Dr. Wilverth R.

Villatoro-Monzón Ecología Microbiana Facultad de Ciencias Químicas

PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN FINAL

Evaluación de la factibilidad del lavado de un suelo contaminado con HTP´s
mediante saponinas XXXX para su remediación

Se entiende como una descripción de los aspectos relevantes del trabajo a realizar.

Contiene información fundamental para conocer los propósitos académicos del alumno.

Esto es: el qué (problema) y para qué (objetivos), el cuándo (ruta crítica), el dónde
(ubicación), el cómo (metodología) y el con qué (instrumentos), se va a investigar un
aspecto de la realidad o teórico.

En casos especiales, se podrá presentar, aquellos protocolos autorizados por otras

materias que coparticipen en el proyecto.

Este protocolo deberá contener un mínimo de información que se ajuste a los siguientes
puntos:

I . DATOS GENERALES

- Título del proyecto

Evaluación de la factibilidad del lavado de un suelo contaminado con HTP´s mediante

saponinas para su remediación

- Nombre del alumno responsable

Fortanell Trejo Mabel
Ledesma Gallegos Jazmín
Martínez Marroquín Ma. Fernanda

- Actividades y funciones

Fortanell Trejo Mabel

Ledesma Gallegos Jazmín
Martínez Marroquín Ma. Fernanda

(Toma y caracterización de muestra, extracción de saponinas, lavado de suelo,

evaluación de resultado)

- Centro o lugar donde se realiza investigación

Universidad Autónoma de Querétaro

- Tipo de investigación básica, aplicada o tecnológica

Prueba experimental

- Duración aproximada
3 meses

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II. ANTECEDENTES Y/O FUNDAMENTACION TEÓRICA

Los Antecedentes consisten en describir la evaluación histórica del conocimiento acerca
del fenómeno o hecho a investigar.
La Fundamentación Teórica consiste en el planteamiento de:
a) La perspectiva desde donde se desarrollará el estudio (modelo teórico, básico).
b) Los elementos del tema que consideramos más significativos (variable con las cuales
va a interactuar el investigador).
c) Los instrumentos teóricos de análisis de los datos obtenidos.

III. JUSTIFICACIÓN
Consiste en la exposición de motivos o razones para su investigación.

IV. DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA

Consiste en identificar los fenómenos, hechos o situaciones, que puestos en relación
presentan incongruencia, obstáculos, desconocimiento o discrepancia y que constituyen
el objeto de estudio.

V. PLANTEAMIENTO TEÓRICO (Hipótesis, supuestos, pregunta, etc.)

El planteamiento se refiere a la elaboración de posibles explicaciones o soluciones a los
problemas planteados.

VI. OBJETIVOS
Los objetivos expresan las situaciones que se esperan resolver con la investigación

• Extracción, cuantificación, de saponinas xxxxx

• Caracterizar del suelo contaminado
• Implementar de un lavado de suelo empleado saponinas
• Evaluar la tecnología de remediación de suelo aplicada

VII. METODOLOGÍA

Toma de Muestras.

La muestra se tomará en la comunidad de San Nicolás, Tequisquiapan,

Querétaro, Con base en la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003.

Plan de muestreo.

Se tomarán 5 muestras compuestas de aproximadamente 3Kg cada una, para asegurar

que exista muestra tanto superficial como vertical (a una profundidad de 30cm). Serán
colectadas en frascos de vidrio de boca ancha con tapa y sello de teflón previamente
etiquetados con al menos su clave de identificación, lugar del muestreo o proyecto, y la
fecha y hora del muestreo, así como las iníciales de la persona que toma la muestra.
De acuerdo a los parámetros a analizar (Hidrocarburos fracción ligera, Hidrocarburos

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fracción media, Hidrocarburos fracción pesada, BTEX, HAP) se preservarán a una

temperatura de 4°C y un tiempo máximo de 14 días, exceptuando BTEX que es de 7
días. Posteriormente en el laboratorio se homogenizaran las muestras extendiéndolas
en una superficie limpia y seca obteniendo así una muestra representativa. Se
procederá a la caracterización de las muestras, cuidando que cumplan los siguientes
criterios:

 HTP < 50 000 ppm.

 pH entre 6 y 9.
 Contenido de humedad entre el 70 y 95 % de la capacidad de campo.
 Bajo contenido de arcilla y/o limo.
 C:N:P:K debe ser aproximadamente de 100:15:1:1.
 Metales tóxicos < 2 500 mg/Kg.

La caracterización del suelo se realizará de acuerdo a la NOM-021-RECNAT-2000 que

establece las especificaciones de fertilidad, salinidad, clasificación de suelos. Estudios,
muestreo y análisis en el ANEXO 1.

La caracterización se hará en base a los niveles máximos permitidos de hidrocarburos

en el suelo de acuerdo a la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003, “Límites máximos
permisibles de hidrocarburos en suelos y las especificaciones para su caracterización y
remediación” estos niveles se enlistan a continuación en la tabla 2.

