MAKALAH BIOTEKNOLOGI TERAPAN

ENZIM-ENZIM UNTUK MANIPULASI DNA DAN KLONING GEN

(Diajukan sebagai tugas mata kuliah Bioteknologi Terapan)

Disusun Oleh:
Adela Mulyana (17177001)
Aidil Akbar (17177002)
Amrianto (17177003)
Asma Edi Hasan (17177004)

Dosen Pembimbing:
Dr. Yuni Ahda, S. Si., M. Si.

PROGRAM STUDI MEGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PADANG
2018
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami ucapkan atas kehadiran Allah SWT, atas rahmat dan
hidayah-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan Makalah Bioteknologi
Terapan dengan waktu yang telah diberikan. Dalam penyusunan makalah ini
masih jauh dari kesempurnaan namun demikian penyusun telah berusaha
semaksimal mungkin agar hasil dari tulisan ini tidak menyimpang dari ketentuan-
ketentuan yang ada.
Atas dukungan dari berbagai pihak akhirnya penulis bisa menyelesaikan
makalah ini. Untuk itu dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih
kepada orang tua yang telah memberikan semangat, motivasi kepada penulis,
terima kasih kepada Dosen yang mengajar mata kuliah Bioteknologi Terapan
yang memberikan pengajaran dan arahan dalam penyusunan makalah ini, dan
tidak lupa kepada teman-teman semua yang telah ikut berpartisipasi membantu
penulis dalam upaya penyusunan makalah ini.
Penyusun menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kesempurnaan,
karena tidak ada gading yang tak retak. Begitu pula dengan makalah ini masih
jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu kami mengharapkan kritik dan saran
yang sifatnya membangun demi kesempurnaan makalah ini, dan mudah-mudahan
ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Padang, 14 September 2018

Penulis

i
 DAFTAR ISI
Hal
Kata Pengantar ............................................................................................ i
Daftar Isi ..................................................................................................... ii
BAB I. Pendahuluan ................................................................................... 1
A. Latar Belakang ................................................................................ 1
B. Rumusan Masalah ........................................................................... 1
C. Tujuan ............................................................................................. 1
BAB II. Pembahasan .................................................................................... 2
A. Manipulasi DNA ............................................................................. 2
B. Kloning Gen .................................................................................... 10
BAB III. Penutup ......................................................................................... 15
A. Kesimpulan ..................................................................................... 15
B. Saran ................................................................................................ 15
DAFTAR PUSTAKA

ii
 BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA merupakan salah satu jenis asam nukleat yang berfungsi sebagai
tempat penyimpanan dan penerusan materi genetik dari sel induk ke sel anak. Dari
DNA akan diekspresikan beberapa sifat yang diturunkan dari sel induk. Sehingga,
ada beberapa struktur DNA yang harus diketahui.
Struktur DNA terdiri dari ada tiga struktur. Struktur tersebut antara lain
struktur primer, struktur sekunder, dan struktur tersier. Manipulasi DNA
menyebabkan ekspresi yang berbeda-beda dengan DNA sebelum di manipulasi.
Maka dari itu perlu diketahui struktur dan manipulasi DNA.
B. Rumusan Masalah
1. Bagaimana proses manipulasi DNA?
2. Apa saja enzim-enzim yang bekerja pada proses manipulasi DNA?
3. Apa yang dimaksud dengan kloning gen?
C. Tujuan
1. Mengetahui proses manipulasi DNA
2. Mengetahui enzim-enzim yang bekerja pada proses manipulasi DNA
3. Mengetahui tentang kloning gen.

