DE MANUAL DE MICROBIOLOGIA-alimentos-2019-rone

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
CONTROL MICROBIOLOGICO DE
ALIMENTOS Y BEBIDAS
ALIMENTOS Y BEBIDAS
Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:
Bach. RONE QUEZADAPEÑA Q.F JIMY DAGA Q.F.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
INDICE
Pg.
I. INTRODUCCIÓN………….……………………………………………………….1
1.1. Objetivo………………………………………………………...………………1
1.2. Alcance………………………….…………………………………………...…1
1.3. Fundamento……………………………………………..………………......….1
II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS……………………...……………….1
2.1. Materiales………………………………………………………………………1
2.2. Equipos……………………….…………………………………………..….....2
2.3. Cultivos y reactivos……………………………………...……………….…….3
III. DESARROLLO…………………………………………….………….………….…4
3.1.Recuento de mesófilos…………………………………………….…………..….4
3.1.1. Preparación de medios de cultivo……..……………………..………...…..4
3.1.2. Preparación de disoluciones……………………………….…….……..….5
3.1.3. Duración del procedimiento……………………………….….………..….6
3.1.4. Método de siembra……………………………………….…….….………7
3.1.5. Recuento y selección de las colonias……………………………..………..8
3.1.6. Método de cálculo………………………………….………………..…......9
3.1.7. Referencia………………………………………………………………...10
3.2.Recuento de coliformes totales……………………………………………….….11
3.2.1. Preparación de medios de cultivo………………………...……………….….….12
3.2.2. Preparación de disoluciones……………….………………..………………..…..13
3.2.3. Duración del procedimiento………………………………………….…...14
3.2.4. Método de siembra………………………………………….………………....…15
3.2.5. Recuento y selección de las colonias………………...…….…………......16
3.2.6. Método de cálculo………………………..…………………………………......17
3.2.7. Referencia………………………………………………………………....18

ALIMENTOS Y BEBIDAS
3.3.Recuento de Bacillus cereus……………………………………………..….….…...…19

3.3.1. Preparación de medios de cultivo……………………….……….……......…..…20
3.3.2. Preparación de disoluciones……………….…………………………..…….…...21
3.3.3. Duración del procedimiento…………………………………….……...…22
3.3.4. Método de siembra……………………………………………………..……..….23
3.3.5. Recuento y selección de las colonias…………….………………...….…..24
3.3.6. Método de cálculo………………………..…………………………….….…....25
3.3.7. Referencia………………………………………………….....……...…...26
3.4.Numeración de Staphylococcus aureus………………………………..…………......27
3.4.1. Preparación de medios de cultivo….…….………………………………….…....28
3.4.2. Preparación de disoluciones……………………………….……………………..29
3.4.3. Duración del procedimiento………………………………………………30
3.4.4. Método de siembra………………………………….……………………………31
3.4.5. Recuento y selección de las colonias……………...……….……………..32
3.4.6. Método de cálculo………………………..……………………………………..33
3.4.7. Referencia………………………………………………………………...34
3.5. Detección de Salmonella spp………………………………………………….……35
3.5.1. Preparación de medios de cultivo……………………………………………….36
3.5.2. Preparación de disoluciones……………….……………………………………..37
3.5.3. Duración del procedimiento………………………………………………38
3.5.4. Método de siembra………………………………………………….……………39
3.5.5. Recuento y selección de las colonias……………………………………...40
3.5.6. Método de cálculo………………………..……………………….…...….…….41
3.5.7. Referencia…………………………………………………………….…..42

ALIMENTOS Y BEBIDAS
3.6.Recuento de mohos y levaduras……………………………….………………....43

3.6.1. Preparación de medios de cultivo……………………………….………….…....44
3.6.2. Preparación de disoluciones……………….………………………….………....45
3.6.3. Duración del procedimiento…………………………………….…..……46
3.6.4. Método de siembra…………………………………………………...………..…47
3.6.5. Recuento y selección de las colonias…………………………….………..48
3.6.6. Método de cálculo………………………..……………………..………...…….49
3.6.7. Referencia………………………………………………………..……….50

ALIMENTOS Y BEBIDAS
INTRODUCCIÓN
Laboratorios Fitogreen es una empresa peruana que elabora productos de una alta
calidad, con tecnología moderna para los procesos, dentro de sus políticas esta contar con
un programa de Higiene y saneamiento acorde a sus dimensiones, con una constante
supervisión del personal responsable de todas las áreas para mantener una limpieza total
y diaria, para la conservación fitosanitaria de toda la materia prima, insumos químicos y
productos terminados. En las instalaciones de esta empresa se lleva acabo controles de
calidad microbiológica, garantizando así la inocuidad de cada alimento y bebida
producida en cada jornada laboral. Esta empresa se alinea a los estándares de calidad
que exigen entes regulatorios nacionales como la Dirección General de Salud Ambiental
(Digesa) y transnacionales como la Organización Internacional de Estandarización (ISO)
que es una organización que cuenta con 163 países miembros en todo el mundo que
vigilan que los productos que se producen cumplan con el fin primordial de poder llevar
a la sociedad alimentos correctos que no atenten contra la salud pública y los
consumidores obtengan los beneficios que se ofrecen en cada uno de ellos, todo lo dicho
anteriormente se cumple mediante la realización de pruebas oficiales que demuestren
limites correspondientes y permitidos que aseguren la calidad del producto, por ello esta
empresa elabora este manual de procedimientos de control de calidad microbiológico a
sus alimentos y bebidas registrados, con la descripción de cada método, técnica y ensayo
declarado para la determinación de la ausencia de microorganismo patógenos causantes
de enfermedades o intoxicaciones alimentarias, que son una de las consecuencias más
graves, colaborando así con la producción de alimentos de un alto valor agregado y
totalmente inocuo que ayuden al crecimiento de esta empresa en el mercado.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
1. OBJETIVO
 Conocer el número de microorganismo patógenos y no patógenos que
contienen los alimento como producto en medio solido o líquido elaborados en
Laboratorios Fitogreen SAC.
2. ALCANCE
 Estos procedimientos se aplican para realizar métodos y técnicas para el
recuento de microorganismos capaces de crecer y formar colonias en un medio
tras la incubación a 30°C, en productos destinados al consumo humano basados
según las Técnicas descrita en las Normas ISO, como sus límites máximos, que
fundamentan el análisis de ciertos alimentos para consumo humano.
3. FUNDAMENTO
 Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la técnica comúnmente utilizada es el recuento en placa. En realidad,
esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes solo la variedad de especies y tipos diferenciables por sus
necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno
disponible, etc. El número de colonias contadas constituyen una estimación de
la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del
producto ha sido el adecuado.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
II. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

