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Laboratorio de Inmunología y Virología

PRÁCTICA 2
EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL

INTRODUCCIÓN
El ácido ribonucleico es una de las 3 principales macromoléculas que son esenciales para
todas las formas de vida, y al igual que el ADN está formado de una cadena larga de
nucleótidos. Existen varios tipos de ARN, pero las tres grandes clases son los implicados en
la traducción de proteínas: ARN mensajero, ARN de transferencia, ARN ribosomal. El ARN
mensajero representa del 3 al 5% del ARN total celular, el ARN de transferencia representa
del 5 al 7%, y el ARN ribosomal va del 85 al 90%.

La extracción de ARN total se puede realizar por 3 metodologías principales: a) extracción


mediante solventes con el reactivo TRIzol (Piotr & Sacchi, 1987); mediante columnas de
intercambio aniónico de sílice (Kumar & Garg, 2005); y mediante perlas magnéticas
(Berensmeier, 2006) .

OBJETIVO
Obtención de ARN de calidad molecular para la producción de ADNc de genes
específicos.

MATERIALES Y REACTIVOS

 Trizol  Microcentrífuga
 H 2 O DEPEC  Micropipetas 10 μL, 100 μL,
 Isopropanol GM (frío) 1mL
 Etanol GM 75%  Puntillas amarillas y azules
 Cloroformo  Microtubos
 Muestra de células  Hielo

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METODOLOGÍA

1. Por cada 300L de muestra añadir 700L de Trizol y homogenizar por inversión.
Utilizar vórtex si es necesario (sangre completa debe ser diluida 1:1 con H2O).
2. Incubar de 15-30°C (T.A) por 5min.
3. Añadir 200µL de cloroformo, mezclar por inversión e incubar 15-30°C durante 5min.
4. Centrifugar a 12,000 rpm por 10 min a 4°C.
5. Trasferir la fase acuosa a un microtubo (1.5ml) limpio (la fase orgánica puede servir
para aislar el DNA).
6. Añadir 500µL de isopropanol G.M. 100% para precipitar el RNA e incubar de 15-
30°C por 5 min.
7. Centrifugar 12000g por 10 min a 4°C. RNA forma pellets gelatinosos que pueden no
verse a simple vista.
8. Remover el sobrenadante y lavar con 1mL de etanol G.M. al 75% (o 70%), mezclar
en vórtex y centrifugar a 10,000rpm por 5 min a 4°C.
9. Remover el sobrenadante, dejar evaporar el etanol:
10. Dejar tapa abierta 5-10 min T.A.
11. Resuspender el RNA en 30μL de H2O libre de RNAsas (DEPEC).
12. Incubar por 10 min a 55-60°C.
13. Almacenar a -80°C.

RESULTADOS

Concentración A260 A280 A260/280


(ng/µL)
Muestra 1-444 112.4 2.809 1.905 1.47
Muestra 2-443 166,3 4,156 3,404 1,22

Tabla 1. Datos registrados por análisis de absorbancia de las muestras de ARN extraído del
Grupo 443 y 444

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DISCUSIÓN
La extracción de ARN total basada en sus características fisicoquímicas dio
como resultado una concentración total de 112.4 ng/μL, con una relación de
absorbancia A260/280 de 1.47. De acuerdo a Gott M. (2007) para considerar la
calidad del ARN extraído como una muestra pura debe mostrar valores entre 1.8
y 2 en la absorbancia A260/280 valores inferiores solo denotarían contaminación
por compuestos aromáticos, este resultado puede deberse a la solución Trizol
compuesto por una monofase de fenol – isotiocinanato de guanidinio utilizado
para la extracción de ARN, Rio D.(2010) expone que esta solución es ventajosa
en situaciones en las que el tejido esta enriquecido por RNAsa; El ingreso de
cloroformo nos provoca una separación de fases, precipitando las proteínas y el
ARN permanece en la fase acuosa, este compuesto es el encargado de la
eliminación de los polifenoes en la extracción(Hernadez G.,etc al ,2013). Se
deduce por tanto que la fase no fue limpia correctamente y su trasferencia al
microtubo limpio contenía polifenoles. Por su parte las absorbancia a A260/A230
registraron una valor de 0.26 inferior al dictado por Orfae A.(2011), el cual
expone que valores mayor a 1.7 son considerados como una extracción de
calidad, corroborándose así una contaminación de la muestra obtenida;
Comparando las absorbancias obtenidas por el grupo 443 el cual uso como
precipitado el isopropanol estándar o normal denoto una leve variación con las
absorbancias del grupo 444 el cual utilizo ispropanol de grado molecular,
afirmando que este último permitió una mayor precipitación de los ácidos
nucleicos de mayor calidad calculando una aumento aproximado de absorbancia
de .20, finalmente al obtenerse la precipitación de ARN este se resuspendió en
agua libre de ribonucleicas (DEPEC) para su almacenamie nto y posteriores
análisis, Chirgwin.J(1979) dicta que el uso del Dietilpirocarbonato en agua es
una forma de almacenamiento para el ARN por ser muy susceptible a la
degradación por las enzimas ribonucleasas .

CONCLUSIÓN
Los valores de absorbancia obtenidos denotaron la presencia de compuestos
contaminantes como son los polifenoles presen tes en la solución Trizol, debido
a un mal lavado durante la extracción, por su parte la comparación de los valores
registrados de absorbancia con isopropanol de grado molecular con los obtenidos
por el grupo 443 se puede afirmar que hay mejores resultados que el uso del
isopropanol estándar o normal para precipitación de los ácidos nucleicos.

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REFERENCIAS.
Gott M., (2007), RNA Modifications, Methods in enzymology, vol.45, Pp 29 -30.
Rio D., Eres M., Gregory J., (2010), Purification of RNA Using TRIzol, Cold Spring Harbord
Protocol, Pp 1-2.
Hernández G: A., Guzmán-Barney M., (2013), Comparación de métodos de extracción de RNA
para la detección por RT -PCR del Potato yello w vein virus, Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XV,
73-74.
Orfae A., Morent M., (2011), PNT Extracción de Ácidos Nucleicos, Red Nacional de
Biobancos ISCIII, Pp. 12.
Chirgwin J., Przbyla A., (1979), Aislamiento de ácido ribonucleico biológicamente activo a
partir de fuentes enriquecidas en ribonucleasa , Biochemistry vol 18, Pp 5294 -5295.

CUESTIONARIO

1. Explique porque es más sensible a la degradación por nucleasas el ARN que el ADN.

R: el ARn es muy susceptible a la degradación por ser una cadena monómera a


diferencia de ADN que es una cadena dúplex
2. Cuál es la función del DEPEC en la preservación del ARN

R: el compuesto Dietilpirocarbonato es una sustancia química que elimina las


ribonuclasas enzimas que degradan en gran mediad al ARN por ende su sus con agua
para el almacenamiento de ácidos nucleicos
3. Explica por qué es óptimo el TRIzol en la extracción de RNA y de que está
compuesto.

R: El uso del Trizol es más ventajosos ya que es posible la extracción de ADN y ARN
en un mismo procedimiento al igual es eficaz en la extracción de pequeños ARN,
está compuesto por una monofase de fenol- isotiocinanato de guanidinio
4. ¿Qué tipo de RNA se obtiene en la extracción?

R: Se extrajo por completo el ARN presente en la muestra es decir ARN


mensajero, Ribosoma y de trasferencia

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