Anguie

La primera molécula de ADN recombinante fue creada por Paul Berg, a comienzos de
los 70. Para aquella época, los biólogos moleculares habían aprendido a alterar genes
individuales, cortar y pegar pedazos de ADN de diferentes organismos y moverlos de
uno a otro

¿Qué es la tecnología del ADN recombinante?

ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos
fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante es el
conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior
manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un
organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le
sea totalmente extraña.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala,

ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una
superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida
por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las
bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de
proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. A esto
justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o
de sus productos con fines prácticos.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a

varias líneas de investigación: 1) el conocimiento de las enzimas de
restricción, 2) la replicación y reparación de ADN, 3) la replicación de virus y
plásmidos y 4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

¿Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares:

enzimas de restricción
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas -las
enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como "tijeras
moleculares", cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin
dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbiólogos al
Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniería genética.

Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra
virus y degradan el ADN extraño.

A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción
mediante metilaciones (es decir, el agregado de un grupo metilo [-CH3)]) en un
átomo específico de ciertos nucleótidos.

Estas moléculas son indispensables para la ingeniería genética, ya que producen

fragmentos que se pueden unir entre sí fácilmente (con la ayuda de un "pegamento
molecular": la enzima ligasa).

Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los

extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras
asimétricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena
complementarios entre sí. Por otro lado, los extremos romos son generados cuando la
enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena
 Enzimas de restricción. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos.
En el primer caso, el corte genera nucléotidos de simple cadena llamados extremos
cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. En
el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos
también pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los
extremos no son complementarios, la unión será más inespecífica.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN recombinante usando enzimas
de restricción y ligasas, el desafío siguiente fue cómo producir grandes cantidades de
genes y cómo introducirlos en bacterias u otras células huésped. El primer problema fue
solucionado con el uso de plásmidos, pequeñas moléculas de ADN circular presente en
muchas bacterias.

Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de
autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite
replicarse de manera independiente del ADN genómico.

Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. Este

proceso consta de las siguientes etapas:

1. Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para

generar extremos cohesivos.
2. Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de
que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean
complementarios y puedan unirse.
3. Unimos el gen que queremos introducir (inserto) por medio de la enzima
ADN-ligasa y luego introducimos el plásmido con inserto en bacterias.
4. Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plásmido con la
ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de
resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo
las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia)
sobrevivirán, mientras que las que no lo tengan morirán.

Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del ADN
incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula
multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, esta técnica
lleva el nombre de clonación. El término clon proviene de la jardinería; desde hace
siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de gajos. Estas plantas son
genéticamente idénticas y constituyen un clon.

Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas.

El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la ingeniería

genética, ya que sirven para transferir material genético de un organismo a otro.

Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a

otro

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos:

sondas y anticuerpos
Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como encontrar
una aguja en un pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea, probablemente
usaríamos un imán para atraer la aguja (siempre y cuando esta sea de metal y posea
propiedades magnéticas). De manera análoga, hoy día podemos encontrar genes o
proteínas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan como imanes
moleculares.

Durante las décadas de 1970-1980, la manera más práctica de hacer múltiples

copias de una secuencia particular de ADN era introduciendo una molécula de
ADN recombinante (un plásmido más un gen) en una célula huésped. Esto
podía resultar un poco engorroso, ya que muchas veces se disponía de una
cantidad muy pequeña de moléculas de ADN para realizar pruebas

Esta se basa en la separación de ambas hebras de ADN, la posterior unión de pequeños

fragmentos (denominados primers) y la extensión de estos fragmentos usando de
molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en
cada ciclo de reacción. Para llevar a cabo esta reacción se requiere de una enzima
polimerasa que sea capaz de soportar la alta temperatura del proceso de
desnaturalización. Esta enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de una
bacteria termófila (la Thermus aquaticus), resistente a altas temperaturas.

La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de manera

espectacular y su sensibilidad es tal que alcanza con una molécula para que la reacción
genere una infinidad de copias. Esto la convierte en una importante, si no
imprescindible, herramienta para el análisis de filiación o de criminalística forense, ya
que con sólo una pequeñísima muestra se pueden realizar diferentes estudios
comparativos que nos permiten conocer el dueño de un "rastro" genético en particular.

También se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico médico, como la

detección de virus o de mutaciones que provocan enfermedades genéticas, a partir de
una muestra de ADN tan pequeña como un cabello o una gota de sangre.

Otra aplicación de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es la

transcripción inversa de ARNm. Mediante el uso de una enzima de origen viral
denominada transcriptasa reversa puede usarse como molde una molécula de ARNm,
transcribirla a una secuencia de ADN, y luego ser amplificada como cualquier otra
secuencia por la reacción en cadena de la polimerasa, con lo que se obtiene una gran
cantidad de ADN a partir de unas pocas moléculas de ARNm. Esta técnica es muy
empleada para el estudio de expresión génica, así como para la producción de proteínas
en diferentes organismos.

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos:

sondas y anticuerpos
Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como
encontrar una aguja en un pajar. Si tuviéramos que realizar dicha tarea,
probablemente usaríamos un imán para atraer la aguja (siempre y cuando esta
sea de metal y posea propiedades magnéticas). De manera análoga, hoy día
podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente, sondas y
anticuerpos, que actúan como imanes moleculares.

Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la

región de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna "marca" que permite
revelar su unión (hibridación) a la secuencia elegida y de esa manera revela presencia
de la región buscada.