el trabajo debe de ser redactado en pasado. ¡ATENTAS!

longitud de absorbancia
onda

400 0,263

420 0,15

450 0,115

470 0,153

480 0,221

500 0,287

520 0,325

550 0,298

570 0,2

580 0,276

600 0,228

620 0,16

640 0,091

EXTRACCION DE ADN MEDIANTE EL USO DE KITS COMERCIALES

MATERIALES

● Guantes.
● Bata.
● Gafas de laboratorio.
● Guardianes para desecho de corto-punzantes.
● Canecas de bolsa roja para el desecho de químicos y biológicos.
● Aguja sistema vacutainer.
● Camisa sistema vacutainer.
● Tubo vacutainer tapa lila.
 ● Torundas de Algodón.
● Torniquete.
● Toallas absorbentes.
● Tubos de 1,5 ml (microtubos) para Microcentrifuga, estériles y libres de DNasa.
● Puntas nuevas y estériles con capacidad para tomar micro-volúmenes entre 1 μl y 1000
μl.
● Columna en tubos de recolección PureLink.
● Tubos de recolección PureLink.

REACTIVOS

● Desinfectante (Etanol al 70% o Alcohol Yodado)

● Etanol 96% - 100%
● Buffer de Lisis/Adsorción (Genomic Lysis/Binding Buffer)
● Buffer de Digestión (Genomic Digestion Buffer)
● Buffer de lavado 1 (Genomic Wash Buffer 1)
● Buffer de lavado 2 (Genomic Wash Buffer 2)
● Proteinasa K (20mg/ml)
● RNasa A diluida en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM
● Buffer Genómico de elución (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA) (Genomic Elution
Buffer)
● Agua estéril con pH 7,0 – 8,5

PROCEDIMIENTO

La muestra de ADN que se utilizo durante todo el procedimiento es sangre humana. Lo primero
que se hizo fue adicionarle 20 microlitos (20μl) de proteinasa K a 200 μl de la muestra de
sangre, para poder degradar los lipidos y las proteinas. Esta solucion se agito durante unos
breves minutos en un ​NO ME ACUERDO EL NOMBRE DEL APARATO, CREO QUE ES UN
VORTEX . Luego a la mezcla anterior se le adiciono 20μl de RNasa A, la cual corta el RNA del
DNA. La proteinasa K junto a la RNasa A, degradan la sangre. La solucion se mezclo en el
vortex durante 10 segundos energicamente. Luego esta, se dejo en incubacion durante 2
minutos. Cumplido el tiempo, se adiciono 200μl del reactivo Lysis/binding buffer y se paso a
mezclar en el vortex durante 10 segundos, hasta que se obtuvo una solucion homogenea. El
buffer amortiguó el pH, permitiendo que la solucion se uniera a la columna​(NO ESTOY MUY
SEGURA DE ESTO). Luego de haber adicionado el buffer, se incubo la mezcla durante 10
minutos a una temperatura de 55ºC para promover la digestion. Una vez terminado el tiempo
de incubacion se le adiciono 200μl de etanol puro (96-100%), para luego mezclarlo en el vortex.
El etanol hace una lisis en el ADN, rompe los globuos rojos. Se incubo la solucion a 55ºC y se
aplico vortex ocasionalmente hasta que se completo el lisado (1-4 h).
Para la separacion de los componentes celulares no deseados y purificaicon del ADN, el
procedimiento fue::

En un tubo de recoleccion con la columna incluida en el Kit PureLink se adicioni toda la

solucion que se preparo anteriormente. la columna se centrifugo a 10,000 x g durante un
minuto a temperatura ambiente. El tubo de recoleccion debio de ser desechado y ser cambiado
por otro tubo limpio de recoleccion suministrado por el kit. Despues se procedio a adicionarle
500μl de buffer de lavado (Washing buffer 1) a la columna, el buffer lo que va a hizo fue limpiar
los acidos nucleicos para que la columna no estuviera manchada de color rojo. Despues se
centrifugaol a columna a una temperatura ambiente a 10,000 x g durante un minuto.
Nuevamente se descarto el tubo de recoleccion y se coloco otro tubo del kit. Luego, se adiciono
500μl de buffer de lavado 2 (washing buffer 2) a la columna, se centrifugo durante 3 minutos a
maxima velocidad a temperatura ambiente. Se descarto nuevamente el tubo de recoleccion y
luego se puso la columa sobre un nuevo microtubo de 1,5ml esteril (El microtubo no fue
suministrado por el kit). Se procedio a dicionar 100μl de buffer Genomico de Elucion PureLink a
la columna, el buffer permitio que el ADN se soltara de la columna. La solucion restante se
debio incubar a temperatura ambiente durante un minuto y posteriormente ser centrifugada a
una velocidad maxima durante un minuto a la misma temperatura. En este momento el tubo
contenia ADN genómico purificado. Se removio y descarto la columna. Posteriormente se debio
proceder a alicuotar y almacenar el ADN purificado a -20ºC, para luego ser utilizado en un gel
de electroforesis.

