PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

LUCRARE PRACTICA
Extractia ADN genomic
MATERIALE ȘI METODE

1. Tulpini luate în lucru

1. 3 tulpini de drojdii de identificat prin PCR-RFLP
2. Saccharomyces cerevisiae bayanus EC 1118 (tulpină de referință)

2. Aparatura, Materiale și Reactivi

a) Aparatură
► microcentrifugă cu răcire
► Baie de apă 37°C
► Thermocycleur (MultiGen, Labnet)
► Vortex
► Electroforeză
► Transiluminator UV

b) Materiale
► Micropipete cu volum reglabil
► Vârfuri de pipetă sterile
► Tuburi Eppendorf şi tuburi PCR sterile
► Mănuşi

c) Reactivi
►Kit comercial de extractie ADN (ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep, Zymo Research)
►Tampon TBE ( Tris acid boric EDTA) – 1X
►Gel de agaroză la 2%
►Bromură de etidium (BET) (10mg/mL)

3.1. Extractie ADN genomic total

Biomasa levuriană a fost recoltată de pe mediul de cultură în tuburi Eppendorf, în vederea
extracției de ADN fungic. Ulterior, suspensia obţinută a fost centrifugată la 10000 g, timp de 10
minute, 4ºC, în vederea obţinerii unui sediment cuprins între 50-100 mg. Extracţia propriu-zisă a fost
realizată utilizând kitul (ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep, Zymo Research) conform instrucțiunilor
recomandate de producător
Protocolul de lucru a fost următorul:
1. 750 μl soluție de liză (lysis solution) (suplimentată cu beta-mercaptoetanol 0,05% (v/v)) au
fost adăugați peste sedimentul levurian. Amestecul obținut a fost vortexat la viteză maximă pentru 5
minute (1 min. vortex + 1 min. în gheaţă).
2. Suspensia a fost centrifugată la 10.000 x g, timp de 1 minut;
3. 400 μl supernatant au fost transferați într-o coloană (Zymo-Spin™ IV Spin Filter) poziționată
intr-un tub colector şi centrifugați la 7,000 rpm timp de 1 minut;
4. 1200 μl tampon de legare (Fungal/Bacterial DNA Binding Buffer) au fost adăugaţi peste
filtrat;
1
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

5. 800 μl din amestec au fost transferaţi într-o altă coloană (Zymo-Spin™ IIC Column) şi
apoi centrifugaţi la 10,000 x g timp de 1 minut. Etapa 4 a fost repetată;
6. Coloana a fost transferată într-un tub colector nou;
7. 200 μl DNA tampon de pre-spălare (DNA Pre-Wash buffer) au fost adăugaţi şi a urmat o
centrifugare la 10,000 x g timp de 1 minut;
8. 500 μl tampon de spălare (Fungal/Bacterial DNA Wash Buffer) s-au adăugat şi a urmat o
nouă centrifugare la 10,000 x g timp 1 minut;
9. În etapa finală, ADN-ul a fost resuspendat în 75 μl tampon de eluție (DNA elution buffer).

Determinarea concentratiei si purității ADN-ului prin electroforeză

Pentru separarea şi caracterizarea produșilor de PCR și a fragmentelor de restricție, o
electroforeză a fost realizată în gel de agaroză 2% , conţinând bromură de etidium (BET) (14 μg.μL-1).
BET este un agent mutagen care se intercalează între bazele de acizi nucleici şi permite vizualizarea
acestora prin fluorescenţa sa sub UV (254 nm). BET trebuie utilizat cu maximum de precauţie, fiind
cancerigen. Tamponul utilizat pentru migrare a fost TBE 1X. Sărurile conţinute în acest tampon permit
migrarea ADN-ului în câmpul electric, din cuva de electroforeză orizontală. Programul de migrare a
fost 60 minute la 90 Volți.

