Edicion de Manual de Microbiologia

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE
CONTROL MICROBIOLOGICO
Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

INDICE
Pg.
I. INTRODUCCIÓN
1.1. Objetivo………………………………………………………...………………1
1.2. Alcance………………………….…………………………………………...…1
1.3. Fundamento……………………………………………..………………......….1
II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS……………………...……………….1
2.1. Materiales………………………………………………………………………1
2.2. Equipos……………………….…………………………………………..….....2
2.3. Cultivos y reactivos……………………………………...……………….…….3
III. DESARROLLO…………………………………………….………….………….…4
3.1.Recuento de mesófilos…………………………………………….…………..….4
3.1.1. Preparación de medios de cultivo……..……………………..………...…..4
3.1.2. Preparación de disoluciones……………………………….…….……..….5
3.1.3. Duración del procedimiento……………………………….….………..….6
3.1.4. Método de siembra……………………………………….…….….………7
3.1.5. Recuento y selección de las colonias…………………………….………..8
3.1.6. Método de cálculo………………………………….……………….…......9
3.1.7. Referencia………………………………………………………………...10
3.2.Recuento de coliformes totales……………………………………………….….11
3.2.1. Preparación de medios de cultivo………………………...……………….….….12
3.2.2. Preparación de disoluciones……………….………………..………………..…..13
3.2.3. Duración del procedimiento………………………………………….…...14
3.2.4. Método de siembra………………………………………….………………....…15
3.2.5. Recuento y selección de las colonias………………...…….…………......16
3.2.6. Método de cálculo………………………..…………………………………......17
3.2.7. Referencia………………………………………………………………...18

3.3.Recuento de Bacillus cereus……………………………………………..….….…..….19

3.3.1. Preparación de medios de cultivo……………………….……….……......…..…20
3.3.2. Preparación de disoluciones……………….…………………………..…….…...21
3.3.3. Duración del procedimiento…………………………………….……...…22
3.3.4. Método de siembra……………………………………………………..……..….23
3.3.5. Recuento y selección de las colonias…………….………………...….…..24
3.3.6. Método de cálculo………………………..…………………………….….…....25
3.3.7. Referencia………………………………………………….....……...…...26
3.4.Numeración de Staphylococcus aureus………………………………..…………......27
3.4.1. Preparación de medios de cultivo….…….………………………………….…....28
3.4.2. Preparación de disoluciones……………………………….……………………..29
3.4.3. Duración del procedimiento………………………………………………30
3.4.4. Método de siembra………………………………….……………………………31
3.4.5. Recuento y selección de las colonias……………...……….……………..32
3.4.6. Método de cálculo………………………..……………………………………..33
3.4.7. Referencia………………………………………………………………...34
3.5. Detección de salmonella spp………………………………………………….……35
3.5.1. Preparación de medios de cultivo……………………………………………….36
3.5.2. Preparación de disoluciones……………….……………………………………..37
3.5.3. Duración del procedimiento………………………………………………38
3.5.4. Método de siembra………………………………………………….……………39
3.5.5. Recuento y selección de las colonias……………………………………...40
3.5.6. Método de cálculo………………………..……………………….…...….…….41
3.5.7. Referencia…………………………………………………………….…..42
3.6.Recuento de mohos y levaduras……………………………….………………....43
3.6.1. Preparación de medios de cultivo……………………………….………….…....44

3.6.2. Preparación de disoluciones……………….………………………….………....45

3.6.3. Duración del procedimiento…………………………………….…..……46
3.6.4. Método de siembra…………………………………………………....…………47
3.6.5. Recuento y selección de las colonias…………………………….………..48
3.6.6. Método de cálculo………………………..……………………..……………….49
3.6.7. Referencia………………………………………………………..………..50
REFERENCIAS……………………………………………………….......………..51
International Standard Organization. ISO 4833-1: 2003. Microbiology of food chain. Horizontal
method for the enumeration of microorganisms. Part 1: Colony count at 30°C by the pour plate
technique. Disponible en: https://www.iso.org/standard/34524.html Laboratorio de control
ambiental Digesa-Minsa. Listado de ensayos implementados versión 05. Disponible en:
http://www.digesa.minsa.gob.pe/LAB/AC-LI-
05_Lista_Ensayos_implementados_V05_Rev_02_20-09-2017.pdf
OBJETIVO
 Conocer el número de microorganismo que contienen un alimento como

producto en medio solido o líquido elaborado en Laboratorios Fitogreen SAC.
1. ALCANCE
 Estos procedimientos se aplican para realizar el método horizontal para el
recuento de microorganismos capaces de crecer y formar colonias en un medio
tras la incubación a 30°C, en productos destinados al consumo humano basados
según las Técnicas descrita en las Normas ISO, como sus límites máximos, que
se fundamentan el análisis de ciertos alimentos para consumo humano.
2. FUNDAMENTO
 Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad,
esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades
nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible,
etc. El número de colonias contadas constituyen una estimación de la cifra
realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha
sido el adecuado.