2.1.Materiales
 Placas de Petri de vidrio o plástico
 Pipetas de 1 ml
 Matraz
 Frasco de vidrio con tapa rosca
 Frasco de vidrio con gotero
 Tubos de vidrio
 Termómetro
 Varilla de vidrio
 Espátula
 Luna de reloj
 Papel crakf
2.2. Equipos
 Estufa de esterilización
 Autoclave
 Estufa de incubación: 30°C ± 1°C
 Baño de agua (44°C y 47°C)
 Equipo contador de colonias (opcional) ,
 Peachímetro de exactitud 0.1 a 25°C ± 1°C
 Equipo para mezclado (tipo stomacher)
 Agitador mecánico (tipo vortex)
 Asa bacteriologica
 Mechero bunsen
2.3.Medio de cultivo y reactivos

 Agua peptona bufferada (BPW)
 Solución salina peptonada (SFP)
 Agar Plate Count (PCA)
 Agar
 Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP)
 Solución de polimixina (106 U.I. en 100 ml)

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Emulsión de yema de huevo

 Agar base sangre
 Sangre de oveja desfibrinada
 Agar Baird Parker
 Solución de telurito de potasio al 1 %
 Caldo cerebro, corazón, infusión (caldo BHI)
 Plasma de conejo
 Caldo SX2.
 Caldo Müller-Kauffman tetrationato-novobiocina (MKTTn).
 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).
 Agar Hektoen.
 Agar nutritivo (AN).
 Agar TSAYE
 Agar Sulfito Bismuto según Blair (Opcionales)
 Agar Verde Brillante lactosa – sacarosa con novobiocina (BPLS)
 Agar Kligler
 Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC)
 Agar Diclorán 18% Glicerol (DG18
 Caldo Lauril Triptosa (CLT).
 Caldo lactosa.
 Medio EC
 Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovac
 Frascos gotero con indicador rojo de metilo
 Agua destilada

ALIMENTOS Y BEBIDAS
2.4. Recuento de microorganismos en alimentos
Existen diversos métodos para enumerar microorganismos en muestras de muy

diferente origen. Cada método tiene sus peculiaridades a la hora de transformar
los datos obtenidos en una densidad microbiana de la muestra estudiada, en
Unidades Formadoras de Colonias uf/c.
2.4.1. Consideraciones generales:
Cuando realizamos diferentes diluciones decimales y sembramos más de una

placa por dilución, a la hora de interpretar los resultados tenemos diferentes
posibilidades. Para la correcta aplicación de este método la preparación de la
muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a
partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado además de inocular los
volúmenes correctos ( 0,5 ml o 1 ml)
2.4.2. Rangos para el recuento:
Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades

formadoras de colonias UFC presentes en las placas que contengan entre 10
UFC y 300 UFC, los análisis que aplica dicho rango son:
Aerobios mesófilos; coliformes totales, Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, etc. Excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o
ausencia.
En nuestro caso utilizaremos el método más sencillo: seleccionaremos una
única dilución, aquella que produce entre 30 y 300 colonias por placa y
calculates la media de colonias obtenidas para la dilución seleccionada.
UFC/ml = A colonias enumeradas (media) X Factor de dilución

B ml sembrados

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Otra Técnica de enumeración habitual es el método del Número Más Probable

(NMP). Se trata de un método de enumeración basado en la estadística. Debe
determinarse un número característico que permite obtener el NMP. Resuelva los
siguientes problemas utilizando la Tabla de MacGrady que se adjunta.
Tabla de MacGrady (1 ml/tubo, 3 tubos/dilución, 3 diluciones
consecutivas). Resultado expresado como bacterias/ml
https://ocw.ehu.eus/pluginfile.php/1655/mod_resource/content/1/Tema_2._Metodos_basicos_de_enum
eracion_de_microorganismos.pdf
http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/microgeneral/wp-content/uploads/2017/02/06-RECUENTOS.pdf
III. DESARROLLO
AEROBIOS MESÓFILOS
2.1. Recuento de aerobios mesófilos
 Objetivo

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Conocer el número de microorganismo patógenos y no patógenos que contiene

la materia prima, los alimentos como producto en proceso y producto
terminado en forma solida o líquida elaborados en Laboratorios Fitogreen
SAC.
 Alcance
Este procedimiento se aplica para realizar un método horizontal para el
tras la incubación a 30°C. En productos destinados al consumo humano
basados según la Técnica descrita en la Norma ISO 4833:2003 que se
fundamenta el análisis de ciertos alimentos para consumo humano.
 Definición
La palabra mesófilos significa que son afines a temperatura media (30-37°C)
y la palabra aerobias que son dependientes de oxígeno. Refleja la calidad
sanitaria de los productos analizados, indicando además de las condiciones
higiénicas de la materia prima, la forma como fueron manipulados durante su
elaboración. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura
la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento
elevado no significa presencia de flora patógena.
 Justificacion
Los resultados de este análisis permitirán la verificación de la efectividad de
los procedimientos de limpieza y desinfección. También ayudara a determinar
el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los
alimentos.
2.1.1. Preparación de medios de cultivo

 Agua peptona bufferada (BPW)
Disolver 20 g de los componentes en 1 litro agua destilada, si es necesario
calentar. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Distribuir en

ALIMENTOS Y BEBIDAS
frascos o tubos de acuerdo a las necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C

durante 15 minutos.
 Agar plate count (PCA)
Disolver23.5g de los componentes en 1 litro de agua, si es necesario calentar
hasta la disolución completa del agar. Ajustar el pH si es necesario para
obtener un valor después de la esterilización de 7.0 ± 0.2 a 25°C según ficha
técnica
 Preparación de diluciones
Medir una cantidad del alimento liquido o solido en una proporción de 1/10.
Se pesará entonces de la muestra a analizar 10 ml o 10 g, a este se le agregará
90 ml de solución peptonada siendo la disolución inicial. Luego se usará una
pipeta de un 1ml esteril y se sacará un 1 ml y agregar a un tubo esteril
10-2
conteniendo una cantidad del diluyente igual a 9 ml (dilución )
homogenizar entre 1 minuto a 3 minutos dependiendo del alimento. Repetir
y transferir con otra pipeta esteril 1 ml de la segunda suspensión en un tubo
con 9 ml del diluyente estéril siendo esta suspensión 10-3. Para una óptima
precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la suspensión inicial y evitar
el contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente estéril.
2.1.2. Duración del procedimiento
 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial

y el instante en que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe
superar los 45 minutos, mientras que el lapso de tiempo límite entre la
preparación de la suspensión inicial y el comienzo de la preparación de las
diluciones decimales sucesivas es de 30 minutos.
2.1.3. Método de siembra
 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra

líquida de un tipo de dilución siendo mejor empezar tomando la de 10-2 a tres
placas con medio de cultivo según el método. Tomar otras 3 placas utilizando

