TECNICAS Y METODOS PARA LA

EXTRACCION Y PURIFICACIÓN DE ADN

(PCR)

INTEGRANTES:
 JULEISY KATERYN PULIDO TORRES
 YOMIRA PAMELA BARTOLO PAREDES

WILLIAN CAPA ROBLES

INGENIERIA GENETICA
 1
INGENIERIA GENETICA “PRACTICA N° 02

De los tres pasos críticos que componen el análisis de patógenos por PCR, la extracción de ADN es quizás
el más desconocido y sobre el que más control podemos ejercer.
En PCR, el ácido desoxirribonucleico (ADN) es el analito. Por tanto, una buena muestra implica siempre un
correcto proceso de obtención de esta molécula a partir de material biológico.

La extracción de ADN consta de las siguientes etapas:

1. Lisis de las células o virus.

Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas
o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es
necesaria a menudo para eliminar las membranas.

2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN

Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la
ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico.

3. Purificación. Consta de 3 fases:

 Precipitación del ADN: El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol
frío o isopropanol y recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se
llevará las sales añadidas previamente.
 Lavado del pellet: Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse
 Recuperación: El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado
completamente.

La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa y

posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro
mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm.

 INHIBIDORES DE LA PCR
Se trata de substancias que interfieren con las ADN polimerasas termoestables ya sea mediante el bloqueo
directo total o parcial de su actividad catalítica o mediante la unión directa al ADN de doble cadena. Por
ejemplo, algunas substancias interaccionan con los iones Mg2+

Otra importante fuente de inhibición son los propios reactivos que se usan en el proceso de extracción de
ADN, como por ejemplo, el exceso de KCl, NaCl y otras sales, detergentes iónicos, etanol e isopropanol,
fenol y otros.

Los inhibidores pueden eliminarse mediante purificación química del extracto o física mediante columnas
de sílica.
INHIBIDOR ORIGEN
Sales biliares Heces
Polisacáridos complejos Heces, material vegetal
Colágeno Tejidos
Grupo hemo Sangre
Ácidos húmicos Suelo, material vegetal
Melanina y eumelanina Pelo, piel
Mioglobina Tejido muscular
Proteinasas Leche
Iones de calcio Leche, huesos
Urea Orina
Hemoglobina, lactoferrina Sangre
Inmunoglobina G (lgG) Sangre

 EXTRACCIÓN DE ADN EN SUSPENSIONES BACTERIANAS

De todas las muestras biológicas que podemos someter a un proceso de extracción de ADN, las
suspensiones bacterianas, son quizás las que ofrecen menos problemas por la homogeneidad y riqueza
del material. En particular, las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden liberar cantidad
suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden ser una simple ebullición, congelación o
una combinación de ambas.

pág. 1 DOCENTE: WILLIAN CAPA ROBLES

 2
INGENIERIA GENETICA “PRACTICA N° 02

COMPARACIÓN DE TRES MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE RESTOS ÓSEOS

La posibilidad de utilizar restos óseos como fuente para la obtención de ADN ha significado un importante
impulso en la aplicación de las técnicas de biología molecular para múltiples fines forenses cuando no se
cuenta con otro tipo de muestras (Hochmeister et al. 1991, Hochmeister et al. 1995, Lassen et al. 1996,
Cattaneo et al. 1997).
En este estudio se procedió a evaluar tres métodos de extracción fenólica de ácidos nucleicos a partir de
restos óseos con el fin de determinar cuál reúne las mejores condiciones de aplicabilidad y eficiencia para
las pruebas de cuantificación de ácidos nucleicos y su amplificación utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).