PROCEDIMIENTO RECUENTO DE
MICROROGANISMO EN ALIMENTOS.
II. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

2.1.Materiales
 Placas de Petri de vidrio o plástico
 Pipetas de 1 ml
 Matraz
 Frasco de vidrio con tapa rosca
 Frasco de vidrio con gotero
 Tubos de vidrio
 Termómetro
 Varilla de vidrio
 Espátula
 Luna de reloj
 Papel crakf
2.2. Equipos
 Estufa de esterilización
 Autoclave
 Estufa de incubación: 30°C ± 1°C
 Baño de agua (44°C y 47°C)
 Equipo contador de colonias (opcional) ,
 Peachímetro de exactitud 0.1 a 25°C ± 1°C
 Equipo para mezclado (tipo stomacher)
 Agitador mecánico (tipo vortex)
 Asa bacteriologica
 Mechero bunsen
2.3.Medio de cultivo y reactivos

 Agua peptona bufferada (BPW)
 Solución salina peptonada (SFP)
 Agar Plate Count (PCA)
 Agar
 Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP)
 Solución de polimixina (106 U.I. en 100 ml)

 Emulsión de yema de huevo

 Agar base sangre
 Sangre de oveja desfibrinada
 Agar Baird Parker
 Solución de telurito de potasio al 1 %
 Caldo cerebro, corazón, infusión (caldo BHI)
 Plasma de conejo
 Caldo SX2.
 Caldo Müller-Kauffman tetrationato-novobiocina (MKTTn).
 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).
 Agar Hektoen.
 Agar nutritivo (AN).
 Agar TSAYE
 Agar Sulfito Bismuto según Blair (Opcionales)
 Agar Verde Brillante lactosa – sacarosa con novobiocina (BPLS)
 Agar Kligler
 Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC)
 Agar Diclorán 18% Glicerol (DG18
 Caldo Lauril Triptosa (CLT).
 Caldo lactosa.
 Medio EC
 Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovac
 Frascos gotero con indicador rojo de metilo
 Agua destilada

III. DESARROLLO
3.1. RECUENTO DE MESÓFILOS
3.1.1. Preparación de medios de cultivo

 Agua peptona bufferada (BPW)
Disolver los componentes en agua destilada, si es necesario calentar. Ajustar el
pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Distribuir en frascos o tubos de
acuerdo a las necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
 Solución salina peptonada (SFP)
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar el pH a 7.0
± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las
necesidades analíticas. Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
 Agar plate count (PCA)
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar hasta la disolución
completa del agar. Ajustar el pH si es necesario para obtener un valor después
de la esterilización de 7.0 ± 0.2 a 25°C según ficha técnica. Se distribuye en
tubos, botellas u otros recipientes, en volumen de medio 15 ml.
3.1.2. Preparación de disoluciones
 Medir una cantidad de masa (g) o volumen (ml) como mínimo del alimento
liquido o solido en una proporción de 1/10, y si agrega de la muestra 10 ml o g
a este se le agregará 90 ml de solución peptonada siendo la disolución inicial.
Luego sacar con una pipeta un 1 ml y agregar a una cantidad del diluyente igual
a 9 x ml (dilución 10-2) y homogeneizar entre 1 minuto a 3 minutos dependiendo
del alimento. Repetir y transferir con una pipeta 1 ml de la segunda suspensión
en un tubo con 9 ml del diluyente estéril siendo esta suspensión 10-3. Para una
óptima precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la suspensión inicial y
evitar el contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente estéril.

3.1.3. Duración del procedimiento
 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el

instante en que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe
superar los 45 minutos, mientras que el lapso de tiempo límite entre la preparación
de la suspensión inicial y el comienzo de la preparación de las diluciones
decimales sucesivas es de 30 minutos.
3.1.4. Método de siembra
 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra líquida

de un tipo de dilución siendo mejor tomar la de 10-2 a tres placas o tubos con
medio de cultivo según el método. Tomar otras 3 placas o tubos estériles.
Transferir utilizando otra pipeta estéril, 1 ml de la dilución 10-3 . Si es necesario,
se repite el procedimiento con mayores diluciones, utilizando una pipeta estéril
nueva para cada dilución decimal. Se coloca 15 ml del agar PCA enfriado a 44°C
- 47°C en cada placa de Petri, evitando verter directamente el medio sobre el
inóculo. Se mezcla cuidadosamente el inóculo con el medio de cultivo por
rotación suave de la placa de Petri. Se colocan las tapas y se deja solidificar sobre
una superficie horizontal fría, a temperatura ambiente
 Incubación:
Después de la completa solidificación del medio y solo en los casos en que se
sospeche que la muestra contiene microorganismos cuyas colonias invaden la
superficie del medio, verter 4 ml del agar para cubrir (AC) o agar PCA a 44°C -
47°C sobre la superficie del medio inoculado dejar solidificar. Se invierten las
placas y se incuban en la estufa a 30°C±1°C por 72 h ± 3 h.
3.1.5. Recuento y selección de las colonias
 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas que,

de ser posible, tengan menos de 300 colonias. Contar las colonias, si es necesario
utilizando el equipo contador de colonias. Examinar las placas bajo una luz tenue.
Es importante que las colonias diminutas sean incluidas en el recuento sin
confundirlas con partículas insolubles o precipitadas del alimento.