ELECTROFORESIS

Materiales para las soluciones stock de la electoforesis

Agua destilada
EDTA dihidratado 3.72 g
Ácido Bórico 2.5 g
Tris Base 54 g
SYBR GREEN I 1μl
Dimetilsulfoxido anhidro (DMSO) 99μl

Materiales para la electroforesis

-Caja de Therazaki
-Agarosa 2g
-Solución de trabajo Buffer TBE 0.5X
-ADN 10μl
-Buffer de carga 5X Green GoTaq 2.5μl
-SYBR GREEN I 1 μl
-Marcador de peso molecular GeneRuler 100 bp Plus para ADN 2.5 μl

Equipos

-Cámara electroforética
-Microondas
-Balanza Analítica
-Fuente de poder 20-150V
-Cámara electroforética
-Transiluminador UV

Procedimiento

inicialmente se preparó 1L de Solución Stock 5x Buffer TBE con 3.72 g de EDTA dihidratado y
disolviendolo en 20 ml de agua destilada después de esto en un recipiente con capacidad de
1L se adiciono 2.5 g de Ácido Bórico y se mezcló con un poco de agua destilada para disolver
parcialmente.Después a esta mezcla se le adiciono 54 g de Tris Base y los 20 ml de la solución
EDTA 0.5 M, finalmente se aforó con agua destilada hasta completar 1L de solución.
para la Preparación de 1L de Solución de Trabajo TBE 0.5x se realizó una dilución 1:10
midiendo 100 ml de la solución stock en una probeta para Transferir los 100 ml de volumen a
un balón volumétrico o beaker y aforar hasta 1L con agua destilada (900 ml agua destilada).
para la Solución Stock SYBR GREEN I se realizó una solución 1:100 a partir del reactivo
original 10.000X para preparar un volumen de 100 μL y se Adiciono 1 μL de SYBR GREEN I
(Lozan) en un vial plástico de 1.5 ml para mezclarlo con 99 μL de DMSO al 100% (anhidro).
para la electroforesis se retiró la tapa SuperSafe que contiene los conectores para los cables
de los electrodos tipo barra.despues se Coloco la bandeja en la cámara electroforética en la
posición para servir el gel como se muestra en la Figura 3, asegurándose de que los empaques
de presión naranja queden contra la pared de la cámara y en posición perpendicular a los
electrodos. para la preparación se preparó 50 ml de agarosa al 2%, se pesa 1 g de agarosa se
adiciono a un Erlenmeyer y se aforó con Buffer TBE 0.5X hasta completar un volumen de 50
ml. luego se Calentó o en el microondas durante 30 segundos y se repitio este ciclo 3 o 4
veces hasta que la mezcla se disolvió completamente, evitando la formación de burbujas,
después se enfrió el gel de agarosa a 60ºC antes de servir en la bandeja, mientras que se
enfríaba la agarosa se colocó el peine de 1 mm en la bandeja como se muestra en la Figura 2,
numeral 2. para mas tarde Vaciar aproximadamente 28 ml de la solución de agarosa en el
molde para obtener un gel de 5 mm de espesor, si se usa la cámara Owl B1A. luego
seSolidificóo a temperatura ambiente durante 30-45 minutos para que se formaran ls pozos.
Una vez se solidificado el gel se retiró la bandeja de la cámara para cambiar a posición de
corrido como se muestra en la Figura 3, asegurándose que los empaques de presión queden
en posición paralela a los electrodos. para luego Llenar la cámara electroforética con TBE 0.5X
hasta cubrir el gel con aproximadamente un 1mm de solución arriba de la matriz de agarosa y
luego se retiro cuidadosamente el peine de una forma firme y rápida, y levantando lentamente
hacia arriba de la bandeja de gel para evitar daños a los pozos.