1
 BAB II
PEMBAHASAN
A. Manipulasi DNA
Sejak penemuan E. Coli K12 dan Haemophylus influenzae pada tahun
1970, dari kedua bakteri ini telah diisolasi enzim-enzim yang mempunyai sifat
retriksi endonuklease secara khusus. Pada saat ini, penemuan enzim-enzim
restriksi ini sangat cepat, dan telah banyak dikenal berbagai macam enzim
restrikasi sebagai salah satu bahan rekayasa genetika utuk memodifikasi DNA
atau gen secara khusus. Hampir semua teknik manipulasi DNA menggunakan
enzim yang telah dimurnikan. Enzim-enzim ini berperan dalam proses penting di
dalam sel, seperti replikasi dan transkripsi DNA, DNA proofreading, enzim
kelompok ini dapat mengidentifikasi, memotong dan memperbaiki ke urutan basa
nukleotida terhadap mutasi yang ada di molekul DNA, degredasi DNA/RNA
asing (dari infeksi virus), serta rekombinasi antara molekul-molekul DNA yang
berbeda (Fatchiyah, dkk., 2011: 39).
Enzim-enzim untuk manipulasi ini dapat dikelompokkan menjadi lima
golongan besar, tergantung dari jenis reaksi yang dikatalisis, berikut enzim-enzim
tersebut (Fatchiyah, dkk., 2011: 41).
1. Nuklease, kelompok enzim ini dapat memotong, memendekkan, atau
mendegradasi molekul DNA. Enzim kelompok ini mempunyai sifat
eksonuklease (menghilangkan nukleotida satu persatu dari ujung bebas
molekul DNA); dan endonuklease (memecah ikatan fosfodiester internal pada
molekul DNA). Contoh enzim ini misalnya S1-Nuclease, DnaseI, dan enzim
restriksi.
2. Ligase, menyambung potongan DNA menjadi satu. Contoh enzim ini hanya
ada satu yaitu DNA ligase.
3. Polimerase, mampu mensintesis untai DNA baru yang komplementer dari
cetakan DNA. Contoh enzim ini misalnya fragmen Klenow, T4-DNA
polimerase dan reverse transcriptase.
4. Enzim modifikasi, berperan untuk menghilangkan atau mengubah gugus
kimiawi. Contoh enzim ini yaitu alkalin fosfatse (memotong gugus fosfat
pada ujung -5’ molekluler DNA); polinukleoid kinase (menambah gugus

2
 3

fosfatpada ujung-5’ yang bebas); dan deoksinukleotidil transferase terminal

(menambah satu atau lebih deoksinukleotida pada ujung-3’ molekul DNA).
5. Topoisomerase, membuat atau mengubah DNA-supercoiled yang tertutup
secar kovalen.
Enzim manipulasi digunakan untuk pembuatan rekombinan DNA, yaitu
menyisipkan gen target berupa gen utuh atau sebagian ke dalam DNA vektor
seperti plasmid, kromosom artifisial bakteri (bacterial artificial chromosome,
BAC), YAC (yeast artificial chromosome), atau wahana kloning lain.
Untuk memanipulasi DNA, diperlukan beberapa perangkat penting
meliputi “gunting” untuk memotong molekul DNA, “lem/perekat” untuk
menggabungkan molekul DNA, dan “gergaji” untuk membelah molekul DNA.
1. Pemotongan molekul DNA
Pada proses pemotongan molekul DNA, “gunting” yang dimaksud
bukanlah gunting yang biasa kita pakai untuk memotong sesuatu, tetapi
merupakan suatu enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme tertentu. Enzim ini
dikenal dengan nama enzim restriksi. Setiap enzim restriksi mempunyai tempat
pemotongan yang spesifik pada suatu urutan molekul DNA. Sebagai contoh
adalah enzim EcoRI yang selalu memotong DNA pada posisi G ! AATTC (tanda !
merupakan tempat pemotongan), seperti terlihat pada molekul di bawah ini :
 4

Mekanisme pemotongannya adalah sebagai berikut:

Hingga saat ini, sudah ribuan enzim restriksi yang diperoleh dari
mikroorganisme. Beberapa diantaranya yang terkenal dan sering digunakan
adalah enzim EcoRV, HindIII, SacI, TaqI, BamHI, MspI dan lain-lain (tabel 1).
Tabel 1. Macam-macam Enzim Restriksi

2. Penggabungan molekul DNA

Proses penggabungan (ligasi) antara dua molekul DNA menggunakan
lem/perekat berupa enzim, yang dikenal dengan nama enzim ligase. Enzim ini
berfungsi mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan
 5

nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Berikut adalah contoh

penggabungan dua molekul DNA (A dan B) menjadi molekul AB :