Determinarea concentratiei si purității ADN-ului prin spectofotometrie

EXEMPLU

2
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

LUCRARE PRACTICA- EXEMPLU

PCR-ITS-RFLP
TULPINI LUATE ÎN LUCRU
- 3 tulpini de drojdii
- Saccharomyces cerevisiae bayanus EC 1118 (tulpină de referință)

- PREGĂTIREA AMESTECULUI DE PCR

C.i. Vf (50 µl) C.f.
Apă MilliQ 28,75
10X DreamTaq Green 5
Buffer conținând
MgCl2 20 mM
dNTP 10mM 10 mM 1 0,2 mM
ITS 1 10 µM 2,5 0,5 µM
ITS 4 10 µM 2,5 0,5 µM
Taq polymerase 5 U x µl-1 0,25 0,025 U x µl-1
ADN 100-150 ng x µl-1 10 20-30
g x µl-1

- Primerii ITS1 și ITS4 descriși de catre White et al. (1990) au fost reținuți pentru a amplifica
regiunea 5,8S-ITS.
ITS 1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’);
ITS 4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’).

- Amplificarea a fost realizată în thermocycler MultiGene după următorul program:

• Denaturare iniţială la 94°C, timp de 3 minute;
• Denaturare la 94°C, timp de 1,5 minute;
• Hibridare la 55,5°C, timp de 1,5 minute; x 34
• Elongare la 72°C, timp de 2 minute;
• Elongare finală la 72°C, timp de 10 minute.

 Timpul pentru amplificare este de aproximativ 4 ore.

- DIGESTIA ENZIMATICA

Pornind de la studiul realizat de Esteve-Zarzoso et al. (1999), produșii de PCR au fost digerați cu
enzimele de restricţie HaeIII, HinfI și HhaI (CfoI) (Fermentas, Franţa).

Situsul de clivare al enzimelor utilizate:

-HaeIII: -HinfI: -HhaI:
5’...GG^CC...3’ 5’...G^ANTC...3’ 5’...GCG^C...3’
3’...CC^GG...5’ 3’...CTNA^G...5’ 3’...C^GCG...5’

3
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

- Pregătirea amestecului de digestie în micro-tuburi de PCR, după cum urmează:

• Produs de PCR 10 μL
• Apă nuclease-free 7 μL
• Tampon 2 μL
• Enzime 1 μL

- Realizarea digestiei enzimatice pe baie de apă, timp de 4 ore, la 37°C.

ELECTROFOREZA
Pentru separarea şi caracterizarea produșilor de PCR și a fragmentelor de restricție, o
electroforeză a fost realizată în gel de agaroză 2% , conţinând bromură de etidium (BET) (14 μg.μL-1).
BET este un agent mutagen care se intercalează între bazele de acizi nucleici şi permite vizualizarea
acestora prin fluorescenţa sa sub UV (254 nm). BET trebuie utilizat cu maximum de precauţie, fiind
cancerigen. Tamponul utilizat pentru migrare a fost TBE 1X. Sărurile conţinute în acest tampon permit
migrarea ADN-ului în câmpul electric, din cuva de electroforeză orizontală. Programul de migrare a
fost 60 minute la 90 Volți.

ANALIZA REZULTATELOR
Dimensiunile au fost estimate prin compararea cu o lungime standard de
ADN (GeneRuler 100bp ADN Ladder, Fermentas, Franţa). Analiza fragmentelor
de restricție au fost comparate cu rezultatele obținute de către Esteve-Zarzoso et
al., (1999); Sabate et al., (2002); Baffi et al., (2010). De asemenea, digestia
teoretică a fost realizată cu programul http://biotools.umassmed.edu/tacg4/
uilizând secvenţe ITS depuse în baza de date EMBL (European Molecular
Biology Laboratory).

4
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

INTERPRETAREA REZULTATELOR OBȚINUTE

1. PCR-ITS

Regiunea ITS1-5.8S -ITS2 a fost aleasă ca regiune-ţintă, deoarece conţine o regiune conservată
(ARNr 5.8S) şi 2 regiuni variabile (ITS1 şi ITS2), utilizate pe scară largă de către mulţi autori, în
studiile de polimorfism (White et al., 1990; Esteve-Zarzoso et al., 1999; Sabate et al., 2002; Baffi et
al., 2010).

PCR

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L

Figura 1: Exemplu de electroforeză în gel de agaroză 2% a produşilor amplificaţi cu ITS1/ITS4

L - DNA ladder 100 bp

2. Interpretarea rezultatelor obținute prin PCR-ITS-RFLP

Principiul metodei PCR-ITS-RFLP este de a utiliza minimum de enzime de restricţie pentru un

maximum de identificări a tulpinilor, speciilor sau genurilor luate în lucru. Pornind de la studiul
realizat de Esteve-Zarzoso et al. (1999), 3 endonucleaze au fost utilizate : HhaI (CfoI), HinfI și HaeIII,
în vedere identificării și discreminării tulpinilor de drojdii.
Produșii de PCR rezultați au fost supuși digestiei enzimatice cu cele 3 endonucleaze reținute
(figura 2 și tabelul 1).