 Si menos de un cuarto (1/4) de la placa está cubierto por un crecimiento difuso o

diseminado, se cuentan las colonias en la parte de la placa no afectada y se calcula
el número correspondiente para la placa de Petri entera, deduciéndolo por
extrapolación del número teórico que debería corresponder a la placa entera. Si
hay sobrecrecimiento en un área superior a un cuarto de la placa, se rechaza este
recuento.
3.1.6. Método de calculo
 Para que el recuento sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de
colonias se realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 10 colonias.
El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula
como la media corregida de dos diluciones consecutivas, utilizando la ecuación.
Dónde:
∑C: es la suma de las colonias contadas en dos placas de las dos diluciones
consecutivas, de las cuales al menos una contiene un mínimo de 10 colonias;
V: es el volumen de inóculo utilizado en cada placa, en mililitros;
d: es la dilución correspondiente a la primera dilución elegida (d = 1 cuando se
utiliza el producto líquido sin diluir).
N=∑C. D, V
2
Ejemplo 1: El recuento ha proporcionado los siguientes resultados:
Para la primera dilución escogida (10-2): 170 colonias
Para la segunda dilución (10-2): 190colonias.
Placa 01 = 170 colonias x 102 = 17000
Placa 02 = 190 colonias x 102 = 19000
Promedio (17000+19000)/2 = 18000
 Redondeando el resultado como se indicó, el número de microorganismos es de

18.000 o 1.8 x 103 por mililitro o por gramo de producto.

 Si la dilución más concentrada sembrada fue: 10-1 entonces se dirá que los
microorganismos presentes están a un nivel de 10-1 < 10 UFC /ml o g. Si la última
dilución sembrada fue: 10-2 entonces se dirá que los microorganismos presentes
están a un nivel < 100 UFC /ml o g. Pero si está a 10-3 estará a > 3x105 UFC/ml o g.
3.1.7. Referencia

3.2. NUMERACIÓN DE Bacillus cereus


 Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP):

Disolver los componentes en agua, por calentamiento y agitación. Ajustar el pH
si es necesario para obtener un valor después de la esterilización de 7.2 ± 0.2 a
25°C. Fraccionar 90 ml del medio en recipientes de capacidad adecuada.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, luego enfriar hasta 45C°.
 Emulsión de yema de huevo:
Usar huevos de gallina frescos, limpios y con sus cáscaras intactas. Lavar los
huevos, usando procedimientos asépticos, romper cada huevo y separar la yema
de la clara por repetidas transferencias de la yema de una mitad de la cáscara del
huevo a la otra. Poner las yemas en un recipiente con graduación y agregar cuatro
partes en volumen de agua estéril. Transferir asépticamente a un recipiente estéril
y mezclar vigorosamente. Calentar la mezcla durante 2 h en baño de agua a 44°C
- 47°C. Luego dejar durante 18 h a 24 h a 3°C ± 2°C para permitir que se forme
un precipitado. Recoger el sobrenadante asépticamente. La emulsión puede ser
guardada a 3°C ± 2°C durante no más de 72 h. Agregando 50 ml de la emulsión
a la mezcla.
 Solución de sulfato de polimixina b:
Luego de enfriar el agar MYP, agregar los 50 ml emulsión de yema de huevo,

agregar un 1 vial de Polixima B, luego de haber disuelto en agua destilada.

 Sangre de oveja desfibrinada

Fundir el agar base y enfriar en baño de agua a 47°C. Agregar la sangre
desfibrinada. Mezclar. Verter aproximadamente al menos 15 ml del medio en
placas de Petri estériles y dejar solidificar.

 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y

el instante en que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe
superar los 45 minutos, mientras que el lapso de tiempo límite entre la
preparación de la suspensión inicial y el comienzo de la preparación de las
diluciones decimales sucesivas es de 30 minutos.
 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra líquida

de un tipo de dilución siendo mejor tomar la de 10-2 a 10-3 en tres placas de agar
MYP según el método. Distribuir 1 ml del inóculo en la superficie de una placa
de Petri con agar MYP o en tres de placas con agar MYP utilizando una espátula
de Drigalsky. En ambos casos preparar duplicados usando dos placas o seis placas.
Distribuir el inóculo tan pronto como sea posible sobre la superficie del medio sin
tocar los bordes de las placas con una espátula estéril. Utilizar una espátula para
cada placa. Dejar las placas con la tapa puesta por 15 minutos a temperatura

ambiente para permitir que el inóculo sea absorbido en el agar. Invertir las placas
e incubarlas a 30°C entre 18 y 24 horas.
 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas,

preferiblemente en dos diluciones sucesivas, en las que el recuento sea menor a
150 colonias, contar en cada placa las colonias con características de colonias
presuntas de Bacillus cereus. Las colonias presuntas son grandes, rosas (indicando
que no ocurre fermentación del manitol) y generalmente rodeadas de una zona de
precipitación (producción de lecitinasa).
 Nota 1. Si las placas contienen numerosos organismos fermentadores de manitol
que producen ácido, la característica de color rosa de las colonias de Bacillus
cereus puede reducirse o desaparecer por completo.
 Nota 2. Algunas cepas de Bacillus cereus producen poco o nada de lecitinasa. Las
colonias deberían también ser sometidas al test de confirmación.
 Confirmación Tomar las colonias presentes, confirmar esas colonias como se
especifica, estriar 5 colonias presuntivas en placas con el medio selectivo (MYP).
Incubar las placas a 30°C durante 18 h a 24 h.
 Test de hemólisis en agar sangre de oveja
Estriar, pinchar o sembrar como mancha las colonias seleccionadas a partir de las
placas de MYP en la superficie de agar sangre de oveja de modo de obtener
colonias aisladas que permitan una buena interpretación de la reacción de
hemólisis. Incubar a 30°C durante 24 h y leer la reacción de hemólisis. Cada
colonia rodeada de una zona clara se considera hemólisis positiva.