ALIMENTOS Y BEBIDAS
otra pipeta estéril, 1 ml de la dilución 10-3. Si es necesario, se repite el

procedimiento con mayores diluciones, utilizando una pipeta estéril nueva para
cada dilución decimal. Se coloca 20 ml del agar PCA enfriado a 44°C - 47°C
en cada placa de Petri, evitando verter directamente el medio sobre el inóculo.
Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo por rotación
suave de la placa de Petri. Se colocan las tapas y se deja solidificar sobre una
superficie horizontal fría, a temperatura ambiente
 Incubación:
Después de la completa solidificación del medio y solo en los casos en que se
sospeche que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la
superficie del medio, verter 4 ml del agar para cubrir (AC) o agar PCA a 44°C
- 47°C sobre la superficie del medio inoculado dejar solidificar. Se invierten
las placas y se incuban en la estufa a 30°C±1°C por 72 h ± 3 h.
2.1.4. Recuento y selección de las colonias
 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas

que, de ser posible, tengan menos de 300 colonias. Contar las colonias, si es
necesario utilizando el equipo contador de colonias. Examinar las placas bajo
una luz tenue. Es importante que las colonias diminutas sean incluidas en el
recuento sin confundirlas con partículas insolubles o precipitadas del alimento.
 Si menos de un cuarto (1/4) de la placa está cubierto por un crecimiento difuso
o diseminado, se cuentan las colonias en la parte de la placa no afectada y se
calcula el número correspondiente para la placa de Petri entera, deduciéndolo
por extrapolación del número teórico que debería corresponder a la placa
entera. Si hay sobrecrecimiento en un área superior a un cuarto de la placa, se
rechaza este recuento.
2.1.5. Método de calculo
 Para que el recuento sea válido, se suele considerar necesario que el recuento
de colonias se realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 10
colonias. El número de microorganismos N presentes en la muestra para
análisis se calcula como la media corregida de dos diluciones consecutivas,

ALIMENTOS Y BEBIDAS
utilizando la ecuación.
Dónde:
∑C: es la suma de las colonias contadas en dos placas de las dos diluciones
consecutivas, de las cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias;
V: es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;
d: es la dilución correspondiente a la primera dilución elegida (d = 1 cuando
se utiliza el producto líquido sin diluir).
N=∑C. D, V
2
Ejemplo 1: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:
Para la primera dilución escogida (10-2): 170 colonias
Para la segunda dilución (10-2): 190colonias.
Placa 01 = 170 colonias x 102 = 17000
Placa 02 = 190 colonias x 102 = 19000
Promedio (17000+19000) /2 = 18000
 Redondeando el resultado como se indicó, el número de microorganismos es de

18.000 o 1.8 x 103 por mililitro o por gramo de producto.
 Si la dilución más concentrada sembrada fue: 10-1 entonces se dirá que los
microorganismos presentes están a un nivel de 10-1 < 10 UFC /ml o g. Si la última
dilución sembrada fue: 10-2 entonces se dirá que los microorganismos presentes
están a un nivel < 100 UFC /ml o g. Pero si está a 10-3 estará a > 3x105 UFC/ml o
g.
2.1.6. Referencia
 International Standard Organization. ISO 4833-1: 2003. Microbiology of food

chain. Horizontal method for the enumeration of microorganisms. Part 1:
Colony count at 30°C by the pour plate technique. Disponible en:

ALIMENTOS Y BEBIDAS
https://www.iso.org/standard/34524.html
 Laboratorio de control ambiental Digesa-Minsa. Listado de ensayos

implementados versión 05. Disponible en:
http://www.digesa.minsa.gob.pe/LAB/AC-LI-
05_Lista_Ensayos_implementados_V05_Rev_02_20-09-2017.pdf
 Dorigon F; Duarte R; Santo A. Determinação da contagem global de

microrganismo mesófilos aeróbios em amostra de milho (Zea mays, l)
Triturado. Anais Colóquio Estadual de Pesquisa Multidisciplinar (ISSN-2527-
2500), 2018, 2(2): Disponible en :
http://unifimes.edu.br/ojs/coloquio/user/setLocale/de_DE?source=%2Fojs%2
Findex.php%2Fcoloquio%2Farticle%2Fview%2F342%2F0
Bacillus cereus
2.2. NUMERACIÓN DE Bacillus cereus

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Objetivo
Conocer el número de Bacillus cereus que contiene la materia prima, los

alimentos como producto en proceso y producto terminado en forma solida o
líquida elaborados en Laboratorios Fitogreen SAC.
 Alcance
tras la incubación a 30°C. En productos destinados al consumo humano
basados según la Técnica descrita en la Norma ISO 4833:2003 que se
 Definición
Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, anaerobio facultativo y móvil
debido a la presencia de flagelos perítricos, forma esporas resistentes a
condiciones adversas del medio, como altas temperaturas, deshidratación y
radiación, y produce diversas toxinas que contaminan gran variedad de
alimentos. Es capaz de crecer desde los 4 °C a 48 °C, a pHs de 4,9 a 9,3 y
soporta concentraciones de NaCl en el medio hasta del 7 %. Las esporas son
resistentes a tratamientos térmicos como la pasteurización o procesos de
cocción de los alimentos y al ácido clorhídrico presente en el estómago, lo que
constituye un peligro potencial para la salud humana,
 Justificacion
alimentos.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Disolver 20 g de los componentes en 1 litro agua destilada, si es necesario

calentar. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Distribuir en
frascos o tubos de acuerdo a las necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C
durante 15 minutos.
 Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP):
Disolver 111 gr de los componentes en 1 l agua destilada, por calentamiento
y agitación. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor después de la
esterilización de 7.4 ± 0.2 a 25°C. Fraccionar 90 ml del medio en recipientes
de capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, luego enfriar
hasta 45C°.
 Emulsión de yema de huevo:
Usar huevos de gallina frescos, limpios y con sus cáscaras intactas. Lavar los
huevos, usando procedimientos asépticos, romper cada huevo y separar la
yema de la clara por repetidas transferencias de la yema de una mitad de la
cáscara del huevo a la otra. Poner las yemas en un recipiente con graduación y
agregar cuatro partes en volumen de agua estéril. Transferir asépticamente a un
recipiente estéril y mezclar vigorosamente. Calentar la mezcla durante 2 h en
baño de agua a 44°C - 47°C. Luego dejar durante 18 h a 24 h a 3°C ± 2°C para
permitir que se forme un precipitado. Recoger el sobrenadante asépticamente.
La emulsión puede ser guardada a 3°C ± 2°C durante no más de 72 h.
Agregando 50 ml de la emulsión a la mezcla.
 Solución de sulfato de polimixina b:
Luego de enfriar el agar MYP, agregar los 50 ml emulsión de yema de huevo,
agregar un 1 vial de Polixima B, luego de haber disuelto en agua destilada.
 Sangre de oveja desfibrinada

