Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri

A. PENDAHULUAN

Pada perkembangan metode Kromatografi saat ini pemakaian "Thin Layer Chromato
Scanner" yang lebih dikenal dengan nama densitometer makin banyak dipakai secara luas oleh
peneliti/ilmuwan.

Densitometri adalah metode analisi instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi

elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak atau noda pada lempeng KLT.

Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda pada lempeng KLT yang ditentukan adalah
adsorpsi, transmisi, pantulan (refleksi) pendar fluor atau pemadaman pendar fluor dari radiasi
semula. Keunggulannya adalah dititikberatkan untuk analisis analit-analit dengan kadar sangat
kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT.
Metode ini yang banyak diguanak dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif di bidang farmasi
terutama di bidang analisis obat bahan alam.

B. TEORI DASAR

Kromatografi Lapis Tips (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar
perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah ngerakan pelarut
pengembang/pengembang campur.

Fase Diam

Bahan padat pada penyangga : pelat elas/logam atau plastik dengan ketebalan 0,25 mm. Fase
diam yang banyak dipakai : silika gel yang dicampur CaSO4 ; adsorben lain yang juga banyak
dipakai : alumnia, kieselguhr, celite, serbuk selulose, serbuk poliamida, kanji dan sephadex.

Jenis fase diam : sama seperti pada KCKT dikenal beberapa macam sifat polaritas. Silikal gel
dikenal sebagai fase diam polar, yang dapat dibuat menjadi non polar (RP = Reversed Phase)
setelah dilakukan pengikatan hidroksilnya dengan : C2, C8, atau C18.

Mekanisme pemisahan adalah : adsorpsi,partisi, penukar ion atau fase terbalik (adsorpsi-
partisi). Apabila sampel bersifat non polar maka pelarut pengembangnya non polar. Sedangkan
bila sample bersifat polar, maka pelarut pengembangnya bersifat polar.

Ukuran fase diam 1-25 million dalam keadaan uniform/seragam, akan menghasilkan
pemisahan baik dan aliran fase gerak cepat dan merata.
Pada prinsipnya pemisahan KLT diusahakan dilakukan dalam keadaan netral.
 Image 1 : KLT

Image 2 : Thin Layer Chromatography

Profil Kromatogram

Kromatogram KLT akan tampak setelah visualisasi dengan cara fisika atau kimia. Bila proses
pemisahan baik akan menghasilkan bercak atau noda bulat. Bila pemisahan kurang sempurna
bercak atau noda berekor, penyebabnya antara lain : pemilihan fase gerak yang tidak tepat dan
ketidakjenuhan chamber.

Penotolan sample dengan mikropipet dan selama eluasi suhu harus dijaga, karena kenaikan
suhu berpengaruh kepada Rf.
 Image 3 : Kromatografi Kertas Menaik

Image 4 : Kromatogram

Faktor retardasi : Rf

adalah jarak migrasi komponen (bercak) dibagi jarak migrasi fase gerak

Rf = dR / dM = hRf / 100

Desintometri

S. Levi dan R Reisfeld telah mengangkat metode densitometri ke tingkat analisis kuantitatif ultra mikro. Keduanya telah berhasil
menentukan antara lain testosterone dalam cairan biologis pada rentang kadar 1-250 ng, dan kolesterol 4 -150 ng dengan pendar
fluor pada noda (kromatogram)KLT.

Prinsip penentuan dengan metode desintometri hampir sama dengan metode spektrofotometri.
Penetuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area / luas noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding dengan
metode KCKT atau KGC, sebab area noda kromatogram diukur pada posisi diam atau "zig-zag" menyeluruh.

Persamaan Kubelka-Munk

Secara teoritis Kubelka dan Munk telah berhasil menerangkan mengapa hubungan antara kadar analit yang dirajah terhadap area /
luas kromatogram tidak merupakan garis lurus. Menurut kedua ilmuwan tersebut, apabila radiasi elektromagnetik (REM) dengan
intensitas semula (I) jatuh pada permukaan lapis tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari
REM tersebut direflesikan (Is) dan sebagian diserap oleh analit lapisan tipis (I0) dan sebagian
lagi diteruskan (It).

I = I0 + Is + It

Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tips (E) yang dinyatakan sebagai
Is = I. E

Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :
 I0 = I -Is
I0 = I - I.E = (1-E)
Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukumLambert-Beer seperti pada
spektrofotmetri.
It = I0.e-K.x
x = tebal medium lapis tipis , K = koefisien adsorpsi. Harga e-K.x menyatakan berkurangnya intensitas REM yang melewati medium.
Harga tersebut dikenal juga sebagai kerapatan optik atau "optical density" dan medium yang dilewati REM.
Pada semua pelat KLT tidak memberikan homogenitas fase diam karena keitdaksamaan partikel-partikel fase diamnya disamping kerja penyerapan REM juga
terjadi percikan radiasi oleh partikel fase diam.