FIGURA 2

FIGURA 3

para la siembra de muestras, en una caja de Therazaki, se mezcló en un pozo 10 μL de

muestra de ADN con 2 μL de Buffer de carga 5X y a esta mezcla se le adiciono 0.5 μL de
Solución Stock SYBR GREEN I (1:100), mezclándolo bien y aspirando una y otra vez con la
micropipeta, después se sembraron los 12.5 μL en el pozo del gel.

para el Marcador de Peso Molecular, se mezcló 2.5 μL de marcador con 0.5 μL de buffer de
carga 5X Green GoTaq Flexi Buffer, se Adiciono 0.5 μL de solución stock SYBR GREEN I
(1:100) y se sembraron los 3.5 μL en el pozo del gel.

En el primer carril se sembraron los 3.5μl la mezcla de Marcador-Buffer de carga- SYBR

GREEN I, ubicando cuidadosamente la punta en medio del pozo sin romperlo, como se
muestra en la figura 3.
En los siguientes carriles sembrar los 12.5 μl de la mezcla ADN- Buffer de carga- SYBR
GREEN I

Figura 4.

para las condiciones de corrido se colocó la tapa SuperSafe deslizándose sobre la cámara,
esta tapa lleva los conectores a la fuente de poder y debe estar conectada a los cables de
alimentación que tienen los electrodos tipo barra, se conecta el otro extremo de la fuente de
alimentación y se llevó a una toma eléctrica adecuada, completando el circuito. despues se
conecto la fuente de poder a 150 V, se monitorio cuidadosamente el gel para evitar que la
muestra se desvíe a otro carril, Luego se dejo correr el gel durante aproximadamente una
hora, cuando el gel haya terminado de correr y el azul de bromofenol en el buffer de carga haya
migrando la distancia requerida o hasta el final del gel, se apaga la fuente de poder y se deslizó
la tapa para desconectar de la energía.para después remover cuidadosamente la bandeja que
contiene el gel, esta bandeja permitio visualizar perfectamente el gel en un transiluminador UV
sin necesidad de remover el gel de la bandeja.

para la visualización de los amplificados se -Levantó la tapa ámbar y se coloco la bandeja con
el gel en el área de filtro, se encendió el transiluminador y se programó a una intensidad media,
para finalmente observar la formación de bandas discretas.

CUANTIFICACION DE PROTEINAS LUEGO DE PURIFICACION Y SINTESIS DE

PROTEINAS

Elementos

- Albumina a una concentracion de 8mg/ml

- Agua destilada
- 2 ml Reactivo Biuret
- Espectrofotometro
- Micropipetiador

que se me olvida???jajajaja jum!

adriana yo creo que aqui va los materiales: sln problema de ovoalbumia.. y todas las demas
soluciones. Ximena

PROCEDIMIENTO
Inicialmente se prepara una muestra blanco para indicar la absorbancia real de la proteina, el
blanco esta compuesto de 0.5 ml de agua, utilizado como solvente y 2 ml de reactivo biuret, en
una ​cubeta con el fin de que sea la muestra control. Luego la muestra tiene 0.5 ml de agua con
la proteina (albumina en polvo) y 2 ml del reactivo biuret; se espera aproximadamente 20
minutos para que …....y se procede en el espectrofotometro, a mirar la absorbancia de la
proteina a diferentes medidas de longitud de onda, con ello se mira a que longitud de onda se
da la mayor absorbancia. TABLA ….

Luego se hacen dilusiones

- En la primera se utiliza 2 ml del reactivo biuret y 0.5 ml del albumina(BSA)
- En la segunda se emplea 2 ml del reactivo y 1.5 ml del BSA
- En la tercera muestra se agrega 2 ml del mismo reactivo y 2.5 ml del BSA.