 Para que el recuento sea válido, se suele considerar necesario que el recuento de
colonias se realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 10 colonias.
El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula
como la media corregida de dos diluciones consecutivas, utilizando la ecuación.
 Método de cálculo después de la confirmación:
En este método donde se requiere de una confirmación para el recuento, se

identifica un número de colonias sospechosas (A) que se someten a confirmación.
Tras la confirmación se calcula el número de colonias de cada placa (a) que
cumplen con los criterios de la confirmación, utilizando la ecuación.
El recuento ha proporcionado los siguientes resultados
Para la primera dilución escogida (10-3): 66 colonias
Para la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias
Realizando el análisis de las colonias escogidas: de las 66 colonias, se analizaron

8 y 6 dieron positivo todas cumplieron con los criterios, por consiguiente, a = 50
de las 4 colonias, las 4 cumplieron los criterios; por consiguiente, a =
X= 4,9 x 104 por mililitro o por gramo de producto.
∑C = 50 + 4 = 54 =
N 4909
V× 1,1. d 1 × 1,1 × 10−3 1,1 × 10−3
= 0

3.3.NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus

 Agar Baird Parker

Dependiendo de la firmeza del agar, disolver los componentes en agua hasta
ebullición. Ajustar el pH para que luego de la esterilización su valor sea de 7.0
± 0.2 a 25°C. Fraccionar en volúmenes de 100 ml en frascos o botellas de
capacidad adecuada. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
 Agar telurito de potasio
Disolver completamente el telurito de potasio en agua destilada con mínimo
calentamiento. Esterilizar por filtración utilizando membrana con poros de 0.22
µm de tamaño. Conservar a 3ºC ± 2ºC por un máximo de 3 meses. Descartar la
solución si se forma un precipitado blanco.
 Emulsión yema de huevo
Lavar los huevos con cepillo utilizando detergente líquido, enjuagar con agua y
desinfectar sumergiéndolos en etanol (solución 70%) durante 30 segundos y
dejar secar al aire o rociarlos con alcohol y esterilizar a la llama. En condiciones
asépticas romper cada huevo, separar la yema de la clara pasando la yema varias
veces de una mitad de la cáscara a la otra. Colocar las yemas en un frasco
estéril y agregar 4 veces su volumen de agua estéril y mezclar perfectamente.
Calentar la preparación en baño de agua a 47ºC durante 2 horas y dejar de 18 h
a 24 h a 3ºC ± 2ºC hasta que se forme un precipitado. Asépticamente recolectar

el sobrenadante y conservar en un frasco estéril. La preparación se debe

conservar a 3ºC ± 2ºC, durante un máximo de 72 h.
 Medio completo
Fundir el medio base, enfriar aproximadamente a 47ºC y agregar en condiciones

de asepsia la solución de telurito de potasio y la emulsión yema de huevo. Cada
solución debe ser previamente calentada a 47ºC en baño de agua y mezclar bien
después de cada adición.
Tabla 1. Composición
Agar Baird Parker 100 ml

Solución Telurito de potasio 1.0 ml
Emulsión yema de huevo 5.0 ml
 Caldo cerebro corazón infusión (BHI)
Disolver los componentes en agua destilada llevando a ebullición. Ajustar el pH
para que luego de la esterilización su valor sea de 7.4 ± 0.2 a 25°C. Dispensar en
porciones de 10 ml o 5 ml en tubos. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
 Plasma de conejo
Utilizar plasma de conejo deshidratado disponible en el comercio y rehidratar
siguiendo las indicaciones del fabricante. Si el plasma de conejo no está
disponible en el comercio diluir un volumen de plasma de conejo fresco estéril
con tres volúmenes de agua destilada estéril.
Si se ha utilizado citrato de sodio o citrato de potasio como anticoagulante,
agregar solución de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) para llegar a una
concentración de EDTA del 0.1 % en el plasma diluido.
 Nota: el plasma con oxalato o heparina no requiere del agregado de EDTA. El

plasma rehidratado o diluido debe ser utilizado inmediatamente al menos que el
fabricante de otras especificaciones. Antes de utilizar cada lote de plasma
realizar un control con una cepa de estafilococo coagulasa positiva y una cepa
de estafilococo coagulasa negativa.