Jadi, fungsi DNA ligase hanya membuat ikatan fosfodiester yang

menghubungkan basa G dan basa C pada urutan DNA bagian atas, dan basa C
dengan basa A pada urutan DNA bagian bawah.
Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA
polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan
nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan
memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida
berikutnya.
Enzim yang dipakai oleh orang-orang bioteknologi dalam memanipulasi
DNA diantaranya adalah enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-
batas sekuen nukleotida spesifik dan berfungsi dalam proses restriction atau
pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan enzim ini yang paling umum
antara lain pada sekuen palindromik.
Enzim ini dibentuk dari bakteri yang dibuat sedemikian rupa sehingga
dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom bacteriophage.Ada juga DNA
polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini
mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke
sel induk barunya.
Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak
mengherankan, karena semua organisme pasti harus meng-copy DNA mereka.
 6

Selain DNA polimerisasi, ada juga enzim RNA polimerisasi yang berfungsi untuk
membaca sekuen DNA dan mengsintesis molekul RNA komplementer.
Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak
ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus merekam gennya.
Selanjutnya yang akan dibahas adalah enzim DNA ligase. Enzim DNA ligase
merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan
genetik dengan bahan genetik yang lain.
Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung dengan DNA
(atau RNA) dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara DNA (atau RNA)
yang satu dengan lainnya. Ligasi adalah proses penyambungan antara satu
fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya.
Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector
pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri
adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan
untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC),
Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan Mammalian
Cell Vectors.
Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase.
Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang
telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert
(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian
pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.
Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang
mempunyai ujung tidak rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan ujung
rata (blunt end). Enzim ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan kovalen antara
gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan, yang menghendaki satu
nukleotida mempunyai ujung phosphate bebas dan nukleotida yang berdekatan
mempunyai ujung gugus hidroksil.
Enzim ligase tidak membedakan DNA-DNA dari organisme yang berbeda.
Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun dapat
digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian menjadi satu molekul
DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA rekombinan ini tidak dapat
 7

dilihat keberhasilannya kecuali dengan memperbanyaknya di dalam sel inang.

Proses ini disebut sebagai transformasi atau cloning gen.
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim
restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya,
fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi)
dengan DNAvektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat
digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro.
Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua,
ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan
bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama
hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua
dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul.
Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian
enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal
homopolimerik. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket
buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Suhu optimum
bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC.
Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di
antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas
akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya
dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang
diperpanjang (sering kali hingga semalam).
Pada reaksi ligasi antara fragmenfragmen DNA genomik dan DNA vektor,
khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga
plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid
sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi.
Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara
lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml),
perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari
ujung pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker,
molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk
menyintesis untai tunggal homopolimerik.
 8

Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen.

Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan
disambungkan mempunyai ujung tidak rata (sticky end), karena
penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan
A dan G berpasangan dengan C.
Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata (blunt end) dapat
disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata. Oleh
karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan
ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi
tertentu menggunakan ujung rata.
DNA rekombinan– teknik yang memungkinkan penggabungan 2 molekul
DNA yang berbeda, memperbanyaknya, dan memodifikasinya. Isolasi potongan
DNA diluar genomnya dan memperbanyaknya diluar selnya. Komponen yang
terlibat: enzim restriksi endonuklease dan DNA ligase.
Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan
sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom.
Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan bertujuan untuk merekombinasi
gen dalam tabung reaksi. Teknik DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik
memotong DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke
dalam sel hidup.
Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika ini
adalah suatu ilmu yang mempelajari pembentukan kombinasi materi genetik yang
baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan dalam suatu
sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Manfaat rekayasa genetika ini
diantaranya adalah dimungkinkannya melakukan isolasi dan mempelajari fungsi
masing-masing gen dan mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga
memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu
lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Sejak
jaman dahulu, nenek moyang kita telah mengetahui adanya keanekaragaman
makhluk hidup. Keanekaragaman makhluk hidup ini memungkinkan manusia
untuk memilih jenis makhluk hidup yang dikehendakinya. Salah satu upaya nenek
 9

