Establecimiento de suspensiones celulares

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Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura, Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las
Fuerzas Armadas – ESPE, Sangolquí, Ecuador
Fecha de entrega: agosto 18 del 2017

RESUMEN
El cultivo de suspensiones celulares facilita el intercambio gaseoso, la eliminación de la polaridad celular y la
eliminación de los gradientes en el medio y la superficie de la célula. Esta técnica es altamente empleada en la
producción de metabolitos secundarios, en el caso de Daucus carota, esta es empleada para la producción de
antocianas y proteínas extracelulares. En la práctica se sembraron pequeños agregados de callos friables de Daucus
carota (zanahoria) en medios de cultivo MS enriquecidos con 2.5mg/L de 2,4-D y 40g/L de azúcar (sin agar) para
evaluar el desarrollo celular; tanto a los 7 como 14 días de incubación no se lograron visualizar cambios
morfológicos en los agregados celulares y se descartó por completo la presencia de contaminación en los frascos.
Palabras claves: suspensión celular, Daucus carota, callo.
ABSTRACT
Culture of cell suspensions facilitates gas exchange, elimination of cell polarity and elimination of gradients in the
cell surface and medium. This technique is highly used in the production of secondary metabolites, in the case of
Daucus carota, this is used for the production of anthocyanins and extracellular proteins. In the practice, small
aggregates of friable callus from Daucus carota (carrot) were seeded in MS culture media enriched with 2.5 mg/L
of 2,4-D and 40 g/L of sugar (without agar) to evaluate cell development. After 7 and 14 days of incubation, we
were not able to visualize morphological changes in the cellular aggregates and the contamination in the flasks was
completely ruled out.
Keys Words: cell suspensions, Daucus carota, callus.

I. Introducción gaseoso, eliminación de la polaridad de las células

Daucus carota (zanahoria) pertenece a la familia
Apiaceae, la principal característica de esta familia es
su inflorescencia en umbela (García, B., 2016). La
determinación del color de las raíces de la zanahoria
depende de la concentración relativa de pigmentos
como clorofila, carotenoides, antocianina y licopeno
contenidos en las células parenquimatosas (Castañeda,
A. & Guerrero, J., 2015). Los alimentos ricos en estos
pigmentos tienen la capacidad de prevenir ciertas
enfermedades cardiovasculares, algunos tipos de cáncer
y el envejecimiento celular, debido a sus propiedades
antioxidantes (Simon, P., 1997).
El cultivo de suspensiones celulares facilita la
producción de metabolitos secundarios, porque
presenta ciertas ventajas en relación al cultivo de callo
en medio agar. El movimiento de las células en relación
con los nutrientes del medio facilita el intercambio
debido a la gravedad y eliminación de los gradientes de
nutrientes en el medio y en la superficie de las células
(García, B., 2016). Aunque en ocasiones el cultivo
puede ser afectado por la formación de espuma, a causa
de la viscosidad del medio (Mejía, A., 2004).
Los principales metabolitos secundarios encontrados en
la zanahoria son las antocianinas que pertenecen al
grupo de los flavonoides. Las antocianinas son
pigmentos solubles en agua y son responsables de la
mayoría de los colores rojo, rosa, morado y azul de las
plantas (Taiz, L., & Zeiger, E., 2006). Según Lachmana
& Hamouz (2005), la producción in vitro de
antocianinas puede ser potencializada utilizando
inductores y factores de estrés. Sudha & Ravishankar
(2003), reportaron aumento en la síntesis de
antocianinas en callos cultivados con metil jasmonato
y ácido salicílico, sustancias relacionadas con la
respuesta a estrés y la activación de mecanismos de
defensa en plantas, respectivamente.
En otras investigaciones de suspensiones celulares de
zanahoria han observado la presencia de proteínas
extracelulares específicas del desarrollo embriogénico.
Estas proteínas constituyen marcadores bioquímicos
del proceso embriogénico en plantas, permitiendo
predecir la embriogenicidad de un cultivo a los pocos
días de ser inducidas (Rodríguez, M., Cevallos, A. &
Montes, S., 2000)
En la práctica se sembraron fragmentos de callos de
Daucus carota en medios de cultivo Murashige Skoog
enriquecidos con 2.5mg/L de 2,4-D y 40g/L de azúcar
(sin agar), con el objetivo de evaluar la separación y
multiplicación de células de callo de Daucus carota en
medio líquido.
En las cámaras de la sala de siembra se retiraron los
callos de zanahoria de su antiguo medio, estos fueron
fraccionados con ayuda de pinzas y bisturí, hasta que se
obtuvieron agregados pequeños.
Se flameó la boca del frasco con medio y se colocaron
los callos en los medios líquidos estériles con ayuda de
pinzas estériles, posteriormente se flamearon de nuevo
las bocas de los frascos, precio a realizar su sellado con
dos capas de plástico para cocina y ligas a su alrededor
(Peña, 2017).
Incubación
Los frascos cultivados se trasladaron al área de
incubación y crecimiento, y se incubaron sobre un
agitador orbital a 80 rpm. En condiciones de oscuridad
(Peña, 2017).