 Inoculación: Transferir 1 ml de la suspensión inicial (dilución 1/10) en caso de

otros productos y las diluciones sucesivas preparadas, por triplicado a placas con
agar Baird Parker. Si para ciertos productos es necesario realizar un recuento de
un número bajo de estafilococos coagulasa positiva, el límite de detección puede
ser elevado por un factor de 10 sembrando 1 ml de la muestra si el producto es
líquido ó 1 ml de la suspensión inicial (dilución 1/10) en caso de otros productos,
y 1 ml de las diluciones sucesivas preparadas según, en una placa de Petri grande
con agar Baird Parker o en tres placas de Petri de 90 mm con agar Baird Parker.
En ambos casos, sembrar por triplicado utilizando 3 placas. Cuidadosamente
dispersar el inóculo sobre la superficie del agar con una espátula de Drigalsky lo
más rápido posible, tratando de no tocar los bordes de la placa.

 Incubación: Dejar secar las placas sin invertir, con la tapa puesta durante 15
minutos a temperatura ambiente. Invertir las placas sembradas e incubar a 35ºC
ó 37°C durante 24 h ± 2 h y luego 24 h ± 2 h adicionales.
 Después de la incubación de 24 h ± 2 h marcar en el fondo de la placa la posición

de cualquier colonia típica presente. También marcar las colonias atípicas
presentes. Tener en cuenta para el recuento sólo las placas que contienen como
máximo 300 colonias totales con 150 colonias típicas y/o atípicas hasta dos
diluciones sucesivas. Una de las placas debe contener al menos 15 colonias.
Seleccionar para la confirmación un número A de colonias (en general 5 colonias
típicas si sólo hay colonias típicas o 5 colonias atípicas si sólo hay colonias
atípicas o 5 colonias típicas y 5 colonias atípicas si se encuentran presente ambos
tipos en cada placa). Si en la placa hay menos de 15 colonias típicas y/o atípicas
inocular con el producto líquido sin diluir o con la más baja dilución de los otros
productos. Es posible realizar un recuento estimado como se describe.
 Nota 1: Las colonias típicas son negras o grises, con brillo y convexas (de 1 mm
a 1.5 mm de diámetro después de una incubación de 24 h y de 1.5 mm a 2.5 mm
de diámetro después de una incubación de 48 h) y rodeadas por una zona de
clarificación que puede ser parcialmente opaca. Después de una incubación de
por lo menos 24 h puede aparecer un anillo opalescente de precipitación
inmediatamente alrededor de la colonia. Las colonias atípicas son del mismo
tamaño que las típicas y pueden presentar una de las siguientes morfologías:
Colonias negras con brillo, con o sin un fino borde blanco, la zona de
clarificación está ausente o es vagamente visible y el anillo opalescente ausente
o poco visible. Colonias grises sin zona de clarificación
 Nota 2: Las colonias atípicas son formadas principalmente por cepas de
estafilococos coagulasa positiva presentes por ejemplo en productos lácteos,
camarones y menudencias. Con menos frecuencia son formadas por cepas de
estafilococos coagulasa positiva presentes en otros productos.

 Nota 3: Algunas bacterias pertenecientes a otros géneros pueden dar colonias de

apariencia similar a las de estafilococos, pero realizando una observación
microscópica con coloración de Gram antes de la confirmación se puede realizar
una separación de géneros.
 Nota 4: Las colonias restantes que pueden estar presentes en la placa y que no
presentan apariencia de colonias típicas (NOTA 1) o atípicas (NOTA 2) son
consideradas como flora acompañante. Para realizar un recuento estimativo de
un bajo número de estafilococos coagulasa positiva retener todas las placas que
contienen colonias típicas y atípicas, seleccionar todas las colonias para la
confirmación dentro de los límites establecidos arriba.
 Confirmación: prueba de la coagulasa: De la superficie de cada colonia
seleccionada remover un inóculo con ansa aguja y transferir a un tubo con caldo
cerebro corazón infusión (caldo BHI), incubar a 35ºC ó 37°C durante 24 h ± 2 h.
Asépticamente agregar 0.1 ml de cada cultivo en 0.3 ml de plasma de conejo (a
menos que otra cantidad sea especificada por el fabricante) en un tubo de
hemólisis estéril. Incubar a 35ºC ó 37°C.Inclinando el tubo observar la formación
de coágulo después de 4 h a 6 h de incubación. Si la prueba es negativa
reexaminar después de 24 h de incubación o examinar en el tiempo de incubación
especificado por el fabricante. Considerar un resultado positivo si el volumen del
coágulo formado ocupa más de la mitad del volumen del líquido original. Como
control negativo para cada lote de plasma agregar 0.1 ml de caldo BHI estéril a
0.3 ml de plasma de conejo e incubar sin inoculación. Para que la prueba sea
válida el control negativo no debe mostrar signos de coagulación.
 Cálculo del número a de estafilococos coagulasa positiva identificados por cada

placa seleccionada:
Calcular para cada una de las placas seleccionadas el número a de estafilococos

coagulasa positiva identificados de acuerdo a la siguiente ecuación:
Dónde:

