GUIA # 4

PROTOCOLOS DE SIEMBRA

FUENTE: (OROZCO, 2012)

INDICADORES DE DESEMPEÑO

 Comprende los protocolos de siembra que se utilizan para el

análisis microbiológico de alimentos
 Realiza las diluciones de la muestra de alimento a analizar de
forma correcta
 Establece las diferencias metodológicas entre las siembras en
superficie y en profundidad
 Reconoce el fundamento para la deteccion de bacterias patógenas
en los alimentos

INDICADORES CLG TOMA DE DECISIONES

 Analiza las ventajas y desventajas de las alternativas posibles,
para elegir la más adecuada.
 Asume responsabilidad por las decisiones tomadas.
 Prevé consecuencias de sus actos a corto y largo plazo.
 Comunica sus decisiones en forma oportuna.
 Explora y busca de manera consiente las variables que debe
considerar antes de tomar una decisión o solucionar un problema.
 Considera posibilidades antes de elegir la más conveniente.
A VIVENCIAS
TRABAJO EN EQUIPO.

1. Formamos grupos de 3 personas y asignamos los roles de controlador

del tiempo, relator y líder de subgrupo.
2. Leemos comprensivamente el siguiente texto.

Siembra de microorganismos
Cada microorganismo posee características metabólicas que lo hacen
único, algunos resultan ser mas patogenos que otros, y otros tantos si
bien no causan enfermedades conocidas en el hombre no obstante
pueden alterar las características de un alimento y alterar su vida útil.
En muchas ocasiones solo nos interesara hacer un recuento del numero
de microorganismos que posee una muestra, en otros casos lo que nos
importara es verificar la presencia o ausencia del microorganismo ya que
su sola presencia implica un riesgo alto de producir una enfermedad en
quien consuma el alimento como en el caso de Salmonella spp y Listeria
monocytogenes, todos estos aspectos hacen que las técnicas
microbiológicas de siembra sean diferentes dependiendo del tipo de
microorganismo que se investiga, de esta forma en Colombia las Normas
Técnicas Colombinas establecen los protocolos de siembra que deben
utilizarse para la búsqueda y recuento de microorganismos y las pruebas
de confirmación que deben utilizarse cuando sea el caso.

3. Respondemos las siguientes preguntas y escribimos en el cuaderno

las respuestas para participar al final en plenaria general.

a) ¿Qué son diluciones de la muestra y como se realizan?

b) ¿Cuáles son los métodos de siembra que conocen?
c) ¿Describan la metodología que se utiliza para los métodos
de siembra mencionados anteriormente?
d) ¿Cuál es el objetivo de los métodos de siembra que han
descrito?
e) ¿Qué método de siembra utilizaría para hacer un recuento
de microorganismos?
f) ¿Una vez que los microorganismos crecen en los medios,
como se realizan los recuentos de colonias?
EN PLENARIA

4. Socializamos las respuestas dadas a los interrogantes anteriores

BC FUNDAMENTACIÓN CIENTIFICA Y
EJERCITACIÓN

TRABAJO EN EQUIPO
1. Leemos atentamente la lectura de fundamentación científica y
anotamos todas las ideas en el cuaderno a fin de utilizarlas como
fuente de informacion para dar respuesta a los interrogantes que se
plantean más adelante, posteriormente las socializaremos en plenaria.

PREPARACION DE LA MUESTRA Y METODOS DE SIEMBRA

Diluciones
Para realizar el análisis microbiológico de un alimento, se debe siempre
pesar 10g de la muestra, el pesaje debe realizarse tomando porciones de
diferentes lugares del alimento con una cuchara un tenedor o una
espátula esteril, en caso de que la muestra sea liquida, se toman 10ml de
la muestra con una pipeta previamente esterilizada.