III. Resultados
II. Métodos
Muestras
Las muestras empleadas fueron callos de zanahoria, los
cuales fueron proveídos por el Ing. Cristian Peña Msc.
del Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Universidad
de las Fuerzas Armadas ESPE.
Preparación del área de siembra
Se barrió el piso y se desinfectó con Kalipto. Las
cámaras de siembra se limpiaron con alcohol al 70% y
se ingresaron mecheros, bisturí, pinzas, servilletas,
medios de cultivo, lámpara de alcohol, ligas y recipiente
para lavados, previamente roseados con sablón. En la
parte exterior de la cámara se colocó la funda para
desechos y sobre las mesas sablón. Luego se conectaron
y encendieron las cámaras, se encendió la luz UV
durante 20 minutos, luego se procedió a apagar el UV y
a encender el flujo de aire (Peña, 2017). .
Medio de cultivo
El medio de cultivo utilizado para la siembra de cuatro
explantes, uno en cada medio, fue MS líquido (no
contuvo agar), enriquecido con 2.5 g/L de 2,4-D y 40 Figura 1. Resultados globales de las suspensiones celulares de callo
de zanahoria (Daucus Carota).
g/L de azúcar (Peña, 2017).
Siembra del material Las muestras para el establecimiento de
suspensiones celulares fueron tomadas de callo de
zanahoria (Daucus Carota). En el día cero se
colocaron 4 frascos en incubación con luz y otros
4 frascos en incubación con oscuridad. Se
evaluaron los resultados transcurridos 7 días tras la
siembra donde se pudo observar que ninguno de los
frascos observados en la (figura 1) presentaron
cambios tanto en su tamaño, coloración o número.
Por ello, no se realizó un análisis estadístico en el
programa Excel 2016 al no observarse cambios en
los callos o algún tipo de contaminación o
alteración fisiológica en el callo del que se pueda
hacer análisis.
IV. Discusión
El cultivo de células vegetales en suspensión es una
herramienta que permite conocer diversos aspectos
del cultivo, como su comportamiento metabólico,
fisiológico y bioquímico, así como controlar y
optimizar las condiciones de cultivo para la
producción de biomasa, o bien la producción de
metabolitos secundarios empleando diferentes
elicitores (Roca, 2011).
Esta estrategia requiere un proceso inicial que
incluye la formación de callo friable y
posteriormente el establecimiento de suspensiones
celulares, es por eso que para este estudio se trabajó
con callo formado a partir de zanahoria, Pérez
(2010) indica que la cantidad de callo a utilizar
puede ser desde 1 g a 20 g en 50 ml de medio de
cultivo, recalcando que mientras mayor cantidad
de inoculo inicial se utilice más será el tiempo de
establecimiento.
Para las suspensiones celulares de zanahoria se
utilizó frascos de vidrio de 100 ml con
aproximadamente 25 ml de medio de cultivo fresco
como lo indica Pérez (2005) se debe llenar el 1/5
de volumen del frasco a utilizar con medio fresco
para que el resto de volumen sirva para el
intercambio gaseoso de las células.
Manandhar (2007) menciona que el cultivo de
suspensiones celulares se da en cinco fases, de
retraso, exponencial, lineal, de desaceleración y
estacionaria. Tras 7 días de incubación no se
observó cambios significativos en 100% de los
frascos (Figura 1), estableciendo así que el cultivo
se encontraba aún en fase de retraso o latencia.
Según García (2016) durante el transcurso de esta
fase las células se adaptan a su nuevo entorno y por
tanto no se da la división celular. Sin embargo tener