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 47°C. Agregar la sangre

desfibrinada. Mezclar. Verter aproximadamente al menos 15 ml del medio en
placas de Petri estériles y dejar solidificar.
2.2.2. Preparación de disoluciones
Medir una cantidad del alimento liquido o solido en una proporción de 1/10.
Se pesará entonces de la muestra a analizar 10 ml o 10 g, a este se le agregará
90 ml de solución peptonada siendo la disolución inicial. Luego se usará una
pipeta de un 1ml esteril y se sacará un 1 ml y agregar a un tubo esteril
conteniendo una cantidad del diluyente igual a 9 ml (dilución10-2)
homogenizar entre 1 minuto a 3 minutos dependiendo del alimento. Repetir
y transferir con otra pipeta esteril 1 ml de la segunda suspensión en un tubo
con 9 ml del diluyente estéril siendo esta suspensión 10-3. Para una óptima
precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la suspensión inicial y evitar
el contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente estéril.

 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra

líquida de un tipo de dilución siendo mejor tomar la de 10-2 a 10-3 en tres placas
de agar MYP según el método. Distribuir 1 ml del inóculo en la superficie de
una placa de Petri con agar MYP o en tres de placas con agar MYP utilizando
Asa bacteriologica. En ambos casos preparar duplicados usando dos placas o
seis placas. Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la superficie
del medio sin tocar los bordes de las placas con una espátula estéril. Utilizar

ALIMENTOS Y BEBIDAS
una espátula para cada placa. Dejar las placas con la tapa puesta por 15 minutos
a temperatura ambiente para permitir que el inóculo sea absorbido en el agar.
Invertir las placas e incubarlas a 30°C entre 24 horas a más según indica el
producto.
 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas,

preferiblemente en dos diluciones sucesivas, en las que el recuento sea menor
a 150 colonias, contar en cada placa las colonias con características de colonias
presuntas de Bacillus cereus. Las colonias presuntas son grandes, rosas
(indicando que no ocurre fermentación del manitol) y generalmente rodeadas
de una zona de precipitación (producción de lecitinasa).
 Nota 1. Si las placas contienen numerosos organismos fermentadores de
manitol que producen ácido, la característica de color rosa de las colonias de
Bacillus cereus puede reducirse o desaparecer por completo.
 Nota 2. Algunas cepas de Bacillus cereus producen poco o nada de lecitinasa.
Las colonias deberían también ser sometidas al test de confirmación.
 Confirmación Tomar las colonias presentes, confirmar esas colonias como se
especifica, estriar 5 colonias presuntivas en placas con el medio selectivo
(MYP). Incubar las placas a 30°C durante 18 h a 24 h.
 Test de hemólisis en agar sangre de oveja
Estriar, pinchar o sembrar como mancha las colonias seleccionadas a partir de

las placas de MYP en la superficie de agar sangre de oveja de modo de obtener
colonias aisladas que permitan una buena interpretación de la reacción de
hemólisis. Incubar a 30°C durante 24 h y leer la reacción de hemólisis. Cada
colonia rodeada de una zona clara se considera hemólisis positiva.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Método de cálculo después de la confirmación:
En este método donde se requiere de una confirmación para el recuento, se

identifica un número de colonias sospechosas (A) que se someten a
confirmación. Tras la confirmación se calcula el número de colonias de cada
placa (a) que cumplen con los criterios de la confirmación, utilizando la
ecuación.
El recuento ha proporcionado los siguientes resultados
Para la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias
Realizando el análisis de las colonias escogidas: de las 66 colonias, se

analizaron 8 y 6 dieron positivo todas cumplieron con los criterios, por
consiguiente, a = 50 de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por
consiguiente, a =
X= 4,9 x 104 por mililitro o por gramo de producto.
∑C = 50 + 4 = 54 =
N 4909
V× 1,1. d 1 × 1,1 × 10−3 1,1 × 10−3
= 0

ALIMENTOS Y BEBIDAS
2.2.7. Referencia
 International Standard. ISO 7932: 2004 (E). Microbiology of food an animal feeding
stuffs. Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus. Colony
- count technique at 30°C. Third edition, 2004-06-15. Disponible en:
 Laboratorio de control ambiental Digesa-Minsa. Listado de ensayos implementados
versión 05. Disponible en: http://www.digesa.minsa.gob.pe/LAB/AC-LI-
 Sánchez J, Correa M, Castañeda L. Bacillus cereus un patógeno importante en el control
microbiológico de los alimentos: um patógeno importante no controle microbiológico
dos alimentos. Rev. Fac. Nac. Salud Pública [Internet]. 2016 Aug
[cited 2019 Apr 04]; 34(2):230-242. Disponible en:
http://dx.doi.org/10.17533/udea.rfnsp.v34n2a12.
Staphylococcus aureus
2.3. Numeración de Staphylococcus aureus
 Objetivo
Conocer el número de Staphylococcus aureus que contienen los alimento o

bebidas elaborados en Laboratorios Fitogreen SAC.
 Alcance

ALIMENTOS Y BEBIDAS

recuento en placa de microorganismos capaces de crecer y formar colonias en
un medio tras la incubación a 30°C. En productos destinados al consumo
humano basados según la Técnica descrita en la Norma ISO 4833:2003 que se
 Definición
Los estafilococos son un amplio grupo de bacterias Gram-positivas, es una de
las principales bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA). Dicha contaminación generalmente se presenta por el
contacto del alimento con los manipuladores que se encargan de producirlos,
es decir, con las personas que están en contacto directo con los alimentos.
 Justificacion
alimentos.