La muestra se pesa en una bolsa esteril y posteriormente se agregan de

manera aséptica 90ml de agua peptonada al 0.1%, de esta manera se
tiene la dilución 10-1, posteriormente se homogeniza la muestra en un
agitador Stomaker (Figura 1), al final se vierte el contenido de la bolsa a
un frasco esteril. Para preparar la siguiente dilución, es decir 10-2, se
toma 1ml de la dilución 10-1 y se agregan a 9ml de agua peptonada, se
homogeniza y se procede a realizar la dilución 10 -3, la cual se hace a
partir de la dilución anterior, se toma entonces 1ml de la dilución 10 -2 y se
adiciona a 9ml de agua peptonada, se homogeniza para distribuir bien la
muestra en la solución. De esta manera se han preparado las tres
diluciones necesarias para la siembra de una muestra de alimentos,
finalmente se procede a montar las pruebas microbiológicas que
dependen exclusivamente del tipo de alimento a analizar, ya sea
aerobios mesófilos, mohos y levaduras, coliformes totales y fecales,
Stafilococcus coagulas positivo, esporas Clostridium sulfito reductor,
Bacillus cereus, Salmonella spp o Listeria monocytogenes, pero como ya
se menciono, las pruebas que se realizan dependerá del tipo de alimento
que se estudia.

Para el análisis de Aerobios Mesófilos, Mohos y Levaduras, Stafilococcus

coagulas positivo, esporas Clostridium sulfito reductor y Bacillus cereus,
las pruebas se hacen por duplicado para cada dilución, de esta manera
se siembran dos cajas de Petri con el medio de cultivo especifico según
sea el microorganismos a buscar en la dilución 10-1 , dos para la dilución
10-2 y dos para la dilución 10-3, tal como se ilustra en la figura 1.

Figura 1. Dilución de las muestras

FUENTE: AUTOR

Siembra de Mesófilos Aerobios.

La siembra se realiza por profundad, adicionando 1ml de la muestra de
cada dilución a una caja de Petri esteril y posteriormente vertiendo el
medio fundido a una temperatura tal que no mate los microorganismos
de la muestra, posteriormente se homogeniza la mezcla para que se
distribuya bien en el medio de cultivo. Debemos recordar que este
procedimiento se realiza haciendo la siembra de cada dilución por
duplicado para cada una de las tres diluciones, tal como se esquematiza
en la figura 1. Finalmente las placas se incuban a 35 oC por 48 horas
(ICONTEC, 2009: 42).

Los medios que se utilizan comúnmente para el recuento de mesófilos

Aerobios son el Plate Count y el Agar nutritivo

Siembra de Mohos y Levaduras

El procedimiento es el mismo que se utiliza para los Mesófilos Aerobios,
la siembra se realiza en profundidad adicionando 1ml de la muestra de
cada dilución, pero en este caso se utiliza Agar Papa Dextrosa (PDA) o el
agar OGYE, las placas se incuban a 22 oC por 3 a 5 días (ICONTEC,
2009: 52).

Siembra para la búsqueda de Staphylococcus coagulasa positivo

La siembra se realiza en superficie, inoculando 0.1mL de la muestra de
cada dilución por duplicado, el procedimiento se hace tal como se ilustra
en la figura 2 sobre agar Baird Parker ((ICONTEC, 2007: 7-9).

Figura 2. Protocolo de siembra para Staphylococcus coagulasa positiva

FUENTE: AUTOR
Siembra para la búsqueda de Bacillus cereus
La siembra se realiza por superficie en el Agar Mossel, se inocula por
duplicado 0.1mL de cada dilución (ICONTEC, 2006: 10-12), el protocolo
de siembra se esquematiza en la figura 3.

