Clase Métodos Curso Epigenoma A

07-09-2012
Herramientas metodológicas para el

estudio del genoma y la expresión
génica
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
Dr (C). Alejandro Vera Sánchez

Universidad Metropolitana
de Ciencias de la Educación
TEMARIO
Extrayendo información de genes y genomas
Aproximaciones metodológicas para el estudio de la expresión génica

Estudios de la expresión desde simples genes a genomas completos
Genómica funcional y transcriptómica
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“Genética Molecular”
Sólo en el sentido:
Uso de secuencias de nucleótidos y su variabilidad

Secuencias de nucleótidos
Desarrollo de metodologías de Laboratorio y
Poder computacional
PCR
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METODOS
A.- OBTENCIÓN DE MODELTEST
DATOS MOLECULARES
Extracción DNA total Máxima Verosimilitud (ML)
B.- Inferencias Máxima Parsimonia (MP)

Filogenéticas
Amplificación PCR Métodos Bayesianos.
Secuenciación BayesPh
Edición
Inferencia de BayesTr
estados ancestrales
Alineamiento
Estimación de
tiempos de divergencia:
Marcadores Moleculares
Son marcadores geneticos basados en la secuencia del ADN
Problema: como conseguir suficientes copias de un

gen para poder manipularlo y observarlo?
Polymerase Chain Reaction

PCR
3
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1° denaturar
2° alinear primers
3° amplificar Taq pol

Repetir (1,2 y3)

30 a 50 veces
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Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
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SECUENCIACIÓN DE ADN
Método enzimático de
terminación de cadena o
método didesoxi de
Sanger
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Método automático de
secuenciación
Problema:
1.- antiguamente la secuenciación del ADN era costosa
2.- habitualmente se trabaja con un único « gen »
3.- actualmente se requiere de evidencia independiente

“multiples genes”
7
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Utilizando pocos genes para reconstruir una filogenia

Problema: la secuenciacion del ADN es costosa
Otras maneras de caracterizar distintos alelos
1) Microarray
2) SSCP
3) RFLP
4) RAPD
5) Isoenzymas
(entre otros)
8
9
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Single Strand Conformational

Polymorphism
(SSCP)
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Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP)
Los individuos están caracterizados por una serie de

bandas (perfil de bandas) que representan la presencia
o ausencia de un sitio de restricción
Las bandas son distintos fragmentos de un mismo

sector del ADN (locus)
Equivale a una secuenciación parcial del ADN genómico
10
11
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Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP)
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Random Amplified Polymorphic DNA

(RAPD)
Porciones de ADN son amplificadas

azarosamente en cualquier parte del genoma
(nuclear y citoplasmático)
PCR
Espécimen
1
RAPDs
Espécimen
2
RAPDs + m
12
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La variabilidad
(presencia o ausencia
de una banda) esta
debida a mutaciones en
los sitios de fijacion de
los partidores
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 Cada banda es un
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 fenotipo « Presente » o
1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 « Ausente »
1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
6 perfiles = 6 fenotipos
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Problemas con los RAPDs
• La ausencia de una banda puede ser el

resultado de numerosas mutaciones
distintas en los sitios de partidores
Homoplasia
• Dos bandas de un mismo tamaño
pueden ser de secuencia totalmente
distinta
• Las bandas son fenotipos de un
carácter dominante (no se puede
determinar si es homocigoto o Dominancia

heterocigoto)
• Son muy sensibles a las condiciones de
PCR
• Son muy sensibles a la contaminación Falta de reproducibilidad
por otros organismos
Ventagas de los RAPDs
• Son fenotipos de caracteres heredables

• Marcan el genoma completo
• Son muchos loci independientes (no ligados físicamente)
=> la recombinación es el principal responsable de la
variabilidad genotípica
=> permite pruebas independientes de las hypotesis
• Su variabilidad es generalmente neutra frente a la selección

• Es relativamente económica y fácil de desarrollar
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Introducción
Los pro y contra de utilizar AFLPs:
Ventajas:
- Tiempos cortos y moderados costos de operación, permitiendo el estudio de

numerosos loci (>1000).
Desventajas:
- El tipo de información genética obtenida por locus es relativamente pobre:

“La presencia o ausencia de un fragmento de DNA puede ser detectada en un locus

dado, pero en la mayoría de los estudios es imposible separar entre genotipos
dominantes homocigotos (1/1) y heterocigotos (1/0)”.
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Generación e interpretación de datos
Alelo presente = 1
Alelo ausente = 0
Lectura automatizada de AFLPs (electrophenograma)

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Generación e interpretación de datos
Análisis Genético → ?
Antes de comenzar un proyecto, tener en cuenta dos importantes criterios (Mariette et al., 2002):
1) Marcadores numerosos pero menos informativos distribuidos azarosamente dentro
del genoma = AFLP.
2) Unos pocos marcadores altamente informativos = microsatélites, secuenciación de
DNA o SNPs.
1 = pobre → 5 = excelente
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El estudio de la expresión génica

El estudio de la expresión génica
En un mamífero una célula cualquiera puede expresar unas