una evidencia de división celular inmediata da
indicios de que el establecimiento de las
suspensiones celulares fue exitoso y las células han
superado la fase de adaptación de células
agrupadas en forma de callo y ahora en células
libres en forma de suspensión.
Por otro lado un importante factor para que el
cultivo de suspensiones celulares sea exitoso es el
medio de cultivo, para el trabajo se utilizó medio
de cultivo MS líquido enriquecido con; 2.5 mg/L
de 2,4-D y 40 g/L de azúcar y pH ajustado a 5.7-
5.8. Solis (2013) en su estudio indica que el uso de
medio de cultivo con una variación de
concentraciones de 1.5 a 2.5 mg/L de auxinas, 2,4-
D, no muestran diferencias significativas en el
proceso de crecimiento o aumento de volumen
celular.
V. Conclusiones
Al no identificar cambios significativos en el cultivo de
suspensión después de siete días de incubación, se
puede considerar que el callo de zanahoria no era friable
o que las células son incapaces de proliferar en el
medio nutritivo.
Además del medio de nutritivo y del uso de tejidos
viables en el cultivo de tejidos vegetales, existen otros
factores que afectan a los resultados obtenidos como la
calidad de los reactivos, las sustancias químicas
necesarias, la combinación apropiada de nutrientes y la
incubación.
Todos los frascos sembrados con callo de zanahoria en
medio de suspensión no presentaron contaminación, lo
cual fue favorecido por el empleo de callos de
zanahoria cultivados previamente in vitro en medio MS
enriquecido con 2,4-D con agar.
VI. Agradecimientos
Los autores desean agradecer y reconocer la
colaboración del Ing. Cristian Peña M.Sc. encargado de
la asignatura de Cultivo de Tejidos Vegetales en la Roca. (2011). Suspenciones celulares: descripción,
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Carrera de manipulación y aplicaciones. Bogotá: UIB.
Ingeniería en Biotecnología, y a su vez agradecer la
Rodríguez, M., Cevallos, A. & Montes, S. (2000).
ayuda brindada por los tesistas de la carrera en el
Proteínas extracelulares marcadas del
enfoque de preservar las normas de bioseguridad,
potencial embriogénico en suspensiones
manejo de equipos y seguimiento del protocolo durante
celulares de coffe spp. Cultivos tropicales, 11-
el proceso de desinfección y establecimiento de
15.
suspensiones celulares.
Simon, P. (1997). Plant pigments for color and
VII. Referencias
nutrition. HortScience, 12-13.
Aguirre & Montoya. (2009). Aspectos Ingenieriles del
Solis. (2013). Establishment of cell suspension
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cultures of two Costa Rican Jatropha species
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Castañeda, A. & Guerrero, J. (2015). Pigmentos en
frutas y hortalizas rojas: antocianinas.
http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?
action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=122,
35-33.
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García, B. (2016). Inducción y cultivo de células en
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VIDA Y LA AGRICULTURA. Sangolquí:
Universidad de las Fuerzas Armadas - ESPE.
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fuente de alimentos para el futuro. Revista
Digital Universitaria.
Pérez, J. (2010). Evaluación de la producción de
fotoquímicos a partir de cultivo de células en
la suspención de Nerium oleander.