Figura 3. Protocolo de siembra e identificación de Bacillus cereus

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Coliformes totales y fecales

Número Más Probable

Existen diferentes métodos para detectar coliformes totales y fecales en
alimentos, uno de los más utilizados es el NMP (Numero Más Probable),
en esta técnica se siembra por triplicado 1mL de cada dilución en tubos
de ensayo que contienen 9mL de caldo LMX o caldo Lauril Sulfato, al
cabo de 18 o 24 horas se verifica visualmente la presencia de
características que indican el desarrollo de coliformes totales y fecales,
en cada caso y dependiendo del caldo de cultivo que se utilice, dichas
características van desde un cambio de color, producción de gas e
incluso fluorescencia del caldo de cultivo. La figura 4 describe el
protocolo de siembra para usar el método NMP (ICONTEC, 2009: 57-58).

Figura 4. Método NMP para coliformes totales y fecales

FUENTE: AUTOR
Recuento Estándar en Placa
Esta metodología permite hacer un recuento del número de células
viables que pueden dar origen a una colonia en el medio de cultivo, en
este caso se hace una siembra en profundidad utilizando Chromocult, un
medio de cultivo cromogénico que permite diferenciar los coliformes
fecales ya que dichas colonias toman una coloración azul, en tanto que
los coliformes no fecales toman una coloración roja, finalmente los
coliformes totales son el resultado de la suma de las colonias azules y
rojas (ICONTEC, 2007: 7-8).
El método NMP, al ser un método probabilístico puede arrojar resultados
que varían un poco con respecto al recuento en placa, en tanto que éste
último se considera más preciso por permitir el aislamiento y recuento
directo de los microorganismo presentes en la muestra, no obstante
ambas técnicas ofrecen resultados que permiten hacer un adecuado
análisis microbiológico del alimento estudiado.

Figura 5. Recuento en Placa de coliformes totales y fecales.

FUENTE: AUTOR

TRABAJO EN EQUIPOS
2. Según los conceptos vistos en la fundamentación científica, respondo
los siguientes interrogantes que socializaremos en plenaria, debemos
recordar asignar los roles de controlador del tiempo, relator y líder de
subgrupo.
3. Las respuestas a estas preguntas implican analizar las ventajas y
desventajas de las alternativas posibles, para elegir la más adecuada , de esta
manera fortalecemos nuestra competencia de toma de decisiones.

a. ¿Cómo se realizan las diluciones de la muestra para análisis

microbiológico?
b. ¿Cómo se realiza la siembra en superficie, describa la
metodología en sus propias palabras?
c. ¿Cómo se realiza la siembra en profundidad?
d. ¿Qué diferencias, ventajas y desventajas hay entre el método
NMP y la siembra para recuento en placa de coliformes fecales
y totales?
e. ¿Entre el método NMP y recuento en placa de coliformes
fecales y totales, cual elegiría y por qué?

4. Participamos en plenaria socializando las respuestas con mediación

del profesor.

TRABAJO EN EQUIPO

5. Seguimos con la lectura de fundamentación científica.

Recuento de Esporas Clostridium Sulfito Reductor

El género Clostridium, corresponde a bacilos grampositivos anaerobios
esporulados, por lo tanto para hacer el aislamiento y recuento de esporas
Clostridium Sulfito Reductor, se requiere inducir la esporulación del
microorganismo, esto se logra realizando un Shock térmico sobre la
muestra del alimento de esta forma el microorganismo se ve obligado a
formar esporas que le proporcionen la capacidad de resistir tales
condiciones adversas, posteriormente se adiciona el medio de cultivo
sobre la muestra y se crea un tapón anaerobio que permita el desarrollo
sin inconvenientes para el microorganismo. En la figura 6 se describe la
metodología empleada para realizar la siembra de Esporas Clostridium
Sulfito Reductor, se debe además realizar siembras por duplicado para
las diluciones 10-1 y 10-2 y si es necesario en otras diluciones (ICONTEC,
2000: 9-10).
Figura 6. Protocolo de siembra para Esporas Clostridium Sulfito Reductor