Disolver los componentes en agua destilada, si es necesario calentar. Ajustar el
pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Distribuir en frascos o tubos de
acuerdo a las necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
 Solución salina peptonada (SFP)

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar el pH a 7.0

± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las
necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
 Agar Baird Parker
Dependiendo de la firmeza del agar, disolver los componentes en agua hasta
ebullición. Ajustar el pH para que luego de la esterilización su valor sea de 7.0
± 0.2 a 25°C. Fraccionar en volúmenes de 100 ml en frascos o botellas de
capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
 Agar telurito de potasio
Disolver completamente el telurito de potasio en agua destilada con mínimo
calentamiento. Esterilizar por filtración utilizando membrana con poros de 0.22
µm de tamaño. Conservar a 3ºC ± 2ºC por un máximo de 3 meses. Descartar la
solución si se forma un precipitado blanco.
 Emulsión yema de huevo
Lavar los huevos con cepillo utilizando detergente líquido, enjuagar con agua y
desinfectar sumergiéndolos en etanol (solución 70%) durante 30 segundos y
dejar secar al aire o rociarlos con alcohol y esterilizar a la llama. En condiciones
asépticas romper cada huevo, separar la yema de la clara pasando la yema varias
veces de una mitad de la cáscara a la otra. Colocar las yemas en un frasco
estéril y agregar 4 veces su volumen de agua estéril y mezclar perfectamente.
Calentar la preparación en baño de agua a 47ºC durante 2 horas y dejar de 18 h
a 24 h a 3ºC ± 2ºC hasta que se forme un precipitado. Asépticamente recolectar
el sobrenadante y conservar en un frasco estéril. La preparación se debe
conservar a 3ºC ± 2ºC, durante un máximo de 72 h.
 Medio completo
Fundir el medio base, enfriar aproximadamente a 47ºC y agregar en condiciones

de asepsia la solución de telurito de potasio y la emulsión yema de huevo. Cada
solución debe ser previamente calentada a 47ºC en baño de agua y mezclar bien
después de cada adición.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Tabla 1. Composición
Agar Baird Parker 100 ml

Solución Telurito de potasio 1.0 ml
Emulsión yema de huevo 5.0 ml
 Caldo cerebro corazón infusión (BHI)
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el pH
para que luego de la esterilización su valor sea de 7.4 ± 0.2 a 25°C. Dispensar en
porciones de 10 ml o 5 ml en tubos. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
 Plasma de conejo
Utilizar plasma de conejo deshidratado disponible en el comercio y rehidratar

siguiendo las indicaciones del fabricante. Si el plasma de conejo no está
disponible en el comercio diluir un volumen de plasma de conejo fresco estéril
con tres volúmenes de agua destilada estéril.
 Si se ha utilizado citrato de sodio o citrato de potasio como anticoagulante,
agregar solución de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) para llegar a una
concentración de EDTA del 0.1 % en el plasma diluido.
 Nota: el plasma con oxalato o heparina no requiere del agregado de EDTA. El
plasma rehidratado o diluido debe ser utilizado inmediatamente al menos que el
fabricante de otras especificaciones. Antes de utilizar cada lote de plasma
realizar un control con una cepa de estafilococo coagulasa positiva y una cepa
de estafilococo coagulasa negativa.
 Medir una cantidad de masa (g) o volumen (ml) como mínimo del alimento
liquido o solido en una proporción de 1/10, y si agrega de la muestra 10 ml o g
a este se le agregará 90 ml de solución peptonada siendo la disolución inicial.
Luego sacar con una pipeta un 1 ml y agregar a una cantidad del diluyente igual
a 9 x ml (dilución 10-2) y homogeneizar entre 1 minuto a 3 minutos dependiendo
del alimento. Repetir y transferir con una pipeta 1 ml de la segunda suspensión

ALIMENTOS Y BEBIDAS
en un tubo con 9 ml del diluyente estéril siendo esta suspensión 10-3. Para una
óptima precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la suspensión inicial y
evitar el contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente estéril.

 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y
el instante en que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe
 Inoculación: Transferir 1 ml de la suspensión inicial (dilución 1/10) en caso de

otros productos y las diluciones sucesivas preparadas, por triplicado a placas con
agar Baird Parker. Si para ciertos productos es necesario realizar un recuento de
un número bajo de estafilococos coagulasa positiva, el límite de detección puede
ser elevado por un factor de 10 sembrando 1 ml de la muestra si el producto es
líquido ó 1 ml de la suspensión inicial (dilución 1/10) en caso de otros productos,
y 1 ml de las diluciones sucesivas preparadas según, en una placa de Petri grande
con agar Baird Parker o en tres placas de Petri de 90 mm con agar Baird Parker.
En ambos casos, sembrar por triplicado utilizando 3 placas. Cuidadosamente
dispersar el inóculo sobre la superficie del agar con una espátula de Drigalsky lo
más rápido posible, tratando de no tocar los bordes de la placa.
 Incubación: Dejar secar las placas sin invertir, con la tapa puesta durante 15
minutos a temperatura ambiente. Invertir las placas sembradas e incubar a 35ºC
ó 37°C durante 24 h ± 2 h y luego 24 h ± 2 h adicionales.
 Después de la incubación de 24 h ± 2 h marcar en el fondo de la placa la posición

de cualquier colonia típica presente. También marcar las colonias atípicas

ALIMENTOS Y BEBIDAS
presentes. Tener en cuenta para el recuento sólo las placas que contienen como
máximo 300 colonias totales con 150 colonias típicas y/o atípicas hasta dos
diluciones sucesivas. Una de las placas debe contener al menos 15 colonias.
Seleccionar para la confirmación un número A de colonias (en general 5 colonias
típicas si sólo hay colonias típicas o 5 colonias atípicas si sólo hay colonias
atípicas o 5 colonias típicas y 5 colonias atípicas si se encuentran presente ambos
tipos en cada placa). Si en la placa hay menos de 15 colonias típicas y/o atípicas
inocular con el producto líquido sin diluir o con la más baja dilución de los otros
productos. Es posible realizar un recuento estimado como se describe.
 Nota 1: Las colonias típicas son negras o grises, con brillo y convexas (de 1 mm
a 1.5 mm de diámetro después de una incubación de 24 h y de 1.5 mm a 2.5 mm
de diámetro después de una incubación de 48 h) y rodeadas por una zona de
clarificación que puede ser parcialmente opaca. Después de una incubación de
por lo menos 24 h puede aparecer un anillo opalescente de precipitación
inmediatamente alrededor de la colonia. Las colonias atípicas son del mismo
tamaño que las típicas y pueden presentar una de las siguientes morfologías:
Colonias negras con brillo, con o sin un fino borde blanco, la zona de
clarificación está ausente o es vagamente visible y el anillo opalescente ausente
o poco visible. Colonias grises sin zona de clarificación.
 Nota 2: Las colonias atípicas son formadas principalmente por cepas de
estafilococos coagulasa positiva presentes por ejemplo en productos lácteos,
camarones y menudencias. Con menos frecuencia son formadas por cepas de
estafilococos coagulasa positiva presentes en otros productos.
 Nota 3: Algunas bacterias pertenecientes a otros géneros pueden dar colonias de
apariencia similar a las de estafilococos, pero realizando una observación
microscópica con coloración de Gram antes de la confirmación se puede realizar
una separación de géneros.
 Nota 4: Las colonias restantes que pueden estar presentes en la placa y que no
presentan apariencia de colonias típicas (NOTA 1) o atípicas (NOTA 2) son
consideradas como flora acompañante. Para realizar un recuento estimativo de