5
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

HhaI

500pb

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L

HinfI

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L
HaeIII

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L
Figura 2: Profilul de restricţie a tulpinilor de drojdii luate în studiu, după digestia cu endonucleazele
de restricţie: HhaI, HinfI și HaeIII

6
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

Tabel 1. Identificarea tulpinilor de drojdii luate în studiu bazată pe analiza PCR-RFLP a regiunii 5,8S-
ITS

No Tulpini analizate Fragmente de restricție obținute Identificare

HhaI HinfI HaeIII
1. Y1KP
2. Yk2

3. Yk4
4. V3
5. MPM
6. KA
7. SP
8. EC1118
9. McR7
10. PM

Tabelul 2 : Dimensiunea produșilor de PCR și a fragmentelor de restricție pentru diferite specii de

drojdii (după Esteve-Zarzoso et al., 1999)
PCR
Specii de drojdii CfoI HaeIII HinfI
(pb)
Metschnikowia
400 205 + 100 + 95 280 + 100 200 + 190
pulcherrima
Rhodotorula
640 320 + 240 + 80 425 + 215 340 + 225 + 75
mucilaginosa
Rhodotorula glutinis 640 320 + 240 + 80 430 + 210 340 + 225 + 75
Saccharomyces 320 + 230 + 180 +
880 385 + 365 365 + 155
cerevisiae 150
Pichia anomala 650 575 600 + 50 310 + 310
Rhodotorula glutinis 100+210+300
600 600 100+120+210
secventiere

Referințe
1. Baffi M.A, Bezerra C Dos S., Arevalo-Villena M., Briones-Perez A., Gomes E., Da Silva R.
(2010). Isolation and molecular identification of wine yeasts from a Brazilian vineyard. Short
Communication. Ann Microbiol., 61:75–78.
2. Esteve-Zarzoso B., Belloch C., Uruburu F., Querol A. (1999). Identification of yeast by RFLP
analysis of the 5,8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International
Journal Of Systematic Bacteriology, 49: 329-337.
3. Sabate, J. Cano, J. Esteve-Zarzoro, B. Guillamon, J.M. (2002). Isolation and identification of
yeasts associated with vineyard and winery by RFLP analysis of ribosomal genes and mitochondrial
DNA, Microbial Research, 157: pp. 267-274.

7
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

LUCRARE PRACTICA - EXEMPLU

Secvențierea și analiza comparativă a secvențelor
Una dintre metodele folosite pentru secvenţializare este „dye-terminator” (Costache și
Georgescu, 2009).
Principiul metodei (Costache și Georgescu, 2009
În cazul acestei metode un primer oligonucleotidic este desemnat pe bază de complementaritate
cu secvenţa pe care dorim să o secvenţializăm. Plecând de la extremitatea 3’-OH a primerului
împerecheat, o ADN polimerază sintetizează catena complementară în prezenţă de deoxinucleotide
(dNTP) şi dideoxinucleotide (ddNTP). Fiecare dintre aceste dideoxinucleotide sunt marcate cu câte un
colorant fluorescent diferit. La fiecare încorporare a unui ddNTP elongarea catenei este stopată, ceea
ce generează o colecţie de fragmente de mărimi diferite, dar care se termină cu un ddNTP marcat
corespunzător. Fluorescenţa acestora va fi analizată cu ajutorul unui detector LASER care excită
marcatorul fluorescent, radiaţia acestuia fiind preluată de o cameră specială. Semnalul este prelucrat de
programe specializate de calculator obţinându-se în final electroforegrama corespunzătoare secvenţei
analizate (a se vedea Anexa 2).
In cazul experimentelor noastre, produșii PCR au fost secvențiați de o companie comercială
Microsynth (Austria). Produșii de amplificare ai regiunei 5.8SS-ITS obținuți de la izolatele de drojdii
au fost direct secvențiați, utilizând perechea de primeri ITS1/ITS4 pentru a obține secvența în ambele
direcții.
Cum trebuie intrepretate rezultatele obținute prin secvențiere?