FUENTE: AUTOR

Búsqueda de Listeria monocytogenes

Dado que este microorganismo es un patógeno de humanos, se requiere
utilizar una mayor cantidad de muestra de alimento con el fin de disminuir
la posibilidad de reportar falsos negativos, la muestra debe además
inicialmente inocularse en un caldo de enriquecimiento selectivo, que
inhiba la flora acompañante y facilite el desarrollo de Listeria
monocytogenes, posteriormente se realiza una siembra en medios
sólidos específicos como el agar Palcam y finalmente se hacen pruebas
confirmatorias para certificar la Presencia de Listeria monocytogenes en
el alimento (ICONTEC, 1999: 2-4, 6-8). La figura 7 muestra el protocolo
para la búsqueda del microorganismo en alimentos.

Figura 7. Protocolo de búsqueda de Listeria monocytogenes en alimentos

FUENTE: AUTOR

Búsqueda de Salmonella
Al igual que Listeria monocytogenes, Salmonella es un patógeno de
humanos, por lo cual debe pasar por un enriquecimiento no selectivo y
un enriquecimiento selectivo, seguido de la siembra en medios sólidos
específicos como el Agar XLD y Sulfito bismuto, finalmente se realizan
pruebas confirmatorias para certificar la presencia del microorganismo en
el alimento (ICONTEC, 2007: 2-3, 7-8). Pueden usarse también Agares
con una mayor sensibilidad para la deteccion de Salmonella spp como
Agar Rambach y Chromagar Salmonella Plus. La figura 8 y 9
esquematiza el método de búsqueda de la bacteria.

Figura 8. Protocolo Tradicional para la búsqueda de Salmonella.

FUENTE: AUTOR
Figura 9. Método rápido para la deteccion de Salmonella

FUENTE: AUTOR

Recuento de colonias

El recuento de colonias para mesófilos aerobios se realiza con aquellas

cajas que poseen entre 10 y 300 colonias, en tanto que para colonias
típicas deben ser entre 10 y 150 colonias (ICONTEC, 2009: 46) (como en
el caso de Bacillus cereus y Staphylococcus coagulasa positiva), y
posteriormente se aplica la siguiente formula general:

N= __________Ʃc__________
 V (n1+0,1n2) d1

Donde N: es el recuento final de colonias en ufc/g o ml

Ʃc es la suma de las colonias retenidas en las cajas de la primer y
segunda dilución retenidas.
V: es el volumen inoculado en las cajas
n1: numero de cajas en la primera dilución retenida
n2: numero de cajas retenidas en la siguiente dilución
d1: primera dilución tomada

Ejemplo: se realizo una siembra en profundidad para hacer el recuento

de mesófilos aerobios y se obtuvo los siguientes resultados.

Dilución 10-1:
Primer caja: 1400
Segunda caja: 1600 colonias

Dilución 10-2:
Primer caja: 270 colonias
Segunda caja: 255 colonias

Dilución 10-3:
Primer caja: 20 colonias
Segunda caja: 25 colonias

Dado que las diluciones 10-2 y 10-3 cumplen al tener cada caja entre 10 y
300 colonias se eligen estas para el cálculo, de esta manera al aplicar la
formula se obtiene:

N=______270+255+20+25___=_570_=25909,09 ufc/ml
1(2+0,1x2)0,01 0,022

Los datos se aproximaran siempre al entero más próximo y se

expresaran en notación científica con dos cifras significativas, de esta
manera el resultado se expresa así:

N=26 x103 ufc/g o ml

TRABAJO EN EQUIPOS
5. Respondemos los siguientes cuestionamientos a partir de la
fundamentación científica.
 a) ¿Qué característica posee el género Clostridium que lo
diferencia de las demás bacterias que hemos estudiado en
esta guía?
b) ¿Qué características diferenciadoras observa entre las
metodologías utilizadas para la deteccion de Salmonella y
Listeria monocytogenes y el resto de los protocolos de
siembra de los microorganismos estudiados en esta guía?