ALIMENTOS Y BEBIDAS
un bajo número de estafilococos coagulasa positiva retener todas las placas que
contienen colonias típicas y atípicas, seleccionar todas las colonias para la
confirmación dentro de los límites establecidos arriba.
 Confirmación: prueba de la coagulasa: De la superficie de cada colonia
seleccionada remover un inóculo con ansa aguja y transferir a un tubo con caldo
cerebro corazón infusión (caldo BHI), incubar a 35ºC ó 37°C durante 24 h ± 2 h.
Asépticamente agregar 0.1 ml de cada cultivo en 0.3 ml de plasma de conejo (a
menos que otra cantidad sea especificada por el fabricante) en un tubo de
hemólisis estéril. Incubar a 35ºC ó 37°C.Inclinando el tubo observar la formación
de coágulo después de 4 h a 6 h de incubación. Si la prueba es negativa
reexaminar después de 24 h de incubación o examinar en el tiempo de incubación
especificado por el fabricante. Considerar un resultado positivo si el volumen del
coágulo formado ocupa más de la mitad del volumen del líquido original. Como
control negativo para cada lote de plasma agregar 0.1 ml de caldo BHI estéril a
0.3 ml de plasma de conejo e incubar sin inoculación. Para que la prueba sea
válida el control negativo no debe mostrar signos de coagulación.
Cálculo del número a de estafilococos coagulasa positiva identificados por cada

placa seleccionada:
Calcular para cada una de las placas seleccionadas el número a de estafilococos
coagulasa positiva identificados de acuerdo a la siguiente ecuación:
Dónde:
Ac: es el número de colonias típicas sometidas a la prueba de la coagulasa

Anc: es el número de colonias atípicas sometidas a la prueba de la coagulasa
bc: es el número de colonias típicas que dieron positiva la prueba de la coagulasa
bnc: es el número de colonias atípicas que dieron positiva la prueba de la
coagulasa
Cc: es el número de total de colonias típicas que se contaron en la placa

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Cnc: es el número de total de colonias atípicas que se contaron en la placa

Redondear a un número entero.
 Cálculo del número n de estafilococos coagulasa positiva:
Para las placas que contienen un máximo de 300 colonias con 150 colonias
típicas y/o atípicas en dos diluciones consecutivas calcular el número de
estafilococos coagulasa positiva para cada placa como se especifica en y calcular
como un promedio de las dos diluciones sucesivas, el número N de estafilococos
coagulasa positiva identificados, presentes en la porción de muestra sembrada,
utilizando la siguiente ecuación:
Dónde:
Σa: es el número de colonias de estafilococos coagulasa positiva identificadas en

todas las placas seleccionadas
V: es el volumen de inóculo en cada placa en mililitros
n1: es el número de placas seleccionadas de la primera dilución
n2: es el número de placas seleccionadas de la segunda dilución
d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada

Redondear el resultado calculado a 2 cifras significativas.
Informar el resultado como el número de estafilococos coagulasa positiva por

mililitro (productos líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un
número entre 1.0 y 9.9 inclusive multiplicado por 10x donde x es la potencia
apropiada de 10.
Ejemplo: El recuento después de la inoculación con 0.1 ml del producto dio los
siguientes resultados:
Para la primera dilución seleccionada (10-2): 65 colonias típicas y 85 colonias

ALIMENTOS Y BEBIDAS
típicas, no hay colonias atípicas

Para la segunda dilución seleccionada (10-3): 3 colonias típicas y 7 colonias
típicas, no hay colonias atípicas
Se obtuvieron los siguientes datos:
De las 65 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y
todas dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 65
De las 85 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y 3
colonias dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 51
De las 3 colonias todas fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y 3 colonias
dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 3
De las 7 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y todas
dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 7
∑C = 65+51+3 + 7 =57272
N=
V(n1+0,1Xn2)d 0.1(2+0,1x2)10−2
El resultado después de redondear se expresa como: 5.7 x103
2.3.7. Referencia
 International Standard. ISO 6888 – 1. Microbiology of food and animal feeding stuffs.
Horizontal method for the enumeration of coagulase - positive staphylococci
(Staphylococcus aureus and other species). Part 1: Technique using Baird Parker agar
medium. First edition 1999-02-15. Disponible en:
https://www.sis.se/api/document/preview/615553/

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 ICMSF. Microorganismos de los Alimentos I. Editorial Acribia.2000.Pp.131-134

 Laboratorio de control ambiental Digesa-Minsa. Listado de ensayos implementados
 Jordá G., et al. Portación y caracterización de Staphylococcus aureus en manipuladores
de alimentos. Revista argentina de microbiología, 2012,44(2): Disponible en:
.https://www.redalyc.org/html/2130/213024208009/
Salmonella spp.
2.4. DETECCION DE Salmonella spp.
 Objetivo
Conocer el número de Salmonella spp. que contienen los alimento o bebidas

elaborados en Laboratorios Fitogreen SAC.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Alcance
 Definición
Salmonella es un género de bacilos gram negativos es una bacteria
omnipresente y resistente que puede sobrevivir durante varias semanas en un
ambiente seco y varios meses en agua. La infección por Salmonella spp. están
asociada con la ingestión de alimentos preparados o manipulados
inapropiadamente o previamente contaminados.
 Justificacion
alimentos.



ALIMENTOS Y BEBIDAS

 Agar TSAYE
Suspender gramos del medio en agua destilada. Mezclar bien y disolver por
calentamiento con agitación frecuente. Hervir durante un minuto hasta su
completa disolución. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50ºC, mezclar bien. y dispensar en platos. El medio preparado
debe almacenarse a 8-15 ° C. El color es ámbar, ligeramente opalescente.
 Agar Sulfito Bismuto según Blair
Suspender gramos del medio en agua destilada. Mezclar bien y calentar
agitando continuamente. Hervir durante un minuto o hasta que el medio se
disuelva por completo. No autoclavar.
Dejar que el medio se enfríe a 45ºC (muy importante) y sin dejar de agitar verter
en placas de Petri. El color del medio preparado es blanco opaco con tinte
verde. El medio preparado en placa debe conservarse entre 8-15°C.
 Agar nutritivo (AN).
Rehidratar g del medio en agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para
disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión)
durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC. Vaciar en cajas de Petri
estériles. Conservar en refrigeración de 2 a 8ºC.
 Agar XLD (Agar Xilosa Lisina Desoxicolato)

Suspender 55.2 gramos del medio en un litro de agua destilada. Calentar
agitando frecuentemente. Dejar hervir durante un minuto o hasta disolución
completa. No autoclavar. Distribuir en recipientes adecuados. Las placas