1. Produsul de PCR fiind secvențiat în ambele direcții, una dintre secvențe trebuie
transformată în reverscomplementul acesteia, utilizând site-ul
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html.

2. Secventele secventiate sunt aliniate utilizând Clustal Omega < Multiple Sequence
Alignment < EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) si trebuie sa prezinte o
identitate de 95-100% intre cele 2 secvente.

3. Secvențele secvențiate au fost comparate cu secvențele existente în bazele de date publice,

folosind Basic Local Alignment Search Tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) și
aliniate folosind funcția de aliniere automată a programului.

4. De asemenea, digestia teoretică a fost realizată cu programul

http://biotools.umassmed.edu/tacg4/ utilizând secvenţe ITS depuse în baza de date EMBL
(European Molecular Biology Laboratory).
IMPORTANT Pentru validarea rezultatelor obținute în urma secvențierii trebuie obținut un
procent de identitate cuprins între 99-100%.

8
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

AMORCE ITS1 : 5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’ 3’- ccgcaggttcacctacgga-5’

AMORCE ITS4 : 5’-tcctccgcttattgatatgc-3’ 3’-gcatatcaataagcggagga-5’

1. DACA SECVENTA TINTA A FOST CLONATA INTR-UN VECTOR DE

CLONARE – SECVENTIERE INTR-O SINGURA DE DIRECTIE
>PL-BB_M13_17 1037 0 1037 ABI
GGTTGAACTCTTATAGGGCGATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGG
CCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTCCGTAGGTGAACCTG
CGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTTTGGGTCCAACCTCCCACCCG
TGTTTATTTACCTCGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGG
GGGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCCCGAACTCTGC
CTGAAGATTGTCGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACA
ACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAC
GTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATT
GCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCC
CTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTCCGGGGGACGG
GCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCT
TTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATT
TTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGC
ATATCAATAAGCGGAGGAAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTAC
TAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGATGCATAGCTTGAGTATTCTA
TAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCTAATCATGGTCATAGCTGTTTTCCTGT
GTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACAAGCCAGAAGCA
TAAAGTGTAAAAGCCTGGGAGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCTCATTAA
TTTCCGTTGTGCCCCCTGCCCGCTTTTCCGTCAGGAAACCAGTCGGGCCA
TTTGATATATGTATCGGTCATGCTGCTGGAAAATGTAGTTTGCCTATTGG
GCCCTCTTTCGCTTTCTCTGTACTATGATACCATGCT
>PL-BB_M13
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTTTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTTACCTCGTTGCTTCGGC
GGGCCCGCCTTAACTGGCCGCCGGGGGGCTCACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCCCGAACTCTGCCTGAAGATTGTCGTCT
GAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGT
GAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTG
CCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCTCCGATTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAG
CGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGG
GATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA
Max score Total score Query cover E value Ident Accession

Penicillium expansum isolate F758 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and
1079 1079 100% 0.0 100% MG714838.1
internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA
gene, partial sequence

Penicillium expansum isolate R27 small subunit ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and
1079 1079 100% 0.0 100% KX243329.1
internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit
ribosomal RNA gene, partial sequence

Penicillium expansum isolate R21 small subunit ribosomal RNA gene, partial
sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and
1079 1079 100% 0.0 100% KX243328.1
internal transcribed spacer 2, complete sequence; and large subunit
ribosomal RNA gene, partial sequence

Penicillium sp. F731 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal
transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed
1079 1079 100% 0.0 100% KM249071.1
spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial
sequence

Penicillium expansum ATCC 7861 ITS region; from TYPE material 1079 1079 100% 0.0 100% NR_077154.1

9
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

2. DACA SECVENTA TINTA A FOST DIRECT SECVENȚIATĂ –

SECVENTIERE IN AMBELE DIRECTII
1. Produsul de PCR fiind secvențiat în ambele direcții, una dintre secvențe trebuie
transformată în complementul acesteia, utilizând site-ul
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html.
>Asp_its1
AGGATCTTTCGGGGCCACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCC
GGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAA
CAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGT
CTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGG
CCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGC
CCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG
CgGAGGAA