moyang kita dalam memilih jenis makhluk hidup yang unggul adalah dengan
breeding atau mengawinkan beberapa spesies unggul untuk didapatkan keturunan
yang unggul pula dan memiliki sifat dari kedua induknya. Dengan semakin
berkembangnya ilmu genetika dan ditemukannya gen, maka manusia pun
memiliki alternatif lain yang lebih efektif yaitu melalui teknik rekayasa genetika
(Genetic Engineering) dengan cara melakukan perubahan langsung pada DNA.
Salah satu upaya yang dilakukan adalah dengan DNA rekombinan. Teknik DNA
rekombinan adalah suatu teknik di dalam rekayasa genetika untuk menghasilkan
sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom.
Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik untuk
merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik itu diantaranya isolasi DNA,
teknik memotong DNA, teknik menggabung DNA dan teknik untuk memasukan
DNA ke dalam sel hidup. Setelah DNA rekombinan terbentuk maka dilakukan
proses transformasi ke host cell kemudian dilkakukan proses inkubasi sel bakteri
tersebut. Setelah dilakukan inkubasi maka sel bakteri dapat kehadiran DNA
rekombinannya yaitu melalui uji antibiotik, uji medium seleksi dan seleksi putih
biru. Setelah didapatkan bakteri dengan DNA rekombinan maka dilakukan
purifikasi untuk mengisolasi gen yang direplikasi (Rifa’i, 2010).
Aplikasi manipulasi genetik biasanya berperan dalam beberapa hal yaitu
sebagai berikut ini (Fatchiyah, dkk., 2011: 41).
1. Mengetahui fungsi suatu gen secara in vivo atau in vitro.
2. Mutasi langsung atau tidak langsung dilakukan untuk lebih memperjelas
abnormalitas suatu gen atau ekspresi suatu gen.
3. Membuat marker (penanda) molekular, baik DNA, cDNA, ataupun cRNa
probe yang spesifik terhadap gen target. Selain itu juga dapat berperan untuk
menguji tingkat evolusi.
4. Pemetaan gen (gen mapping) dan proses pengmanan gen-gen target yang
akan diekspresikan (tagging).
5. Karakterisasi seks.
6. Karakterisasi keanekaragaman dan keragaman genetik.
 10

7. Aplikasi lain yang lebih spesifik di antaranya vaksin rekombinan, biosensor,

antibodi monoklonal, xenotransplantasi, pembuatan antibodi generasi baru,
serta deteksi bioterorisme.

B. KLONING GEN
Kloning berasal dari kata dasar Klon yang berasal dari bahasa Yunani klόόn
yang artinya tunas. Kloning adalah tindakan menggandakan atau mendapatkan
keturunan jasad hidup tanpa fertilisasi, yaitu dengan cara mengambil sel gamet
dari induk sehingga didapat keturunan yang mempunyai susunan (jumlah dan
gen) yang sama dan kemungkinan besar mempunyai fenotipe yang sama.
Klon gen atau molekuler, yaitu sekelompok salinan gen yang bersifat identik
yang direplikasi dari satu gen yang dimasukkan dalam sel inang Sehingga bisa
kita simpulkan bahwa kloning adalah proses reproduksi aseksual. Langkah dalam
kloning gen rekayasa genetika adalah sebagai berikut ini.
a. Isolasi gen target
b. Isolasi DNA plasmid
c. Manipulasi urutan DNA
1) Pemotongan- Enzim Restriksi
2) Penggabungan- DNA ligasi
d. Transformasi ke bakteri
e. Seleksi bakteri rekombinan (Widyastuti,2012).
Langkah-langkah kloning gen dapat dilihat pada gambar berikut ini.
 11

Gambar Langkah-langkah kloning gen

Penyimpanan Gen Hasil Pengkolonan dalam Pustaka DNA

Proses pengklonan yang diawali dengan campuran fragmen dari seluruh
genom sustu organisme, disebut pendekatan ‘shotgun’; tidak ada satu gen khusus
yang menjadi sasaran pengklonan. Ribuan plasmid rekombinan yang berbeda
dihasilkan pada langkah 3, dan klon sel-sel yang mengandung setiap tipe plasmid
akhirnya menjadi koloni putih. Perangkat lengkap dari klona sel pengandung
plasmid, masing-masin membawa salinan dari satu segmen tertentu dari genom
awal, disebut sebagai pustaka genom (genomic library). Setip ‘kolan plasmid’
dalam pustaka bagaikan buku yang berisi informasi spesifik. Kini, ilmuwan
seringkali memperoleh pustaka semacam itu (atau bahkan gen hasil klona
 12

