Kutikula serangga adalah struktur ekstraseluler yang berfungsi baik sebagai kulit dan

kerangka. Kutikula tersusun dari dua lapisan utama, sebuah epicuticle luar dibangun dari
protein dan lilin, dan mengandung procuticle dalam kitin, polimer N-asetilglukosamin, dan
protein. Subset spesifik dari protein kutikular siap diekstraksi dari kutikula yang tidak sengaja
oleh agen denaturasi (misalnya, 1% SDS atau 7 M urea), tetapi tidak oleh buffer netral
dengan kekuatan ionik sedang. Protein kutikula yang larut dalam urea ini dapat membentuk
lebih dari 20% dari berat kering sebuah kutikula dan dianggap berasal dari procuticle karena
ketika direnaturasi mereka mengikat kitin.
Beberapa kutikula terbentuk selama perkembangan serangga, seperti pertumbuhan
dan perkembangan terjadi, akan ditumpahkan dan diganti dengan yang baru. Dalam tiga
kutikula larva Drosophila melanogaster, satu per instar, diendapkan oleh epidermis larva.
Cakram imajinal, organ terutama terdiri dari lipatan epitel yang berkembang menjadi struktur
integral dewasa, membentuk dua kutikula. Yang pertama, kutikula kepompong, disimpan
selama periode persiapan (0-12 jam setelahnya pembentukan puparium pada 25 ° C).
Kutikula kepompong unik dalam banyak hal. Tidak pernah terpapar eksterior organisme, itu
masih relatif tipis dibandingkan dengan kutikula larva dan dewasa, tidak menjadi
kecokelatan, dan tidak membedakan struktur kutikula khusus. Kutikula dewasa terbentuk
mulai sekitar 48 jam setelah pembentukan puparium.
Penggunaan kultur in vitro yaitu pembentukan dan apolisis kutikula yang
dikendalikan oleh kelas hormon steroid yang dikenal sebagai ecdysteroids. Dalam
Drosophila melanogaster hormon in situ penyebab molting dan pembentukan puparium
adalah 20-hydroxyecdysone. Efek dari ecdysteroid pada cakram imajinal tidak terbatas pada
pembentukan kutikula. Hormon pertama menyebabkan morfogenesis cakram untuk
membentuk bentuk pelengkap dewasa, diikuti oleh pengendapan pupa kutikula, dan akhirnya
pembentukan kutikula dewasa yang sangat berbeda. Semua kutikula Drosophila
melanogaster mengandung, selain kitin, beberapa mayor dan minor protein yang larut dalam
urea yang terkait secara imunologis tetapi dikodekan oleh gen diskrit.
Dalam laporan ini kami menjelaskan studi tentang sintesis protein kitin dan kutikula
pup oleh cakram imajinal dikultur in vitro. Karena prosedurnya biasa digunakan untuk
memantau sintesis kitin memiliki kekurangan (misalnya penggabungan dari ["Hlglucosamine
menjadi fraksi kitin adalah ukuran samar-samar sintesis kitin) kami menggunakan tiga teknik
independen untuk menunjukkan pengendapan kitin: (1) mengikat cakram protein terkonjugasi
fluoroscene mengikat chitin itu; (2) mikroskop elektron transmisi; (3) penggabungan [3H]
glukosamin ke dalam a fraksi kitin. Hasil ini memberikan pemahaman awal, dan membentuk
dasar untuk penyelidikan lebih lanjut tentang, kontrol temporal dan terkoordinasi sintesis
komponen kutikula dan hubungan sintesis itu dengan morfogenesis cakram imajiner.

MATERIAL DAN METODE

Kondisi Stok dan Kultur
Strain Oregon R dari Drosophila melanogaster yang dipelihara secara massal di laboratorium
sejak 1965 digunakan. Cakram imajiner diisolasi secara massal dari larva instar menengah ke
akhir. Cakram diinkubasi secara in vitro dalam media kultur Robb pada suhu 25 ° C dalam
labu Ehrlenmeyer (Nalgene) pada pengocok timbal balik.