Pada metode Spektrofotodensitometri / densitometri dikenal parameter :

K = (Koefisien penyerapan)
S = (Koefisien penghamburan)
Karena parameter S itulah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk ke medium lapis tipis karena hilangnya intenstitas
radiasi (dihamburkan) oleh partikel-partikel fase diam. Di sinilah letaknya mengapa terjadi lengkung pada Kurva teoritas "Kubelka-
Munk"

Image 5 : Kurva Kubelka-Munk

Setiap pelat KLT yang dipakai memberikan harga SX bebrbeda (tiap merek berbeda) harga SX berkisar : 0-10
Spektro densitometer (Thin Layer Chromato Scanner) modern dilengkapi mikro komputer dengan harga operasional SX = 0-3
untuk melinearkan kurva teoritis Kubelka-Munk tanpa mempersoalkan SX lagi.

C. INSTRUMENTASI

Komponen penting dari densitometer antara lain :

1. Sumber radiasi (Source), pengatur panjang gelombang (λ

selector), beam spliter, thin layer plate (end view),
detector phototube (transmitance position)
Sumber radiasi ada 3 macam tergantung rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan.
Pada umumnya densitometri memberikan rentang gelombang penentuan 200-630 nm. Lampu
Deuterium (D2) dipakai untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak.
Untuk penetapan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Sama seperti pada
spektorfotometri, pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau adsorpsi dan refleksi pada panjang gelombang
maksimal.
Pada penetapan pendar fluor dan pemadaman pedar fluor juga harus dilakukan pada panjang gelombang dimana terjadi
emisi atau intensitas realitif pendar fluor yang optimal.

Monokromator dengan fungsi yang sama seperti pada spektrofotometri UV-Vis yang diperlukan pada densitometer. Biasanya
dipakai monokromator kisi difraksi 1200 garis/mm.

Detektor PMT Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foto) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.

D. APLIKASI

Metode KLT-Densitometri digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

Analisis Kualitatif

Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada prinsipnya mengacu kepada nilai Rf(Retardation factor) atau Faktor retardasi
membandingkan bercak kromatogram
yaitu : membandingkan Rf analit dengan Rf baku pembanding atau
sample dengan kromatogram"Reference Standart" yang dikenal dengan : Factro
Retensi Relatif (Rx)
Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan bersamaan dengan sample pada pelatyang sama.

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS SECARA

DENSITOMETER TLC SCANNER III
DASAR TEORI
Kromatografi lapis tipis ( Thin Layer Kromatography ) adalah adalah salah satu
kualitatif dari suati sample yang akan di deteksi yang akan dideteksi dengan memisahkan
komponen- komponen sample berdasarkan kepolaran. Ide penggunaan kromatografi serapan
dalam bentuk lapisan tipis di lekatkan pada suatu penyongkong telah di kelengahkan pada tahun
1938. Mula pertama dicoba memisahkan terpen-terpen pada “Cromatostrip” yang di buat dengan
melpisi
potongan gelas kecil dengan penyerap yang di campur dengan pati atau pelekat yang
berkelakuan sebagai pengikat. Kromatografi lapis tipis perlu dibandingkan pertama-tama
dengan kromatografi serapan karena mempunyai sistem fisika yang bersamaan diantara
keduanya dan kedua dengan kromatografi partisi kertas, karna mempunyai kesamaan
dalam teknik eksperimennya, kromatografi kolom yang merupakan proses yang lambat
yang membutuhkan relatif dalam jumlah yang besar demikian pula cuplikan yang di
gunakan sedangkan kromatografi lapis tipis hanya membutuhkan penyerap dan cuplikan
dalam jumlah yang sedikit dan noda-noda yang terpisahkan yang diloalisir pada plat seperti
pada lembaran kertas.
 Densitometri adalah metode analis instrumental yang berdasarkan interaksi radio
elektromagnetik dengan analit yng merupkan noda pada KLT. Analis densitometri di butuhkan
standar dan sampel yang cukup murni. Syarat keberhasilan densitometri adalah penempatan
standar dan sampel yang akurat dan konsisten ke atas lempeng dalam jumlah kecil serta ukuran
bercak yang kecil dan hampir sama.
Persamaan Kubelka – Munk :
I = Io + Is + It
I = radio elektromagnetik dengan intensitas semula
Io = yang jatuh pada permukaan lapis tipis yang tidak homogen dengan arah rambat tegak lurus
Is = di serap oleh analit lapis tipis
It = sebagian diteruskan

Instrumentasi pada TLC scanner terdiri dari sumbar cahaya, alat seleksi ƛ, sistem
kondensor dan fokus, sistem optik, detektor fotosensitisasi, mekanisme menggerakan lempeng ke
bawah berkas cahaya terfokus