Se seleccionaron seis huesos de diferentes individuos, cinco fémures (cuatro masculinos y uno femenino)
y un cráneo femenino. Cada hueso se trabajó por separado, en una pequeña cámara de plástico.
En el procesamiento de los fémures se cortaron del centro de cada hueso aproximadamente 20 que luego
se colocaron en una placa de Petri estéril (2.5 cm de diámetro por 0.3 cm de grosor) obteniendo al menos
20 gramos de muestra. El cráneo fue cortado con la misma sierra para obtener varios fragmentos de 3 cm
de largo por 1 cm de ancho.
Cada muestra fue cortada con una cizalla plana para obtener fragmentos lo suficientemente pequeños para
pulverizarlos en el Freezer/Mill. Los mismos fueron colocados en tubos plásticos de 50 ml debidamente
identificados y se almacenaron a –20oC sin pulverizar.

El análisis de ARN presente en los extractos mostró diferencias estadísticamente significativas (p= 0.003
de K-W) entre los métodos de extracción, siendo el método B el que extrajo la mayor cantidad de ARN.
Por su parte, el análisis de proteínas también mostró una diferencia significativa entre los métodos (p=0.011
K-W), detectándose una mayor cantidad en el método A.
El análisis de los valores de porcentaje de pureza emitidos por el Gene Quant para cada uno de los extractos
no presentó diferencias significativas entre los métodos de extracción (p= 0.164 de ANOVA); sin embargo,
el análisis de la proporción (A260 nm/A280 nm) reveló posibles problemas de contaminación en los
extractos de los métodos B y C por presencia de proteínas ya que las proporciones eran menores a 1.7
(Miesfeld 1999). Para la proporción (A260 nm/A230 nm), el resultado del método A fue de 2.7 y para los
métodos B y C se obtuvo valores inferiores a 2.0.
La comparación general entre los diferentes métodos de extracción según la tasa de éxito en las
amplificaciones de STRs (porcentaje de amplificaciones positivas versus amplificaciones negativas) mostró
que las mismas fueron de 50%, 40% y 33% para los métodos A, B y C.

EVALUACIÓN DE VARIAS TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ADN DE Cryptococcus spp. A PARTIR

DE MUESTRAS AMBIENTALES

El género Cryptococcus comprende, al menos, 38 especies, pero sólo 3 se han informado como patógenas
para el hombre y los animales. Los estudios del hábitat se han realizado con técnicas de extracción con
soluciones tampón y cultivos en medios selectivos. Se evaluaron varias técnicas de extracción del ADN de
Cryptococcus spp. A partir de muestras ambientales con el fin de utilizar la mejor de ellas como herramienta
para delimitar el hábitat de este importante patógeno en nuestro país.
Para la extracción del ADN de cepas control se emplearon dos métodos de extracción:
 Por medio de ruptura física con perlas de vidrio de acuerdo con el protocolo descrito por Díez.
 Se empleó nitrógeno líquido, según el método descrito por Meyer (19). El ADN extraído se
amplificó mediante PCR con las condiciones descritas más adelante.

El objetivo del presente estudio fue evaluar varias técnicas de extracción y purificación de ADN de
Cryptococcus spp. a partir de muestras ambientales, como una alternativa para el método tradicional de
recuperación del hongo con la siembra en medios selectivos, con el fin de utilizar la mejor de ellas como
herramienta para delimitar el hábitat de este importante patógeno en nuestro país. Este método debería
darnos la posibilidad de obtener ADN con una calidad y pureza suficientes para ser amplificado mediante
una PCR. Para cumplir con este objetivo, se inició con una extracción del ADN del hongo a partir de cultivos;
luego, se determinaron las condiciones para extraer el ADN a partir de un material inerte (vermiculita)
contaminado con el hongo; posteriormente, se evaluaron varias alternativas para la extracción a partir de
suelos contaminados en el laboratorio y, finalmente, se trabajó con muestras de suelos naturalmente
colonizadas con el hongo. Este proceso permitió establecer que el método de nitrógeno, que funciona con
las cepas control, no es igualmente eficiente cuando se utiliza en muestras de suelos contaminadas o
naturalmente colonizadas. Además, este método no presentó una correlación entre la cantidad de muestra
inoculada en los suelos y el ADN amplificado por PCR, aunque éste es el método recomendado por Meyer
para la extracción del ADN de C. neoformans a partir de cultivo.

pág. 2 DOCENTE: WILLIAN CAPA ROBLES