tertentu) dari peneliti lain, sumber komersial, atau pusat sekuensing (Campbell,
dkk., 2008: 433).
Bakteriofag tertentu juga telah digunakan sebagai vektor pengklonan
untuk membuat pustaka genom. Fragmen-fragmen DNA asing dapat dismbung-
sambung ke dalam versi genom fag yang telah dipangkas rapi, seperti kedalam
palasmid, menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase. Proses infeksi normal
memungknkan produk dari banyak partikel fag baru, masing-masing mengandung
DNA asing. Keuntungan penggunaan fag sebagai fektor adalah satu fag dapat
membawa sisipan sebesar 25kb, sedangkan satu plasmid standar dapat membawa
sisipan DNA yang tidak lebih besar dari 12.000 pasang basa (12 kb). Pustaka
genom yang dibuat dengan menggunakan fag disimpan dalam koleksi klona fag.
Karena enzim-enzim restriksi tidak mengenali perbatasan gen, sejumlah gen pada
kedua tipe pustaka genom akan terpotong dan terbagi-bagi di antara dua klona
atau lebih.
Sebuah tipe vektor lain yang digunakan dalam pembentukan pustaka
adalah kromosom artifisial bakteri (bacterial artificial chromosome, BAC).
Terlapas dari anamnya BAC hanyalah plasmid besar, dipangkas sehinga hanya
mengandung gen-gen yang dibutuhkan untuk memastikan replikasi dan mampu
membawa sisipan sebesar 100-300 kb. Ukuran sisipan yang sangat besar
meminimalkan jumlah klona yang dibutuhakn untuk membuat pustaka genom,
namun jag menjadikan klona lebih menantang untuk digarap dla laboratorium.
Klona BAC biasanya disimpan dalam lempeng plastik dengan ruang bersekat-
sekat, dengan satu klona per ruang. Penyimpanan klona secara tertur,
diidentifikasi oleh lokasinya di lempeng, menjadikan penapisan (screening) yang
sanyat efisien dalam mencari gen yang dikehendari (Campbell, dkk., 2008: 433).
Para peneliti dapat membuat jenis lain dari pustaka DNA denngn
menggunakan mRNA yang diekstraksi dari sel sebagai materi awal. Enzim
transkriptase balik (diperoleh dari retrovirus) digunakan in vitro utuk membuat
trankrip DNA beruntai-tunggal dari molekul mRNA. Diketahui bersama bahwa
ujung 3/ mRNA memiliki serenteng ribonukleotida adeni (A) yang disebut ekor
poli-A. Ciri ini memungkinkan penggunaan satu untai pendek
deoksiribonukleotida timin (dT) sebagai primer untuk transkriptase balik. Setelah
 13