5000 proteínas diferentes a partir de ~35000 genes.
La mayor parte de estas proteínas son necesarias para

cualquier tipo celular y normalmente se expresan en forma
constitutiva (housekeeping proteins housekeepingen).
Otras solo se encuentran presentes en algunos tipos celulares.
Como se regula este proceso?
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TRANSCRIPCION:
SINTESIS ENZIMATICA DE RNA (RNA POLIMERASA) UTILIZANDO UNA MOLECULA
DE DNA COMO TEMPLADO.
3 RNA Polimerasas
RNA polymerase I transcribes most rRNA genes
RNA polymerase II transcribes all protein-coding genes
RNA polymerase III transcribes tRNA genes and 5S rRNA genes
3 tipos de RNA
rRNAs
FORMAN PARTE ESTRUCTURAL DE LOS
RIBOSOMAS
mRNAs
CODIFAN PARA PROTEINAS
tRNAs
TRANSPORTAN AMINOACIDOS AL RIBOSOMA
20
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DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION

Promotor: secuencia río arriba del inicio de la transcripción donde se une el

complejo de transcripción incluyendo la RNA polimerasa.
Factor de transcripción: proteínas que regulan la expresión génica, se unen a
secuencias del DNA río arriba del sitio de inicio de la transcripción o al complejo
de transcripción, estimulando o reprimiendo la actividad del complejo.
DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION

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Factores generales de
transcripción
•TFIID: 2 subunidades (TBP y 1complejo de
10 TAFs)
•TFIIB: (1 proteína) media la interacción
entre TFIID y la Polimerasa
•TFIIF: (4 proteínas) estabiliza el complejo
DNA-TBP-TFIIB.
•TFIIE: (4 proteinas) regula TFIIH y en
conjunto promueven la formación la adición
del primer nucleotido del RNA.
•TFIIH: es el complejo de mayor tamaño (9
subunidades) actividad helicasa y de
reparación de DNA.
La RNA polimerasa (12 subunidades)

requiere de estos factores para
•Posicionar correctamente la enzima
•regular su actividad
Dominio CTD
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Existen complejos de proteínas

que integran señales de regulación
tanto de otros factores de
transcripción como de señales
provenientes de la célula
23
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Activación de la transcripción vía “mediator”

•Se unen a la RNA polimerasa

•Pueden regular la actividad de TFIIH CTD kinasa
Dominio CTD
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4
3
1
5
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28
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EXTRACCIÓN
DEL ARNm
1.-
29
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SINTESIS DEL
cDNA
2.-
30
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Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Microarray para detectar
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AGRADECIMIENTOS
A Luis Pastenes, U de Chile por su ayuda con la bibliografía
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
1.- Hoy., Marjorie. 2003. Insect Molecular Genetics , 2° edición, Academic Press, USA
2.- Moody, D.E., 2001. Genomics techniques: An overview of methods for the study of gene
expression. J Anim Sci 79:E128-E135.
3.-Stapley, Jessica, Reger, Julia , Feulner, Philine G.D. , Smadja, Carole ,Galindo, Juan ,
Ekblom, Robert, Bennison, Clair, Ball, Alexander D.,Beckerman, Andrew P. y Slate, Jon.
2010. Adaptation genomics: the next generation. Trends in Ecology and Evolution Vol.25
No.12
4.- Caruz, Antonio. Clases del curso “Genética Molecular”Universidad de Jaén.
33

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Extrayendo información de genes y genomas

Aproximaciones metodológicas para el estudio de la expresión génica

Estudios de la expresión desde simples genes a genomas completos

Genómica funcional y transcriptómica

Uso de secuencias de nucleótidos y su variabilidad

Extracción DNA total Máxima Verosimilitud (ML)

B.- Inferencias Máxima Parsimonia (MP)

Problema: como conseguir suficientes copias de un

Polymerase Chain Reaction

3° amplificar Taq pol

Repetir (1,2 y3)

Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis

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1.- antiguamente la secuenciación del ADN era costosa

2.- habitualmente se trabaja con un único « gen »

3.- actualmente se requiere de evidencia independiente

Utilizando pocos genes para reconstruir una filogenia

Problema: la secuenciacion del ADN es costosa

Otras maneras de caracterizar distintos alelos

Single Strand Conformational

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

Restriction Fragment Length Polymorphism

Los individuos están caracterizados por una serie de

Las bandas son distintos fragmentos de un mismo

Equivale a una secuenciación parcial del ADN genómico

Restriction Fragment Length Polymorphism

Random Amplified Polymorphic DNA

Porciones de ADN son amplificadas

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

Problemas con los RAPDs

• La ausencia de una banda puede ser el

determinar si es homocigoto o Dominancia

por otros organismos

Ventagas de los RAPDs

• Son fenotipos de caracteres heredables

• Su variabilidad es generalmente neutra frente a la selección

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

Los pro y contra de utilizar AFLPs:

- Tiempos cortos y moderados costos de operación, permitiendo el estudio de

- El tipo de información genética obtenida por locus es relativamente pobre:

“La presencia o ausencia de un fragmento de DNA puede ser detectada en un locus

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

Lectura automatizada de AFLPs (electrophenograma)

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

El estudio de la expresión génica

El estudio de la expresión génica

En un mamífero una célula cualquiera puede expresar unas

La mayor parte de estas proteínas son necesarias para

Otras solo se encuentran presentes en algunos tipos celulares.

Como se regula este proceso?

DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION

Promotor: secuencia río arriba del inicio de la transcripción donde se une el

DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION

La RNA polimerasa (12 subunidades)

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

Existen complejos de proteínas

Activación de la transcripción vía “mediator”

•Se unen a la RNA polimerasa

Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

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