A las tres muestras se les mide la absorbancia a la longitud de onda mayor (550 l) hallada con
la muestra inicial
va en resultados

para la primera muestra se da una absorbancia de 0.41, para la segunda muestra se da una
absorbacia de 0.087 y para la tercera de 0,175

para la muestra problema se debe considerar la concentracion, la cual se debe hallar, con una
absorbacia de 0.039 a una longitud de onda de 550

no se para que nos dan 2 concentracioñnes mas . ​creo no estoy segura niveles de
absorbancia ximena
x1 0,081
x2 0,004

X1= 0,081
X2= 0,004
X3= 0,039

ya toca hacer los calculos con v1c1=v2c2

y tambien la curva de calibracion y absorvancia vs concentracion

adriana tengo unos datos que no me acuerdo de que son,

0.41
0,087
0,175 al parecer absorbancia pero no estoy segura

ADRIANA A SU CORREO LE ENVIE LAS FORMULAS DE LA C2 MIRE SI ESTAN BIEN

HECHAS Y DE SER ASI, VERIFIQUE RESULTADOS. XIMENA

1. introduccion
2. materiales y procedimiento
2.1 extraccion de ADN
2.2 electroforesis
2.3 cuantificacion de proteinas
3. resultados
4. discucion (analisis)
5. conclusion
6.referencia bibliografica,

1.INTRODUCCION

la extraccion de ADN, la electroforesis en gel de agarosa y la cuantificacion de proteinas son

procesos que van ligados entre si, un ejemplo claro de ello seria para hacer un diagnostico de
una enfermedad. aunque depende de un buen procedimiento en la extraccion y en la
electroforesis un buen resultado para buscar lo que se necesita.para llevar a cabo cada una de
estas tecnicas se deben de tener conocimientos previos como por ejemplo la estructura del
ADN, su polaridad y propiedades, tambien se debe de tener en cuenta como se elabora un gel
de electroforesis y la cantidad de reactivos y material genetico a utillizar, en la cuantificacion de
proteinas es importante saber preparar la muestra blanco y la muestra que se esta analizando,
lo mas importante en este paso es la secuencia que debe de tener cada una de las soluciones.

PALABRAS CLAVES:​ extraccion de ADN, electrforesis, cuantificacion de proteinas

3. RESULTADOS

En la extraccion del ADN el resultado final es una solucion que contiene el ADN, esta ​solucion
es la que se utilizo en el gel de electroforresis. En el gel de electrorforesis por medio de las
bandas que fueron visibles a traves de luz ultravioleta, se pudo determinar la calidad y cantidad
del ADN con el que estabamos trabajando. Este resultado se puede concluir a partir de que tan
visible es la muestra en cada carril de electroforesis.

en la cuantificacion de proteinas se puede saber como el nombre del procedimiento especifica,

la cantidad de proteina que hay en una solucion.
EN ESTE PUNTO HAY QUE ANEXAR EL CALCULO DE LA CONCENTRACION QUE NO SE
SABIA Y LAS GRAFICAS Q HAY Q HACER

4. DISCUSION

Dependiendo de la nitidez y tamaño que tiene la banda de electroforesis podemos concluir el

resultado de la extraccion de ADN y del gel de electroforesis. Es solo en este momento donde
se puede empezar a comparar la muestra con una que se tiene de referencia, porque se puede
medir peso molecular y comparar tamaño y forma de las muestras. Tambien se puede concluir
si la extraccion fue o no fue suficiente.

En cuantificacion ---> curva de calibracion si permite detectar concentraciones

mirar linea recta o otra cosa
5. CONCLUSIONES

6. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

SOLUCION DE RESPUESTAS PROPUESTAS EN LAS GUIAS DE LABORATORIO

1. EXTRACCION DE ADN MEDIANTE EL USO DE KITS COMERCIALES

● DESCRIBRIR QUE ACCION TIENE CADA UNO DE LOS COMPONENTES DEL

BUFFER DE DIGESTION DURANTE LA FASE DE HOMOGENIZACION

- PROTEINASA K: ​es una enzima que degrado lipidos y proteinas de las membranas celulares.

-​RNasa A:​ es una enzima que corta el RNA del ADN.

2. ¿POR QUÉ ES NECESARIO ADICIONAR RNASA DURANTE EL PASO DE LISADO DE

LA MUESTRA?

Es importante porque el RNasa separa el RNA del ADN, entonces va a permitir un mejor lisado
de la solcuion al estar esta dividida en fragamentos mas pequeños. La RNasa A ataca los
especificamente los fosfatos unidos a nucleotidos de pirimidinas en presencia de iones
monovalentes.