ALIMENTOS Y BEBIDAS
preparadas deben almacenarse entre 8-15°C. El color del medio preparado es

rojizo naranja
 Agar Hektoen.
Disolver g en agua desmineralizada y dejar empapar durante 10 minutos.
Calentar y llevar a ebullición unos pocos segundos para disolver el medio
completamente. No esterilizar en autoclave.
 Caldo Müller-Kauffman tetrationato-novobiocina (MKTTn).
Caldo Tetrationato según Mueller-Kauffmann:
Disolver gramos del medio en agua destilada. Mezclar bien. Calentar
brevemente y enfriar rápidamente. No esterilizar en autoclave.
Añadir asépticamente 20 ml/litro de solución de yodo y yoduro potásico, 10
ml/litro de solución al 0.1% de verde brillante.
Distribuir en tubos o frascos repartiendo previamente de forma homogénea el
precipitado que eventualmente hubiera podido formarse. Una vez añadidas
éstas sustancias no volver a calentar. Utilizar el medio el mismo día de la
preparación. Los tubos o frascos preparados deben almacenarse entre 2-8°C. El
color del medio preparado es blanco leche
Disolver el yoduro potasico en 5 ml de agua destilada, añadir el yodo y calentar
cuidadosamente la solución hasta que se disuelva completamente. Llevar a un
volume final de 100 ml.
Añadir el verde brillante al agua destilada, agitar y calentar a 100ºC durante 30
minutos asegurando que se ha disuelto, conserva en frascos topacio.
 Pre enriquecimiento en medio líquido no selectivo
Se tritura y homogeneiza el alimento con agua de peptona tamponada (APT)

con la ayuda de un stomacher. Se deja incubar el recipiente estéril (bolsa de
plástico con filtro) a 37±1ºC durante 18- 20 horas.

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Enriquecimiento selectivo
Transferir 0.1ml de cultivo obtenido en el pre- enriquecimiento a un tubo que

contenga 10 ml de caldo RVS, mezclar con vortex, incubar a 42°C x 24 h ± 3
h. Transferir 1 ml de cultivo obtenido en el pre- enriquecimiento a un tubo que
contenga 10ml de caldo MKTTn, mezclar con vortex, incubar a 37°C ± 1°C x
24 h ± 3 h
El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial
 Se debe utilizar mínimo dos medios selectivos por cada caldo de

enriquecimiento no selectivo y selectivo, para el aislamiento del
microorganismo. El primer medio de cultivo recomendado debe ser agar XLD,
y el segundo medio puede ser escogido por el laboratorio como: Agar Hektoen,
agar Sulfito Bismuto. Aislar por agotamiento el cultivo obtenido en caldo RVS
utilizando dos placas pequeñas (90mm a 100mm) de XLD. Use la misma asada
para sembrar las dos cajas una después de la otra, de modo que se obtengan las
colonias bien aisladas. Repetir el procedimiento con el segundo medio
selectivo. Aislar por agotamiento el cultivo obtenido en el caldo MKTTn y
repetir el procedimiento descrito en el punto 1, con los dos medios selectivos
en placa. Incubar a 37°C ± 1°C: XLD 24 h ± 3 h Después de la incubación,
examinar las placas para ver la presencia de colonias típicas y atípicas de
Salmonella Marcar la posición en el fondo de la placa.
 Nota: Las colonias típicas de Salmonella crecen en agar XLD con el centro
negro y una zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio de
color del indicador. Las colonias atípicas de Salmonella (lactosa – positivas)

ALIMENTOS Y BEBIDAS
crecen en agar XLD amarillas con ó sin ennegrecimiento. Selección de colonias

para confirmación, se toma de cada placa de cada medio selectivo por lo menos
una colonia que sea considerada típica o sospechosa y cuatro colonias más, si
las primeras son negativas. Sembrar las colonias aisladas y purificadas en
placas de agar TSAYE, incubar las placas inoculadas a 37°C ± 1°C x 24 h ±3h.
 Confirmación de las colonias presuntivas de Salmonella
A partir de las colonias crecidas en agar nutritivo se realiza una siembra en un
tubo de agar con hierro Kligler. Con la ayuda de asa estéril se realiza una
primera siembra en una picadura en el interior del agar y luego una segunda
siembra en forma de zig-zag en la superficie inclinada. Se incuban los tubos
Kligler a 37±1ºC durante 24 horas. Se realiza una primera lectura para verificar
el crecimiento y si es necesario se dejan incubar 24 horas más.
Dónde:
∑C: es la suma de las colonias contadas en dos placas de las dos diluciones
consecutivas, de las cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias;
V: es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;
d: es la dilución correspondiente a la primera dilución elegida (d = 1 cuando

ALIMENTOS Y BEBIDAS
se utiliza el producto líquido sin diluir).

N=∑C. D, V
2
Ejemplo 1: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:
Para la segunda dilución (10-2): 190colonias.
Placa 01 = 170 colonias x 102 = 17000
Placa 02 = 190 colonias x 102 = 19000
Promedio (17000+19000) /2 = 18000
Redondeando el resultado como se indicó, el número de microorganismos es

de 18.000 o 1.8 x 103 por mililitro o por gramo de producto.
3.4.7. Referencia
 International Standard. ISO 7932: 2004 (E). Microbiology of food an animal feeding
stuffs. Horizontal method for the enumeration of presumptive Bacillus cereus. Colony
- count technique at 30°C. Third edition, 2004-06-15. Disponible en:

ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Laboratorio de control ambiental Digesa-Minsa. Listado de ensayos implementados

 Da Silva A, et al. Características da Salmonella Spp.: uma Revisão

Literária. International Journal of Nutrology, 2018, 11,(Supl,1)228. Disponible en:
https://www.thieme-connect.com/products/ejournals/html/10.1055/s-0038-1674525
MOHOS Y LEVADURAS
2.5. Recuento de mohos y levaduras
 Objetivo
Conocer el número de mohos y levaduras que contienen los alimento o bebidas


ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Alcance
 Definición
Algunos hongos causan reacciones alérgicas y problemas respiratorios. Y
otros, en las condiciones adecuadas, producen micotoxinas, sustancias
venenosas que pueden enfermarlo. los mohos y las levaduras crecen con
mayor rapidez que las bacterias provocando importantes pérdidas por
alteración.
 Justificacion
alimentos.



ALIMENTOS Y BEBIDAS

 Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC)
Disolver g del medio en agua destilada. Calentar agitando hasta ebullición para
su disolución. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos
 Agar Diclorán 18% Glicerol (DG18)
Disolver g del medio en agua destilada, calentar agitando hasta ebullición para
su disolución. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
Medir una cantidad de masa (g) o volumen (ml) como mínimo del alimento
liquido o solido en una proporción de 1/10, y si agrega de la muestra 10 ml o g
a este se le agregará 90 ml de solución peptonada siendo la disolución inicial.