Bahan Kimia dan Isotop

Sebagian besar bahan kimia dan isotop diperoleh dari sumber komersial termasuk kitinase
(dari Streptomyces griseus) dari Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri.
Diflubenzeron adalah hadiah dari Thomson-Hayward Chemical Company, Kansas City,
Missouri; Polyoxin D hadiah dari Edward Marks USDA, Fargo, North Dakota; 20-
hydroxyecdysone hadiah dari Denis Horn, CSIRO, Melbourne, Australia; tunicamycin adalah
hadiah dari G. Tamura, Universitas Tokyo, Jepang. Sianat telah dihapus dari larutan 7 M dari
urea analitik dengan melewati Amberlite MB3

Isolasi Protein Kutikula

Protein larva. Protein kutikula larva (LCPS)2 diekstraksi dari kutikula larva instar ketiga.
Protein kepompong. Ekstraksi protein kutikula kepompong (PCP) dari kutikula kepompong
dari kepompong ke 20-hro. Prosedurnya mirip dengan untuk LCPs.
Protein kutikula pupa juga diperoleh dari cakram setelah kultur in vitro yang sesuai. Cakram
yang diinkubasi dengan leusin [3H] leucine (125 Ci / ml) dipulihkan dan dicuci tiga kali
dengan sentrifugasi melalui larutan Ringer dalam centrifuge klinis (1000 rpm). Cakram
(100,000 / sampel) dihomogenisasi dalam permukaan kaca homogenizer pada 0-5 ° C dalam
5 ml NaCl, 5 mM Tris, pH 7,0. Homogenat dipindahkan ke tabung centrifuge 15-ml dengan 5
ml buffer dan disentrifugasi pada 17.000g pada suhu 5 ° C. Pelet dicuci tiga kali dalam 0,5 M
NaCl, 5 mM Tris-maleat, pH 7,0, oleh sentrifugasi pada 17,000g. Pelet itu diresuspensi dan
diekstraksi pada 0-5 ° C selama 30 menit dalam 7 MUT (7 M urea, 5 mM Tris-HCl, pH 8,6).
Supernantan ditemukan setelah sentrifugasi dan dituangkan ke dalam kolom DEAE-cellulosa
pendek (1 cm DEAE dalam insulin 3-cc jarum suntik) yang telah diatur sebelumnya dengan 7
MUT. Kolom dicuci dengan 2-5 ml 7 MUT. Protein dipindahkan dengan 7 MUT yang
mengandung 0,1 M NaCl dan tiga fraksi tetes (kira-kira 0,25 ml) dikumpulkan. Protein yang
dielusi diperoleh dalam dua fraksi.

Persiapan LCP Konjugasi Fluoresen

LCPs (5-10 ml larutan; 2,0 OD280/ ml) terkonjugasi dengan fluoresen isothiocyanate.
Fluoresen - terkonjugasi LCPs (FITC-LCPs) dipisahkan dari fluoresensi tanpa ikatan dengan
filtrasi gel pada Biogel-PlO kolom (0,9 X 20 cm) dalam buffer pengikat yang mengandung
0,1% natrium azida. Fraksi volume void yang mengandung protein fluoresen - terkonjugasi
ditemukan, dikumpulkan, dan disimpan beku dalam gelap di -12 ° C.

Uji untuk Kitin Menggunakan Fluorescene-Conjugated LCPs

Cakram (20.000-40.000) ditemukan dari media kultur dengan pelet dalam centrifuge klinis
dan dicuci dua kali dengan Drosophila Ringer dan dipindahkan ke tabung centrifuge
polietilen. Cakram kemudian diperbaiki dalam 1 ml 2% formaldehyde dingin (0-5 ° C) dalam
buffer cacodylate 0,1 M, pH 7,4, dalam air es selama 10 menit. Cakram yang tetap dibilas dua
kali dalam Drosophila Ringer dan kemudian ditempatkan dalam 1 ml 7 MUT selama 30
menit dalam penangas es. Urea dihapus dengan mencuci cakram tiga kali dengan sentrifugasi
dalam buffer yang mengikat. Pelet terakhir dengan hati-hati disuspensikan kembali dalam
0,15 ml larutan FITC-LCPs dan diinkubasi dalam gelap selama 30 menit pada suhu kamar.
Cakram itu kemudian dicuci tiga kali dalam 0,5 M Tris, pH 7,0. Sampel cakram disuspensi
dalam setetes buffer pengikat ditempatkan pada kaca mikroskop dan diratakan dengan kaca
penutup, kemudian dilihat dengan mikroskop fluorescent menggunakan sumber uv.
Setidaknya 20 cakram dibuat skor untuk setiap kondisi inkubasi pada skala 0 (no fluoresensi)
hingga 3 (fluoresensi maksimum).