Ac: es el número de colonias típicas sometidas a la prueba de la coagulasa

Anc: es el número de colonias atípicas sometidas a la prueba de la coagulasa
bc: es el número de colonias típicas que dieron positiva la prueba de la coagulasa
bnc: es el número de colonias atípicas que dieron positiva la prueba de la
coagulasa
Cc: es el número de total de colonias típicas que se contaron en la placa
Cnc: es el número de total de colonias atípicas que se contaron en la placa
Redondear a un número entero.
 Cálculo del número n de estafilococos coagulasa positiva:
Para las placas que contienen un máximo de 300 colonias con 150 colonias
típicas y/o atípicas en dos diluciones consecutivas calcular el número de
estafilococos coagulasa positiva para cada placa como se especifica en y calcular
como un promedio de las dos diluciones sucesivas, el número N de estafilococos
coagulasa positiva identificados, presentes en la porción de muestra sembrada,
utilizando la siguiente ecuación:
Dónde:
Σa: es el número de colonias de estafilococos coagulasa positiva identificadas en
todas las placas seleccionadas
V: es el volumen de inóculo en cada placa en mililitros
n1: es el número de placas seleccionadas de la primera dilución
n2: es el número de placas seleccionadas de la segunda dilución
d: es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada
Redondear el resultado calculado a 2 cifras significativas.
Informar el resultado como el número de estafilococos coagulasa positiva por
mililitro (productos líquidos) o por gramo (otros productos), expresado como un
número entre 1.0 y 9.9 inclusive multiplicado por 10x donde x es la potencia
apropiada de 10.
Ejemplo: El recuento después de la inoculación con 0.1 ml del producto dio los
siguientes resultados:
Para la primera dilución seleccionada (10-2): 65 colonias típicas y 85 colonias

típicas, no hay colonias atípicas

Para la segunda dilución seleccionada (10-3): 3 colonias típicas y 7 colonias
típicas, no hay colonias atípicas
Se obtuvieron los siguientes datos:
De las 65 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y
todas dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 65
De las 85 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y 3
colonias dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 51
De las 3 colonias todas fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y 3 colonias
dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 3
De las 7 colonias 5 colonias fueron sometidas a la prueba de la coagulasa y todas
dieron un resultado positivo, obteniendo entonces un valor de a = 7
∑C = 65+51+3 + 7 =57272
N=
V(n1+0,1Xn2)d 0.1(2+0,1x2)10−2
El resultado después de redondear se expresa como: 5.7 x103

3.4.DETECCION DE salmonella spp.

 Agar TSAYE
Suspender gramos del medio en agua destilada. Mezclar bien y disolver por
calentamiento con agitación frecuente. Hervir durante un minuto hasta su
completa disolución. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50ºC, mezclar bien. y dispensar en platos. El medio preparado debe
almacenarse a 8-15 ° C. El color es ámbar, ligeramente opalescente.
 Agar Sulfito Bismuto según Blair
Suspender gramos del medio en agua destilada. Mezclar bien y calentar agitando
continuamente. Hervir durante un minuto o hasta que el medio se disuelva por completo.
No autoclavar.
Dejar que el medio se enfríe a 45ºC (muy importante) y sin dejar de agitar verter en
placas de Petri. El color del medio preparado es blanco opaco con tinte verde. El medio
preparado en placa debe conservarse entre 8-15°C.
 Agar nutritivo (AN).
Rehidratar g del medio en agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para
disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión)
durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC. Vaciar en cajas de Petri
estériles. Conservar en refrigeración de 2 a 8ºC.

 Agar XLD (Agar Xilosa Lisina Desoxicolato)
Suspender 55.2 gramos del medio en un litro de agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente. Dejar hervir durante un minuto o hasta disolución completa. No
autoclavar. Distribuir en recipientes adecuados. Las placas preparadas deben
almacenarse entre 8-15°C. El color del medio preparado es rojizo naranja
 Agar Hektoen.
Disolver g en agua desmineralizada y dejar empapar durante 10 minutos. Calentar y
llevar a ebullición unos pocos segundos para disolver el medio completamente. No
esterilizar en autoclave.
 Caldo Müller-Kauffman tetrationato-novobiocina (MKTTn).
Caldo Tetrationato según Mueller-Kauffmann: Disolver gramos del medio en
agua destilada. Mezclar bien. Calentar brevemente y enfriar rápidamente. No
esterilizar en autoclave.
Añadir asépticamente 20 ml/litro de solución de yodo y yoduro potásico, 10
ml/litro de solución al 0.1% de verde brillante.
Distribuir en tubos o frascos repartiendo previamente de forma homogénea el
precipitado que eventualmente hubiera podido formarse. Una vez añadidas éstas
sustancias no volver a calentar. Utilizar el medio el mismo día de la preparación.
Los tubos o frascos preparados deben almacenarse entre 2-8°C. El color del
medio preparado es blanco leche
Disolver el yoduro potasico en 5 ml de agua destilada, añadir el yodo y calentar
cuidadosamente la solución hasta que se disuelva completamente. Llevar a un
volume final de 100 ml.
Añadir el verde brillante al agua destilada, agitar y calentar a 100ºC durante 30
minutos asegurando que se ha disuelto, conserva en frascos topacio
 Pre enriquecimiento en medio líquido no selectivo
Se tritura y homogeneiza el alimento con agua de peptona tamponada (APT) con

la ayuda de un stomacher. Se deja incubar el recipiente estéril (bolsa de plástico
con filtro) a 37±1ºC durante 18- 20 horas.