Tabla 2: Límites Máximos permisibles de las fracciones de hidrocarburos para diferente uso de
suelo.
Uso de suelo predominante
Fracción de (mg/kg base seca)
hidrocarburos Agrícola Residencial Industrial
Ligera 200 200 500
Media 1200 1200 5000
Pesada 3000 3000 6000

LAVADO DE SUELO

Depende de la planta elegida…

PRUEBAS DE LAVADO DE SUELO CON SURFACTANTES

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Se pesarán 6 gramos de suelo y se colocará en un vial color ámbar, se agregarán 20ml

de la solución de lavado anteriormente preparada, se agitará durante 23hrs a 95rpm y
una vez transcurrido ese tiempo se dejará sedimentar por una hora, posteriormente se
retirará la mayor cantidad de sobrenadante que se pueda mediante la decantación, el
suelo se pondrá a secar en una charola de aluminio para determinar la concentración
de HTP’s y evaluar la remoción de los mismos.

Diseño Experimental.

Suelo (6gr) más agua destilada.

Línea
1

Suelo contaminado (6gr) mas extracto

Línea diluido al 10%.
Extracto de XX
2

Línea Suelo contaminado (6gr) mas extracto

3 concentrado.

DETERMINACIÓN DE SAPONINAS

Muela finamente la muestra y séquela a peso constante. Pese alrededor de 40 g y colóquela a

reflujo con acetona en el extractor soxhlet por al menos 24 horas para remover lípidos,
pigmentos, etc. Cambie el solvente por metanol y continúe la extracción por al menos otras 24
horas. Deje enfriar el extracto metanólico y llévelo a 250 ml con metanol.

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En este punto hay una modificación al método propuesta por Miriam Monforte (CICY, Mérida,
Yucatán, México). En lugar de llevarlo a 250 ml como sugiere el método original, es más
recomendable concentrar la muestra, lo que permite cuantificar cantidades muy pequeñas de
saponina, para lo cual, pase el extracto metanólico a un rotoevaporador y concentre a
sequedad. Resuspenda el residuo con un mínimo de metanol y páselo a un vial previamente
pesado; si no se va a usar de inmediato, seque con nitrógeno y guárdelo en desecador. Pese el
vial con la muestra seca y calcule el peso del residuo. Para utilizar la muestra, resuspenda con
una cantidad conocida de metanol (alrededor de 1 ml).

Cromatografía cualitativa en capa fina

Coloque puntos del extracto sobre una placa de gel de sílica y revélelos con una solución n-
butanol-etanol-amoníaco concentrado (3.5:1:2.5). Se pueden aplicar tres diferentes métodos
para identificar las manchas de saponina: (1) aspersíon con ácido acético-anisaldeido; (2)
tratamiento con nitrato de plata seguido de hidróxido de sodio y (3) tratamiento con una
suspensión de eritrocitos en buffer isotónico. Para mayores detalles consulte a Fenwick y
Oakenfull (1981).

Cromatografía cuantitativa en capa fina

Coloque series de puntos con volúmenes conocidos del extracto y de una solución estándar de
saponina sobre las placas de cromatografía. Los puntos deben ser colocados de tal manera que
cada punto de extracto vaya al lado de los de estándar de saponina. Revele las placas de la
misma manera que en el apartado anterior y las manchas deben ser visualizadas mediante la
aspersíon de una solución de ácido sulfúrico en metanol, seguida de calentamiento a 110°C por
30 min. Mida la intensidad de las manchas de saponina por medio de un densitómetro y calcule
las áreas de los picos en el graficador con un planímetro. los resultados son expresados como
la relación (R) de las áreas de los picos de la muestra desconocida con respecto a la del
estándar.

Se ha determinado que la concentración de saponina en la muestra (en μg) es proporcional al

cuadrado de las áreas relativas (R2). Grafique R2 contra el volumen de la gota de extracto
metanólico colocada en la placa. La pendiente de la línea (calculada por el método de
cuadrados mínimos), divido entre la pendiente de una línea obtenida de una curva patrón, dará
la concentración de la saponina en el extracto y de esa manera, el contenido de saponina en la
muestra. El método puede tener un error experimental acumulado de ±20%.

(http://www.fao.org/docrep/field/003/ab489s/AB489S05.htm#ch5.1)

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FIGURA 33

Determinación de saponinas

a) Cronograma

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Actividad
Septiembre
6 Toma de muestra y caracterización:
Densidad aparente, textura, humedad, pH, conductividad eléctrica,
13 Determinación de HTP´s, Digestión para metales pesados
20 Determinación de metales pesados
27 Extracción de saponinas
Octubre
4 Extracción de saponinas
11 Finalización de caracterización
18 Aplicación de tecnología de remediación
25 Aplicación de tecnología de remediación
Noviembre
1 Aplicación de tecnología de remediación:
Determinación de HTP´s, Densidad aparente, textura, humedad,
pH, conductividad eléctrica, Carbón orgánico total
8 Evaluación de tecnología de remediación
15 Evaluación de tecnología de remediación
22 Análisis de resultados
29 Reporte final
Diciembre
1 Entrega de reporte

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VIII. RESULTADOS ESPERADOS, POSIBLES APLICACIONES Y USO DEL

PROYECTO
Impacto, proyección y trascendencia de la investigación, ya sea a nivel científico,
tecnológico, económico, cultural o social.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Relación de libros y revistas consultadas para la colaboración de los antecedentes, así

como material de consulta para el desarrollo de la investigación.

• Mulligan, C., Fukue M., y Sato Y. (2010). Sediments contamination and

sustainable remediation. CRC Press y IWA publishing. USA.
• NOM- 021 RECNAT 2000
• NOM- 138- SEMARNAT/SS2003