> Asp_its4
CATACCTGATCCGAGGTCATCTGAGAAGATTGGGGGTCGAGGCAAGCCCCGGCCGGGCCCATAGAGCGGGTGACAGAGCCCCATACGC
TCGAGGACCGGACGGTGCCGCCGTTTCTCTCGAGGCCCGCCCCCGGGGGGGCGCGGCCCAACAACCAGCGGGGCTGGAGGGGAGAAAT
GACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACA
TTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACTGATTGGTATCAATCGAC
TCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCCATTGGGGTCTCCGGCGGGCGCGGTCCCGGGGGCAGGCCCCGGGCCGCCCGAAGGCGGGC
CCGCCGAAGCAACAGGGTACGGTAAGCACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGAAGGACCCAGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCA
CCTACGGA

>Asp_its4Revers
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGC
TTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTG
CAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG
ATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTC
CGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCG
GTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATGACCTCGGAT
CAGGTATG

2. Secventele secventiate sunt aliniate utilizând Clustal Omega < Multiple Sequence
Alignment < EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) si trebuie sa prezinte o
identitate de 95-100% intre cele 2 secvente.
CLUSTAL O(1.2.4) multiple sequence alignment

Asp_its4R TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCT 60
Asp_its1 ----------------------------------------AGGATCTTTCGGGGCCACCT 20
* * ** * ****

Asp_its4R CCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGC 120

Asp_its1 CCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGC 80
************************************************************

Asp_its4R CTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGT 180

Asp_its1 CTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGT 140
************************************************************

Asp_its4R CTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCAT 240

Asp_its1 CTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCAT 200
************************************************************

Asp_its4R CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC 300

Asp_its1 CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC 260
************************************************************

Asp_its4R GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTC 360

Asp_its1 GAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTC 320
************************************************************

Asp_its4R ATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAG 420

Asp_its1 ATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAG 380
************************************************************

Asp_its4R AGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGC 480

Asp_its1 AGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGC 440

10
PROTOCOL

Identificarea moleculara a tulpinilor fungice

************************************************************

Asp_its4R CCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATGACCTCGGATCAGGT-ATG--- 536

Asp_its1 CCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGGAT 500
************************************** * * * * *

Asp_its4R ------------------------------------ 536

Asp_its1 ACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCgGAGGAA 536

3. Secvențele secvențiate au fost comparate cu secvențele existente în bazele de date publice,

folosind Basic Local Alignment Search Tool (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) și
aliniate folosind funcția de aliniere automată a programului.
>Asp_its1
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCTGGGTCCTTCGGGGCCCAACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGC
TTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTG
CAGTCTGAGTCGATTGATACCAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG
ATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTC
CGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCG
GTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGA
TCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCgGAGGAA
E
Max score Ident Accession
value

Aspergillus aculeatus isolate Ekm II 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;
100
internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed 100% MF151167.1
%
spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Aspergillus sp. BAB-3901 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal
100
transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 100% KM066598.2
%
2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Aspergillus aculeatus isolate A1S3_D48 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal 100
100% JX501355.1
transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial %
sequence

Aspergillus aculeatus strain A1.9 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;
100
internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed 100% EU833205.1
%
spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Aspergillus aculeatus isolate A1S4_D17 18S ribosomal RNA gene, partial

sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal
99% 100% JX501358.1
transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial
sequence

Aspergillus sp. 1002F2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal
transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 99% 100% FJ416300.1
2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Aspergillus aculeatus isolate XSD-74 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;
internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed 99% 100% EU326206.1
spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

Aspergillus aculeatus strain V2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence;

internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed 99% 100% KJ862074.1
spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence

4. De asemenea, digestia teoretică a fost realizată cu programul

http://biotools.umassmed.edu/tacg4/ utilizând secvenţe ITS depuse în baza de date EMBL
(European Molecular Biology Laboratory).

NlaIII _CATG' (0 Err) - 2 Fragment(s) found (4.09 sites exp)

347 229
RsaI GT'AC (0 Err) - 2 Fragment(s) found (4.09 sites exp)
79 497
HhaI G_CG'C (0 Err) - 4 Fragment(s) found (9.66 sites exp)
75 138 185 178

11