Teknik EM
Cakram diperbaiki selama satu malam pada suhu 4 ° C dalam glutaraldehid 2% dalam 0,05 M
natrium cacodylate, postfixed dalam 2% osmium tetroksida, didehidrasi dalam etanol diikuti
oleh propilena oksida, dan tertanam dalam Epon. Bagian ("perak") diwarnai dengan uranyl
acetate dan bismuth subnitrate dan diperiksa dalam mikroskop elektron Zeiss IA.

Penggabungan dari [+ H] Glucosamine dalam Kitin

Kondisi inkubasi. Cakram yang diisolasi secara massal (2000-6000 / ml) diinkubasi pada
suhu 25 ° C dalam media Robb yang dilengkapi dengan 1% BSA (w / v). Saat ini, 20-
hydroxyecdysone dihapus setelah 6 jam inkubasi dengan mengumpulkan cakram pada 1 g
dan mencuci tiga kali dengan 10 ml volume larutan salin fosfat di 25 ° C. Untuk eksperimen
dengan inkubasi kontinu hormon, 20-hydroxyecdysone ditambahkan segera kembali setelah
mencuci. [3H] glukosamin (19-21 Ci / mmole; 38 Ci / mmole) biasanya ditambahkan segera
setelah pencucian untuk memberikan konsentrasi 1 Ci / ml media.
Pengujian kadar logam. Cakram (sekitar 10,000 / sampel) dipulihkan, dicuci tiga kali dengan
volume 15 ml Drosophila Ringer's dingin, dan disimpan dalam 95% etanol di -12 ° C. Untuk
analisis, etanol dihilangkan dan RNA dihidrolisis sebagian dalam 2 ml 0,3 N NaOIl untuk 1
jam pada 37 ° C. Diikuti penambahan 2 ml 1 M asam perklorat, sampel disimpan di atas es
selama 1 jam. Endapan yang dihasilkan dipulihkan dengan sentrifugasi dalam centrifuge
klinis pada 3400 rpm selama 12 menit. Jumlah RNA yang ada di setiap sampel diperkirakan
dengan mengukur Od260 dari supernatan yang dinetralkan dan menggunakan hubungan yang
diturunkan secara empiris dari 1 OD 260 = 38,9 g dari RNA yang terhidrolisis sebagian.
Setiap pelet dicuci ke dalam Tabung Pyrex screwcap 10-ml dengan dua, 2,5 ml volume 3 N
NaOH dan diinkubasi selama 20 jam pada 70 ° C. Bahan basa-tidak-terhidrolisa dikumpulkan
pada filter serat gelas (Whatman, GF / C) dan dicuci secara luas dengan air dan kemudian
etanol. Setelah pengeringan, filter ditempatkan dalam cairan kilau berbasis xylene (25%
Triton X-114, 0,3% PPO) dan dihitung.
Digesti kitinase. Basa hidrolisat mengandung kitin yang diduga disesuaikan dengan pH 6 dan
didistribusikan dengan dua tabung Corex 15-ml. Bahan tidak larut dibentuk dalam centrifuge
klinis pada 3400 rpm selama 8 menit. Supernatan dihilangkan dengan aspirasi menyisakan
volume 1,5 ml. Satu tabung menerima 1,5 ml larutan kitinase yang disterilkan dengan
saringan (2 mg / ml, 0,1 MPOI, pH 6,0) memberikan konsentrasi 1 mg kitinase / ml dalam
buffer PO4 0,05 M. Tabung kontrol hanya menerima buffer. Campuran reaksinya diinkubasi
selama 2 hari pada 25 ° C. Isi setiap tabung reaksi dikumpulkan pada filter serat gelas
(Whatman GF / C) dan dicuci dengan air dan etanol. Setelah kering, saring ditempatkan dan
dihitung.

Prduksi Antibodi
Persiapan antisera kompleks terhadap kutikula protein.

Elektroforesis
Elektroforesis dilakukan dalam slab polyacrylamide gel (1,5 mm X 15 cm X 22 cm) dengan
sistem penyangga terputus yang dimodifikasi. Pemisahan gel disiapkan dalam 75 mM Tris-
HCl, pH 8,6, dengan konsentrasi total akrilamida 15%. Gel dibentuk dengan atau tanpa 7 M
urea. Sampelnya diperkenalkan untuk elektroforesis dalam 7 MUT. Buffer elektroda adalah
25 mM Tris, 0,67 M glisin, pH 8,6. Elektroforesis dilakukan pada suhu kamar pada tegangan
konstan 100 V selama 30 menit pertama, kemudian 150 V sampai bagian depan pewarna 3
cm dari bawah. Gel diwarnai untuk protein menggunakan Coomassie brilian biru.