BAB III

BAHAN DAN METODE

1. Penelitian I: Transformasi kedelai dengan gen gus melalui Agrobacterium

Benih kedelai hitam (Glycine max (L) Merrit) varietas Cikuray dan Malika
ditanam dalam ember plastik ukuran 5 kg yang berisi campuran tanah, kompos, dan
pupuk NPK secukupnya dan dipelihara di rumah kaca. Untuk penyediaan eksplan
yang cukup dan kontinyu dilakukan penanaman ditanam sebanyak 10 ember per
varietas. Setelah tnaman mulai berbunga, yaitu sekitar umur 35-40 hari setelah tanam
dilakukan penandaan bunga, yaitu dengan cara mengikatkan sehelai benang berwarna
pada tangkai bunga yang sedang mekar (anthesis). Polong kedelai dipanen pada saat
berumur 14-15 hari setelah penandaan. Polong muda selanjutnya dicuci dengan air
sabun dan dibilas air leding hingga bersih. Selanjutnya direndam dalam larutan
Clorox 20% selama 25-30 menit, lalu dibilas aquadest steril dan biji muda
dikeluarkan. Biji dibuka kulitnya dengan scalpel, lalu kotiledon dan embrio aksisnya
dipotong.

Eksplan kotiledon selanjutnya diinokulasi dengan Agrobacterium

menggunakan prosedur dari Hinchee, et al (1988). Strain Agrobacterium yang
digunakan adalah EHA 105 yang telah disispi plasmid pCambia 1301 yang
mengandung gen gus. Eksplan kotiledon dan embrio muda diperlakukan dengan 1:1
cairan bakteri dan medium LB. Untuk mencegah pengaruh merusak dari inokulum
bakteri, maka dilakukan pembiakan bakteri selama 24 jam, kemudian disentrifugasi
dan dimasukkan ke suspense campuran medium MS (Muriashige & Skoog 1962) +
100 mM sucrose + 200 (M actosyringone, pH 5,7. Sebagai perlakuan inokulasi
digunakan tiga konsentrasi bakteri yaitu 0,5; 1; 1,5 lama inokulasi dengan shaker 50
rpm selama 60 dan 90 menit, dan lama ko-kultivasi 3 dan 5 hari inkubasi. Jumlah
eksplan yang digunakan untuk setiap perlakuan sebanyak 6 eksplan.

Uji eksresi gen gus pada eksplan kotiledon dan embrio muda hasil inokulasi
Agrobacterium dilakukan setelah tiga dan lima hari inkubasi. Uji GUS mengikuti
prosedur Jeferson (1987). Eksplan yang telah ditransformasi diambil dari botol/petri
kultur, lalu diletakkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya eksplan diberi larutan
aseton secukupnya dan dibiarkan selama 1 jam (sesekali tabung digoyang-
goyangkan). Kemudian aseton dibuang dan diganti dengan larutan X-Gluc hingga
sampel terendam. Sampel disimpan dalam inkubator dengan suhu 37ºC selama
semalam. Sampel lalu diamati dengan mikroskop binokuler. Uji GUS positif jika
terjadi spot biru pada jaringan eksplan. Semakin tebal dan banyak warna birunya,
maka semakin tinggi ekspresi gen gus.

2. Penelitian II: Transformasi kedelai dengan gen proteinase inhibitor (pin)II

Penelitian ini bertujuan untu mentransfer gen pin II kentang ke dalam tanaman
kedelai melalui Agrobacterium. Eksplan kotiledon muda varietas Cikuray dan Malika
digunakan sebagai target transformasi.

Eksplan kotiledon muda kedelai cikuray dan Malika diinokulasi dengan A.

tumefacius menggunakan inokulasi terbaik hasil penelitian 1. Eksplain yang telah
diinokulasi dengan Agrobacterium dikeringkan pada cawan petri yang telah diberi
alas kertas saring steril, lalu eksplain dipindahkan ke medium ko-kultivasi. Kultur
selanjutnya diinkubasi (ko-kultivasi) di ruang kultur gelap selama 5 hari.

Eksplan kotiledon muda hasil ko-kultivasi selanjutnya dicuci dengan larutan

Cefotaxime 200 mg/l, lalu dikulturkan pada media seleksi I, ditambah kanamisin 200
mg/l (untuk seleksi gen npt II).

Planlet hasil transformasi Agrobacterium dikeluarkan dari botol/tabung dan

dicuci dengan air leding secara hati-hati untuk menghilangkan sisa agar-agar yang
menempel pada akar. Selanjutnya planlet dimasukkan ke dalam tabung lain yang
berisi air steril sekitar 8-10 ml. Tabung disimpan dalam dalam inkubator atau ruang
kultur terang selama 3-5 hari. Planlet yang tumbuh sehat/kuat segera dipindahkan ke
pot kecil yang berisi campuran tanah dan kompos (1:1) dan ditutup dengan kantung
plastik berlubang, lalu dibiarkan di ruangan yang teduh hingga beberapa hari. Setelah
tanaman mampu tumbuh dengan baik,tutup plastik dilepas dan tanaman dipindahkan
ke pot yang lebih besar untuk dipelihara di rumah kaca hingga deawasa.

3. Proses PCR dan Analisis Hasil PCR

Reaksi PCR dilakukan dalam total buffer PCR, yang terdiri atas 5 ng DNA
dari tanaman sampel dan kontrol: 100 nM masing-masing primer; 200 µM Dntp DAN
1,5 µl enzim Taq DNA polymerase, menggunakan mesin PCR (Programable Thermal
Controller) dalam 35 siklus yang terdiri 94ºC 1 menit, 55 ºC selama 2 menit dan 72
ºC selama 1 menit. Hasil amplifikasi PCR ini kemudian dipisahkan dengan 0,85 (w/v)
elektroforesis agorase gel dan pewarnaan dengan ethidium bromide. Parameter
pengamatan dilakukan berdasarkan ada tidaknya pita DNA untuk gen pinII pada
fotoge hasil elektroforesis.