1. Excg1 foi menos sensível à
presença de Mn2 +, Co2 +, Zn2 +, Ni2 + e Ag + do que outras xilanases halotolerantes [45-
48,50].

Em contraste, a enzima mostrou maior sensibilidade ao Cu2 + e Fe3 +, em comparação com

algumas dessas enzimas [46,50]. Além disso, Excg1 foi altamente sensível ao Hg2 + na
concentração de 1 mmol L-1, com uma atividade residual de apenas 13,6%, o que foi
consistentecom dados obtidos para a maioria das xilanases halotolerantes [45,47,48,50].
EDTA teve pouco efeito sobre a atividade enzimática, sugerindo que Excg1 não é uma
metaloenzima. Em contraste, -mercaptoetanol a uma concentração de 10 mmol L-1 estimulou
a atividade enzimática 39%, como descrito para outras xilanases [32,34,66], incluindo as
halotolerantes [45,50]. O efeito do agente redutor pode ser atribuída à proteção de grupos tiol
de resíduos de cisteína, impedindo a sua oxidação [34]

3.9. Efeito de diferentes solventes orgânicos e acetato no atividade de xilanase de Excg1

Os efeitos de diferentes solventes usados no pré-tratamento de biomassa processos, bem

como o acetato, um subproduto de pré-tratamentos alcalinos, a atividade de xilanase de Excg1
foi avaliada (Fig. 7). A enzima foi altamente tolerante ao acetato até 200 mmol L − 1. Propanol
e o tolueno não afetou a atividade enzimática, enquanto uma ligeira estimulação (cerca de
20%) por acetona foi observada. Além disso, a enzima foi altamente tolerante ao glicerol,
metanol, etanol e butanol, com atividades residuais de 70 a 90%.

Até hoje, poucos estudos avaliaram a tolerância de xilanases fúngicas a solventes orgânicos.
Uma xilanase de Aspergillus awamori WRTS-F312 [67] foi ligeiramente inibido (14–37%) po
solventes orgânicos diferentes, tais como etanol, butanol, metanol ,propanol e acetona, numa
concentração final de 30% (v / v). Em contraste, uma xilanase de Aspergillus niger [68]
permaneceu estável por 1 ha 40 ◦C. na presença de etanol a 1% (v / v), butanol, metanol,
propanol, glicerol e acetona.

4. Conclusões

Uma nova endo-xilanase de C. graminicola foi purificada e caracterizada. Até onde sabemos,
este é o primeiro halotolerante endo-xilanase de origem fúngica descrita até à data. Além
disso, a enzima foi termoestável e tolerante a uma ampla faixa de pH, bem como solventes
orgânicos em níveis residuais e acetato de sódio. Além disso, a estabilidade térmica da
endoxilanase foi melhoradaaltas concentrações de NaCl. Xilana de madeira de faia hidrolisada
Excg1 com boa eficiência catalítica e alto Vmax, seja na ausência ou presença de 0,5 mol L − 1
de NaCl, e um Vmax apenas 34% menor foi determinado na presença de 2,5 mol L − 1 de NaCl.
Os principais produtos da hidrólise do xilano de madeira de faia por Excg1 foram xilobiose e
xilotriose com ramificação do ácido 4-O-metilglucurônico e

O curso de tempo da hidrólise foi altamente similar em 32 ‰ de salinidade natural da água do

mar e na ausência ou presença de 0,5 mol L − 1 de NaCl. Em conjunto, essas propriedades
sugerem que o Excg1 é um bom candidato a compor coquetéis enzimáticos para hidrólise de
biomassa, particularmente usando água do mar ou em condições de alto sal, ou a presença de
resíduos e / ou subprodutos de etapas de pré-tratamento, potencialmente contribuindo para
melhorar a viabilidade econômica de produção de etanol.