degredasi MRNA oleh enzim, untai DNA kedua, yang komplementer terhadap
untai DNA pertamaa, disintesis oleh DNA polimerase. DNA beruntai ganda yang
dihasilkan disebut DNA komplementer (complementary DNA, CCDNA). Untuk
menciptakan pustaka, cDNA dimodifikasi melalui penambahan sekuens
pengenalan enzim restriksi pada kedua ujungnya. cDNA kemudian disisipkan ke
dalam DNA vektor dengan cara yang serupa dengan penyisipan fragmen DNA
gemon. mRNA yang diekstraksi meurpakan campuarn semua molekul mRNA
dari sel-sel awal, ditrasnkripsikan dari banyak gen berbeda. Oleh karea itu, cDNA
yang diklona menyususn pustaka cDNA (cDNA library) yang mengandung
kumpulan gen. Akan tetapi, pustaka cDNA merepresentasikan hanya sebagaian
genom-hanya subset gen-gen yang ditranskripsikan dalam sel-sel asal mRNA
yang diisolasi (Campbell, dkk., 2008: 434).
Pengklonaan Eukariotik
Ahli biologi molekuler dapat menghindari ketidakcocokan eukariotik dan bakteri
dengan menggunakan sel-sel eukariotiks seperti khamir, bukan bakteri, sebagai
inang untuk pengklonaan dan pengekspresian gen-gen eukariotik yang
dikehendaki. Khamir, fungi bersel tunggal, menawarkan dua keuntungan: khamir
mudah ditumbuh seperti bakteri, dan memiliki plasmid, yang jarang dimiliki oleh
eukariotik. Ilmuwan bahkan telah membuat plasmid rekombinan yang
mengkombinasikan DNA khamir dan bakteri, serta dapat bereplikasi pada kedua
tipe sel. Satu lagi alat yang bermanfaat untuk mengklonan gen-gen eukariotik
kromosom artifisial khamir atau yeast artificial chromosome (YAC), yang
mengombinasikan bagian-bagian penting dari kromosom eukariotik-titik awal
replikasi DNA, sentromer dan dua telomer-denngan DNA asing. Vektor-vektor
serupa kromosom ini berprilaku seperti kromosom biasa saat mitosis, mengklona
DNA asing ketika sel khamir membelah. Karena YAC dapat mengnkut segmen
DNA yang jauh lebih panjang daripada vektor plasmid, Fragmen hasil klonal
lebih mungkin mengandung keseluruhan gen, daipada hanya sebagian (Campbell,
dkk., 2008: 435).
Alasan lain dari penggunaan sel-sel inang eukariotik untuk
mengekspresikan gen eukariotik hasil klona adalah bahwa banyak protein
eukariotik tidak akan berfungsi kecuali jika dimodfikasi setlah translasi, misalnya
 14

melaui pemabahan gugus-gugus ksrbohidrat atau lipid. Sel-sel bakteri tidak dapt
melaksanakan modifikasi ini, dan jika produk gen yang membutuhkan
pemrosesan semacam itu berasl dari mamlia, sel-sel khamir sekali pun mungkin
tidak mampu memodifikasi protein tersebut dengan benar. Oleh karena itu,
penggunaan sel inang dari kultur sel hewan mungkin dibutuhkan (Campbell, dkk.,
2008: 435).
.
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan materi, maka dapat disimpulkan sebagai berikut ini.
1. Enzim-enzim untuk manipulasi ini dapat dikelompokkan menjadi lima
golongan besar, yaitu nuklease, ligase, polimerase, enzim modifikasi, dan
topoisomerase.
2. Tahapan manipulasi DNA terdiri dari pemotongan molekul DNA dan
Penggabungan molekul DNA.
3. Klon gen atau molekuler, yaitu sekelompok salinan gen yang bersifat identik
yang direplikasi dari satu gen yang dimasukkan dalam sel inang.
4. Langkah dalam kloning gen rekayasa genetika adalah dimulai dari isolasi gen
target, isolasi DNA plasmid, manipulasi urutan DNA (pemotongan oleh
Enzim Restriksi dan penggabungan oleh DNA ligase), transformasi ke
bakteri, dan seleksi bakteri rekombinan.
B. Saran
Bagi penulis lain yang ingin membuat topik makalah yang sama,
sebaiknya ditmbah sumber referensi dari referensi terbaru dan lebih terpercaya

15
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, dkk. 2008. Biologi Jilid I. Terjemahan Damaring Tyas Wulandari.

2010. Jakarta: Erlangga.

Campbell,N. 2004. Biologi Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

Dinata, D. 2009.Bioteknologi.jakarta: Erlangga.

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekuler Prinsip Dasar Analisis. Jakarta:

Erlangga

Kohler G, Milstein C. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody

of predefined specificity. Ingris: Nature.

Kusuma, Sri A. F. 2010. PCR. Bandung: Universitas Padjadjaran.

Rifa’i, Muhaimin. 2010. Genetika Rekombinasi Dan Populasi. Malang:

Universitas Brawijaya.

Rosanti, Di. 2013. Kloning Gen. Jakarta: Erlangga

Suryo.1992.Genetika Strata 1. Universitas Gajah Mada: Jogjakarta

Sloanne, Ethel. 2007. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC

Widyastuti, Utut. 2012. Teknologi DNA Rekombinan. Bogor: IPB.