 Enriquecimiento selectivo
Transferir 0.1ml de cultivo obtenido en el pre- enriquecimiento a un tubo que

contenga 10 ml de caldo RVS, mezclar con vortex, incubar a 42°C x 24 h ± 3 h
Transferir 1 ml de cultivo obtenido en el pre- enriquecimiento a un tubo que
contenga 10ml de caldo MKTTn, mezclar con vortex, incubar a 37°C ± 1°C x
24 h ± 3 h
 Se debe utilizar mínimo dos medios selectivos por cada caldo de enriquecimiento
no selectivo y selectivo, para el aislamiento del microorganismo. El primer
medio de cultivo recomendado debe ser agar XLD, y el segundo medio puede
ser escogido por el laboratorio como: Agar Hektoen, agar Sulfito Bismuto. Aislar
por agotamiento el cultivo obtenido en caldo RVS utilizando dos placas
pequeñas (90mm a 100mm) de XLD. Use la misma asada para sembrar las dos
cajas una después de la otra, de modo que se obtengan las colonias bien aisladas.
Repetir el procedimiento con el segundo medio selectivo. Aislar por agotamiento
el cultivo obtenido en el caldo MKTTn y repetir el procedimiento descrito en el
punto 1, con los dos medios selectivos en placa. Incubar a 37°C ± 1°C: XLD 24
h ± 3 h Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de
colonias típicas y atípicas de Salmonella Marcar la posición en el fondo de la
placa.
 Nota: Las colonias típicas de Salmonella crecen en agar XLD con el centro negro
y una zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio de color
del indicador. Las colonias atípicas de Salmonella (lactosa – positivas) crecen en
agar XLD amarillas con ó sin ennegrecimiento. Selección de colonias para
confirmación, se toma de cada placa de cada medio selectivo por lo menos una
colonia que sea considerada típica o sospechosa y cuatro colonias más, si las
primeras son negativas. Sembrar las colonias aisladas y purificadas en placas de
agar TSAYE, incubar las placas inoculadas a 37°C ± 1°C x 24 h ± 3 h
 Confirmación de las colonias presuntivas de Salmonella
A partir de las colonias crecidas en agar nutritivo se realiza una siembra en un

tubo de agar con hierro Kligler. Con la ayuda de asa estéril se realiza una primera
siembra en una picadura en el interior del agar y luego una segunda siembra en
forma de zig-zag en la superficie inclinada. Se incuban los tubos Kligler a
37±1ºC durante 24 horas. Se realiza una primera lectura para verificar el
crecimiento y si es necesario se dejan incubar 24 horas más.

3.5.RECUENTO DE mohos y levaduras

 Agar Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC)
Disolver g del medio en agua destilada. Calentar agitando hasta ebullición para su
disolución. Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos
 Agar Diclorán 18% Glicerol (DG18)
Disolver 31,6 g del medio en 1 litro de agua destilada que contenga 220 g de glicerol
(SDA073). Calentar agitando hasta ebullición para su disolución. Autoclavar a 121
ºC durante 15 minutos.


 Inoculación e incubación: Incubar a las placas de agar a 22-25 ºC durante 5
días. Las placas se incuban en posición normal (no invertida) porque las colonias
de levaduras y hongos filamentosos crecen mejor de esta manera.
El número de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina

según la siguiente fórmula:
N= C
V. [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d
Dónde:
N= número de colonias por ml o g de producto

 C = suma de todas las colonias contadas en todas
las placas
n1 = número de placas contadas de la menor

dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d = dilución de la cuál fue obtenido el primer
recuento

MANUAL DE ANALISIS
MICROBIOLOGICO
(PROCEDIMIENTO DE RECUENTO DE
MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS
SOLIDOS Y LIQUIDOS).

3.6.Número de coliformes totales

1. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

1.1. MATERIALES
 Placas de Petri de vidrio o plástico
 Pipetas de 1 m
 Tubos
 Tubos Durham o fermentación
 Probeta de 100 ml
1.2. EQUIPOS
 Estufa de esterilización
 Autoclave
 Estufa de incubación: 30°C ± 1°C
 Baño de agua (44°C y 47°C)
 Equipo contador de colonias
 Peachímetro de exactitud 0.1 a 25°C ± 1°C
 Agitador mecánico (tipo vortex)
 Asas bacteriológicas
 Mechero bunsen
 Incubadora
 Stomacher
1.3. MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS

 Agua peptona bufferada (2%)
 Solución salina peptonada (SFP)
 Caldo Lauril Triptosa (CLT).
 Caldo lactosa.
 Medio EC
 Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovac
 Frascos gotero con indicador rojo de metilo
 Agua destilada.