3. DESCRIBIR QUE ACCION TIENE CADA UNO DE LOS COMPONENTES DEL BUFFER DE
LISIS Y EL BUFFER DE ABSORCION

El buffer Lysis/Binding, ​amortigua el pH de la solucion y le da propiedades para que se una a la

membrana de silica en la columna

4. ¿QUE FUNCION CUMPLE EL ETANOL AL FINAL DEL PROCESO DE LISADO DE LA

MUESTRA?

El etanol hace una lisis en los glóbulos rojos.

5. ENUNCIE LAS VENTAJAS QUE TIENE EL METODO DE SEPARACION DE ADN POR

ABSORCION EN MATRIZ DE SILICA O COLUMNA DE FILTRACION FRENTE A METODOS
CONVENCIONALES DE EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS COMO TRIZOL,
FENOL-CLOROFORMO Y SALTING OUT. DE UNA BREVE FUNDAMENTACION DE ESTOS
METODOS CONVENCIONALES.

EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS CON TRIZOL:

La extracción de ARN utilizando el reactivo Trizol se basa en la solubilidad diferencial de las

moléculas (ácidos nucleicos y contaminantes) entre dos fases no miscibles.
El Trizol está compuesto por una mezcla de fenol (donde los ácidos nucleicos son insolubles) y
tiocianato de guanidinio (agente desnaturalizante de proteínas e inhibidor de proteasas) a pH
4,5. Así la integridad del ARN se mantiene durante la extracción.
La adición de cloroformo, seguida de una centrifugación permite separar la fase acuosa
superior, que contiene el ARN, de la fase orgánica (proteínas y ADN). El ARN se recupera
mediante una precipitación con isopropanol. [1]

Extraccion de acidos nucleicos con fenol-cloroformo:

El fenol-cloroformo es una extraccion liquido-liquido. se utiliza en la biologia molecular para

aislar ADN, ARN y proteinas. Esta tecnica se basa en la separacion de fases por centrifugacion
de una mezcla acuosa y una solucion que contiene agua saturada de fenol, cloroformo y una
solucion con un agente caotropico desnaturalizante.
Los reactivos que se usan en esta tecnica son: fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. [2]

EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS CON SALTING OUT:

En este método se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl, pH 8.3,Tween 20, Nonidet P40,
Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. El
paso siguiente consiste en la precipitación de los ácidos nucleicos, ya que el DNA presente en
soluciones con alta concentración de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la
adición de alcohol etílico a dichas soluciones. [3]

Algunas de las ventajas que tiene el usar el metodo de separacion de ADN por absorcion
en matriz de silíca o columna de filtracion, son:

● El procedimiento se realiza en un tiempo mas corto en comparacion con el metodo

fenol-cloroformo.
● Trabajar con el fenol y el cloroformo puede resultar peligroso debido a sus propiedades,
por ejemplo el fenol es inflamable, es mas segurao trabajar con los reactivos utilizados
para el metodo a traves de columnas.
● La separacion usando matriz de silica no necesita que se repitan procedimientos para
asegurar que la muestra quede pura, mientras que el salting out es necesario repetir
 pasos para asegurar la pureza de la muestra.
● Los reactivos utilizados con matriz silíca permiten mayor seguridad en el laboratorio,
debido que los reactivos utilizados no representan un gran riesgo para la salud de las
personas.

6​. ¿Cuál es el componente del ADN que absorbe a la longitud de 260nm?

La absorbancia de los acidos nucleicos es maxima a 260nm.

[1]​http://www.google.com.co/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=web&cd=3&ved=0CFU
QFjAC&url=http%3A%2F%2Fiib.org.ar%2Fbajar_material.php%3Farchivo%3D120.doc&ei=E6n
GT-T3C7CI6AG2_LXoBg&usg=AFQjCNH4qlbI0AOV41sC_1dupDBWCfSPrQ&sig2=_x_EG4d2
nawEMwOOUx0vbw

[2] ​http://en.wikipedia.org/wiki/Phenol%E2%80%93chloroform_extraction

[3]
http://www.elportaldelasalud.com/index.php?option=com_content&task=view&id=127&Itemid=1
47