ALIMENTOS Y BEBIDAS
 Inoculación e incubación: Incubar a las placas de agar a 22-25 ºC durante 5

días. Las placas se incuban en posición normal (no invertida) porque las
colonias de levaduras y hongos filamentosos crecen mejor de esta manera.

El número de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina
según la siguiente fórmula:
N= C
V. [ (1 x n1) + (0.1 x n2)] x d
Dónde:
N= número de colonias por ml o g de producto

 C = suma de todas las colonias contadas en
todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor

dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d= dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento
2.5.6. Referencia
 International Standard. Microbiología de alimentos y piensos. Método

horizontal para la enumeración de levaduras y mohos. Parte 2: Técnica de
recuento de colonias en productos con una actividad del agua menor o igual a

ALIMENTOS Y BEBIDAS
0,95. Disponible en: https://www.iso.org/standard/38276.html
 ICMSF. Microorganismos de los Alimentos I. Editorial Acribia.2000. Pp.165-

167.

 Quispe P; Vicente E. Microbiología de alimentos y superficies de contacto en

comedores populares de los distritos de Characato, Sabandia y Mollebaya de la
provincia de Arequipa. Veritas,2018,19(1):39-48. Disponible en:
https://revistas.ucsm.edu.pe/ojs/index.php/veritas/article/view/164

ALIMENTOS Y BEBIDAS
COLIFORMES TOTALES
2.6. Número de coliformes totales

 Objetivo
Conocer el número de coliformes totales que contienen los alimento o bebidas

 Alcance
fundamenta el análisis de ciertos alimentos para consumo humano. Y tendra
como tabla de referencia el uso de Número mas probable o NMP.
 Definición
Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en
las plantas, el suelo y los animales, incluyendo los humanos. La presencia de
bacterias coliformes es un indicio de que el agua puede estar contaminada. La
contaminación fecal ha sido y sigue siendo el principal riesgo sanitario que
supone la incorporacion de estos patógenos. En este grupo de bacterias está
incluida la Escherichia coli, considerada como un organismo indicador de
contaminación fecal. • Se ha demostrado que esta bacteria siempre está
presente en un número elevado en las heces de humanos y animales de sangre
caliente y comprende casi 95% de los coliformes en las heces.
 Justificacion
alimentos.

ALIMENTOS Y BEBIDAS



 Agar Caldo lactosa.
Disolver g del medio en agua destilada. Calentar agitando hasta ebullición para
 Agar Caldo Lauril Triptosa (CLT).

Disolver g del medio en agua destilada calentar agitando hasta ebullición para
 Caldo BGLB (verde brillante bilis)
Disolver g del medio en agua destilada calentar agitando hasta ebullición para
 Medir una cantidad de masa (g) o volumen (ml) como mínimo del alimento
liquido o solido en una proporción de 1/10, y si agrega de la muestra 10 ml o
g a este se le agregará 90 ml de solución peptonada siendo la disolución inicial.

ALIMENTOS Y BEBIDAS

El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial
Sembrar 1ml en 10 ml por triplicado cada dilución en tubos Durham con caldo
Lauril sulfato de sodio. Agitar los tubos para su homogeneización. Incubar a 35 ±
2°C durante 24 a 48 h.
 Reafirmación
Transferir “un asa” o una gota de cada tubo con gases de la prueba presuntiva
a caldo BGLB (verde brillante bilis), evitando en su caso la película superficial.
Incubar los cultivos en BGLB a 35°C durante 48 h. Calcular el NMP de
coliformes utilizando la proporción de tubos con producción de
gases confirmada de los tubos seleccionados en la prueba presuntiva.
N=C
( n1 + (0.1 x n2 ) d
Dónde:
N= número de colonias por ml o g de producto

 C = suma de todas las colonias contadas en todas las
placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.

n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d= dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento

ALIMENTOS Y BEBIDAS
Tabla N1. Índice de NMP de coliformes totales.
N° de tubos con Reacción Positiva Índice del

3 tubos con 3 tubos con 3 tubos con NMP/100 ml
10 ml 1 ml 0.1 ml
0 0 0 <3
0 0 1 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15
2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 39
3 1 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1 100
3 3 3 > 2 400

ALIMENTOS Y BEBIDAS
2.6.6. Referencia
 International Standard Organization. ISO 4832: 2006. Microbiology

of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the
enumeration of coliforms -- Colony-count technique. Disponible en:
 ICMSF. Microorganismos de los Alimentos 2: Métodos de Muestreo
para Análisis Microbiológico. Principios y Aplicaciones Específicas.
Zaragoza: Editorial Acribia, 1981.Disponible en:
https://www.editorialacribia.com/libro/microorganismos-de-los-
alimentos-2-metodos-de-muestreo-para-analisis-microbiologico-
principios-y-aplicaciones-especificas_54370/
 León R., et al. Potencial de plantas acuáticas para la remoción de coliformes
totales y Escherichia coli en aguas servidas. Enfoque UTE, 9(4), 131-
144. Disponible en:
http://scielo.senescyt.gob.ec/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1390-
65422018000400131

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3.3.Recuento de Bacillus cereus……………………………………………..….….…...…19

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3.6.Recuento de mohos y levaduras……………………………….………………....43

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II. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

2.3.Medio de cultivo y reactivos

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 Emulsión de yema de huevo

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2.4. Recuento de microorganismos en alimentos

Existen diversos métodos para enumerar microorganismos en muestras de muy

2.4.1. Consideraciones generales:

Cuando realizamos diferentes diluciones decimales y sembramos más de una

2.4.2. Rangos para el recuento:

Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades

UFC/ml = A colonias enumeradas (media) X Factor de dilución

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Otra Técnica de enumeración habitual es el método del Número Más Probable

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Conocer el número de microorganismo patógenos y no patógenos que contiene

2.1.1. Preparación de medios de cultivo

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frascos o tubos de acuerdo a las necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C

 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial

2.1.3. Método de siembra

 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra

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otra pipeta estéril, 1 ml de la dilución 10-3. Si es necesario, se repite el

 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas

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 Redondeando el resultado como se indicó, el número de microorganismos es de

 International Standard Organization. ISO 4833-1: 2003. Microbiology of food

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 Laboratorio de control ambiental Digesa-Minsa. Listado de ensayos

 Dorigon F; Duarte R; Santo A. Determinação da contagem global de

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Conocer el número de Bacillus cereus que contiene la materia prima, los

2.2.1. Preparación de medios de cultivo

 Agua peptona bufferada (BPW)

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Disolver 20 g de los componentes en 1 litro agua destilada, si es necesario

 Sangre de oveja desfibrinada