2. DESARROLLO
2.1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
 SOLUCIÓN SALINA PEPTONADA (SFP)
Disolver los componentes en agua, si es necesario calentar. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C
según ficha técnica. Distribuir en frascos o tubos de acuerdo a las necesidades analíticas.
Esterilizar a 121°C durante15 minutos.
2.2. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES
 SUSPENSIÓN INICIAL
En un matraz estéril agregar una cantidad de masa x g o medir con una medición de ± 5
% un volumen x ml (como mínimo 10 g ó 10 ml a menos que se indique otra cantidad).
Agregar una cantidad del diluyente igual a 9 x g ó 9 x ml (dilución 1/10) y homogeneizar
entre 1 minuto a 3 minutos dependiendo del alimento.
La temperatura del diluyente debería ser aproximada a la temperatura ambiente, para
evitar daños de los microorganismos por cambios bruscos.
En algunos casos, particularmente para los productos muy viscosos o muy espesos, podría
ser necesario agregar mayor cantidad de diluyente lo cual debe tenerse en cuenta en las
operaciones subsiguientes y / o en la expresión de resultados.
 DILUCIONES DECIMALES
Transferir con una pipeta 1 ml (± 5 %) de la suspensión inicial en un tubo con 9 ml del

diluyente estéril. Para una óptima precisión no introducir la pipeta más de 1 cm en la
suspensión inicial y evitar el contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente
estéril. Mezclar utilizando preferentemente un agitador mecánico durante 5 segundos a 10
segundos para obtener la dilución 10-2.
Si es necesario repetir esta operación a partir de la dilución 10-2 y diluciones sucesivas,

utilizando en cada operación una nueva pipeta estéril para obtener las siguientes diluciones
(10-3, 10-4, etc.). Se hacen las diluciones que sean necesarias para obtener un número
apropiado de microorganismos para realizar el recuento.

IV. DURACIÓN DEL PROCEDIMIENTO
El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el instante

en que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe superar los 45 minutos,
mientras que el lapso de tiempo límite entre la preparación de la suspensión inicial y el
comienzo de la preparación de las diluciones decimales sucesivas es de 30 minutos.
2.3. SIEMBRA
Sembrar 1ml en 10 ml por triplicado cada dilución en tubos de caldo Lauril sulfato de sodio.
Agitar los tubos para su homogeneización.
Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h.
2.4. INCUBACION
Incubar a 35 º C durante 24 horas adicionales los tubos donde no se detectaron
gases. Estimar el número más probable de coliformes totales: contar el número de cultivos
con gases en tres diluciones consecutivas y seguir las recomendaciones que se indican.
2.5. REAFIRMACIÓN
Transferir “un asa” o una gota de cada tubo con gases de la prueba presuntiva a caldo BGLB
(verde brillante bilis), evitando en su caso la película superficial. Incubar los cultivos
en BGLB a 35°C durante 48 h. Calcular el NMP de coliformes utilizando la proporción
de tubos con producción de gases confirmada de los tubos seleccionados en la prueba
presuntiva.
6.1. CÁLCULO

 METODO DE CALCULO
El número de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina según la
siguiente fórmula:
N= C
( n1 + (0.1 x n2 ) d
Dónde:
N = número de colonias por ml o g de producto

 C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.

n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento
ANEXO

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

3.3.Recuento de Bacillus cereus……………………………………………..….….…..….19

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

3.6.2. Preparación de disoluciones……………….………………………….………....45

 Conocer el número de microorganismo que contienen un alimento como

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II. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

2.3.Medio de cultivo y reactivos

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

 Emulsión de yema de huevo

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

3.1.1. Preparación de medios de cultivo

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

3.1.3. Duración del procedimiento

 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el

 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra líquida

 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas que,

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

 Si menos de un cuarto (1/4) de la placa está cubierto por un crecimiento difuso o

 Redondeando el resultado como se indicó, el número de microorganismos es de

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

3.2. NUMERACIÓN DE Bacillus cereus

 Agua peptona bufferada (BPW)

 Agar manitol yema de huevo polimixina (MYP):

Luego de enfriar el agar MYP, agregar los 50 ml emulsión de yema de huevo,

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 Sangre de oveja desfibrinada

3.2.2. Preparación de disoluciones

 El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial y

 Inoculación: Transferir por medio de una pipeta estéril 1 ml de la muestra líquida

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

 Después de la incubación por el período especificado, seleccionar las placas,

que producen ácido, la característica de color rosa de las colonias de Bacillus

cereus puede reducirse o desaparecer por completo.

colonias deberían también ser sometidas al test de confirmación.

 Confirmación Tomar las colonias presentes, confirmar esas colonias como se

especifica, estriar 5 colonias presuntivas en placas con el medio selectivo (MYP).

Incubar las placas a 30°C durante 18 h a 24 h.

 Test de hemólisis en agar sangre de oveja

placas de MYP en la superficie de agar sangre de oveja de modo de obtener

colonias aisladas que permitan una buena interpretación de la reacción de

hemólisis. Incubar a 30°C durante 24 h y leer la reacción de hemólisis. Cada

colonia rodeada de una zona clara se considera hemólisis positiva.

Manual de control microbiológico Laboratorio Fitogreen 2019

3.2.6. Método de calculo

colonias se realice al menos en una placa que contenga un mínimo de 10 colonias.

El número de microorganismos N presentes en la muestra para análisis se calcula

como la media corregida de dos diluciones consecutivas, utilizando la ecuación.

 Método de cálculo después de la confirmación:

En este método donde se requiere de una confirmación para el recuento, se

El recuento ha proporcionado los siguientes resultados

Para la primera dilución escogida (10-3): 66 colonias

Para la segunda dilución escogida (10-4): 4 colonias

Realizando el análisis de las colonias escogidas: de las 66 colonias, se analizaron

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3.3.NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus

3.3.1. Preparación de medios de cultivo

 Agua peptona bufferada (BPW)

 Agar Baird Parker

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