ADN RECOMBINANTE O CLONACIÓN CELULAR

La técnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulación de la expresión génica, en la regulación de la
producción comercial de síntesis de proteínas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de
organismos transgénicos y en la amplificación del ADN, es decir, en obtener un gran número de copias de un gen
determinado. En este último caso, existe una técnica mejor, denominada con las siglas PCR.
La técnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector y éste, a su vez, dentro de una célula,
denominada célula anfitriona. Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizándose así la proteína
codificada en el gen. Además, al dividirse la célula, las nuevas células formadas contienen ese gen que también
sintetizan esa proteína. Se genera un grupo celular que contiene un genoma distinto.

MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBIANTE

Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados son los siguientes:
Transformación: es un tratamiento fisico-químico para bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de la
membrana. En ese momento se dice que la célula es competente, ya que pueden penetrar los ADN recombinantes en el
interior celular. Las células se hacen competentes cuando en un cultivo celular a 0ºC, con presencia de Ca++, se produce
un brusco cambio de temperatura, llegando a 37º-43ºC.
Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una
micropipeta. Este método es utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse que se ha introducido el ADN. Debido a
la laboriosidad del proceso, sólo es utilizado sobre ovocitos o cigotos. Por contra, puede prescindirse del vector e
introducir directamente el ADN seleccionado.
Lipofección: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeñas vesículas fosfolipídicas. Estos liposomas
se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su interior se introduce en la célula.
Electroporación: método físico activo en el que una solución con células y ADN recombinante es sometida a descargas
eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.
Transfección: método físico activo de gran eficacia, donde el vector es un virus. El virus introduce el ADN recombinante
mediante el mecanismo normal de infección viral.
Microproyección o biobalística: método físico activo en el que se utiliza una micropistola que dispara microbalas de
acero en las que va impregnado el ADN. Se utiliza sobre suspensiones celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre
órganos como piel, hojas, etc.

ETAPAS EN LA PRODUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE

1. Preparación de la secuencia del ADN para su clonación
2. Preparación de un vector de clonación
3. Formación del ADN recombinante
4. Introducción del ADN recombinante en una célula anfitriona
5. Propagación del cultivo
6. Detección y selección de clones recombinantes

Preparación de la secuencia del ADN para su clonación

Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y concentrarse.
Partimos de células con núcleo, que deben ser lisadas (rotas).
Las proteínas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares deben separarse del ADN.
El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por acción de las enzimas de restricción.
Se aísla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida o por centrifugación.
Si el ADN debe expresarse hay que añadir los segmentos reguladores de la expresión génica.

Preparación de un vector de clonación

El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes
características:
Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como, por ejemplo, un plásmido.
Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción y que sean conocidos.
Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad.
Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.
Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas. Un ejemplo de marcador
puede ser la resistencia a un antibiótico.

Las etapas del proceso consisten en:

Cortar el vector con enzimas de restricción, las mismas enzimas que se utilizaron para cortar el ADN que se quiere
insertar.
Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.
Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto, o simplemente, inserto.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plásmidos, virus como el fago l, cromosomas creados de forma artificial y
quimeras.

Formación del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unión covalente del vector y el ADN inserto mediante una ligasa. Así se realiza el sellado de
la llamada Mella, Muesca o Nick.
Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona
Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el
ADN recombinante en una célula anfitriona.

Los tipos de células anfitrionas son:

Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo coste de
mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables.
Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células
tumorales:
Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de
proteínas eucariotas.
Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen
los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables.
Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que
la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas.

Propagación del cultivo

Se induce la división de células anfitrionas, de forma que se producen también copias de ADN recombinante y, por ello,
la clonación. Primero se efectúa una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se dejan crecer las
colonias. Cada una de ellas será seleccionada y transferida a distintos medios líquidos, donde seguirá aumentando el
número de individuos de la colonia.

Detección y selección de los clones recombinantes

En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células. Al final del proceso se hace necesario separar las
células que contienen ADN recombinante de las que no lo contienen.
La detección y la selección de colonias se realizan en los medios de cultivo. En los procesos de clonación se obtienen
células anfitrionas que no han incluido el vector, células recombinantes, es decir, que han incluido el vector con el ADN
para recombinar, y células anfitrionas con vector que no lleva el ADN inserto.
Los métodos para detectar y seleccionar son:
Método de hibridación: se utiliza una sonda marcada que hibrida con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que
se transcribe a partir de él.
Método inmunológico: se detecta la proteína codificada en el ADN recombinante mediante anticuerpos específicos.
Métodos genéticos: que, a su vez, pueden ser:
Inserción del vector y el ADN recombinante en un gen de la célula anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la
colonia no produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen.
Vector con genes de resistencia a un antibiótico: en el medio se agrega el antibiótico y sólo crecerá aquella colonia que
sea resistente a él, por tanto, que porte el ADN.
Colonias con defectos nutricionales: se utilizan células anfitrionas mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un
aminoácido. Para que la colonia sobreviva, el aminoácido debe ser añadido al medio de cultivo. Empleando un vector
que lleve el gen correcto para la síntesis de dicho aminoácido, haciendo crecer las colonias celulares en medios carentes
de él sólo crecerán las bacterias que lleven el ADN inserto.

1. Realiza un mapa conceptual sobre la lectura

2. Ejercicio de apareamiento
Coloumna A Columna B
Introducción del ADN en el interior celular con micropipeta. Transformación
Introducción del ADN en el interior celular con una microbola de acero. Transfección
Introducción del ADN con descargas eléctricas. Lipofección
Se utiliza un virus para introducir el ADN. Microinyección
El transportador del ADN es un liposoma. Biobalística
Variación de la permeabilidad de las membranas biológicas por tratamiento fisicoquímico. Electroporación

1 Las secuencias de restricción son: A El ADN del vector se clona.

A Las que aparecen en el ADN recombinante.
B Las que aparecen en los vectores.
C Donde reconoce y corta la enzima de restricción.
D Siempre iguales.
2 La amplificación se realiza:
A Nada más que con la técnica del ADN recombinante.
B Únicamente por clonación celular.
C Mejor, mediante la técnica de la PCR.
D Solamente por la técnica de la PCR.
3 La célula que porta el ADN recombinante se llama:
A Bacteriana. B Huesped.
C Clonadora. D Anfitriona.
4 La amplificación del ADN consiste en:
A Hacer el ADN más largo.
B Hacer muchas secuencias de ADN.
C Hacer el ADN más grande.
D Hacer muchas copias de una secuencia de ADN.
5 En la clonación celular
B Un fragmento de ADN se introduce en un vector.
C Se introduce el vector solo en otra célula.
D Un vector se introduce en un fragmento de ADN.
6 Las enzimas de restricción
A Actúan solamente sobre el vector.
B Actúan cortando secuencias de restricción.
C Actúan sobre secuencias al azar.
D Actúan sobre la célula anfitriona.
7 Las enzimas de restricción originan:
A Solamente extremos romos.
B Únicamente extremos 3'.
C Extremos cohesivos y romos.
D Nada más que extremos cohesivos.
8 El ADN introducido en un vector es el ADN:
A Portátil. B Traslocado.
C Quimérico. D Inserto