TRABAJO INDIVIDUAL
6. Resuelva el siguiente ejercicio

Se realizo una siembra en profundidad de una muestra de carne

cocinada para hacer el recuento de mesófilos aerobios, al final de la
prueba se obtuvieron los siguientes resultados. Este ejercicio nos
permitirá considerar posibilidades antes de elegir la más conveniente, de
esta manera fortalecemos nuestra competencia de toma de decisiones

Dilución 10-1:
Primer caja: 14
Segunda caja: 18 colonias

Dilución 10-2:
Primer caja: 170 colonias
Segunda caja: 188 colonias

Dilución 10-3:
Primera caja: 175 colonias
Segunda caja: 170 colonias

Reporte el número de ufc/g, para lo cual siga el orden indicado

1. Elija las diluciones que va a retener y explique su decisión

2. Ingrese los datos en la formula, teniendo en cuenta el numero de
cajas en la primer y segunda dilución retenidas (n 1 y n2) y el valor
correspondiente a la primera dilución retenida (d1).

N= __________Ʃc__________
V (n1+0,1n2) d1

3. Que sugerencia hace al análisis microbiológico realizado.

D APLICACIÓN
A LA BUSQUEDA DE MICROORGANISMOS EN LOS
ALIMENTOS.
Realizaremos un análisis microbiológico a un alimento que bien puede
ser algún producto que hayamos considerado de nuestros proyectos
productivos o en cuyo defecto analizaremos un postre de leche.

TRABAJO EN PARES
Con un compañero me dispongo para realizar el estudio del alimento que
hemos elegido, debo recordar que para esta actividad requiero, bata de
laboratorio, guantes, gorro y tapabocas, además de considerar todas las
normas de bioseguridad necesarias para la práctica de la microbiología.

Seguiremos el siguiente orden para nuestra actividad.

1. Preparación de las diluciones de la muestra.

2. Siembra por duplicado en profundidad para mesófilos aerobios

3. Siembra por duplicado en profundidad para mohos y levaduras

4. NMP de coliformes totales y fecales

Para esta práctica tendremos en cuenta los protocolos descritos en la

guía que nos orientaran en el desarrollo de nuestros análisis
microbiológicos.

Presentaremos además un informe al profesor que contenga

introducción, metodología empleada en cada prueba y resultados,
además consignaremos en nuestro informe las respuestas a las
siguientes preguntas:

a) ¿Según los datos obtenidos el alimento es o no apto para consumo

humano? De esta manera afianzamos nuestra competencia de
toma de decisiones al buscar de manera consiente los factores que
deben considerarse antes de solucionar este problema.

b) ¿Qué errores cometidos durante la práctica pudieron afectar los

resultados obtenidos?
 c) ¿Qué conclusiones obtiene de esta práctica?

Valores de referencia:
Utilizaremos los valores de referencia establecidos para la leche en
polvo.
 Mesófilos aerobios : < 30.000ufc/ml o g
 Mohos y levaduras. < 1000 ufc/ml o g
 NMP coliformes totales: 11 microorganismos/ml o g
 NMP coliformes fecales: 0 microorganismos/ml o g
E COMPLEMENTACIÓN
CLUB DE REVISTA
TRABAJO INDIVIDUAL
Los clubes de revista son una estrategia formativa que permiten
profundizar en un tema científico. Nuestro objetivo es abordar una
temática y analizarla a la luz de los conceptos y conocimientos
científicos, dicho objetivo se logra mediante una serie de preguntas que
son hechas por el docente encaminadas al análisis del tema en cuestión

Realizaremos un club de revista sobre las implicaciones que tienen los

biofilms en la seguridad alimentaria, para esto leeremos el tema que
encontraremos en las páginas web que se especifican renglones más
abajo y a la siguiente clase realizaremos el club de revista en donde
basados en la informacion que hemos leído construiremos las respuestas
a las preguntas y problemas que plantee el docente.

TÉLLEZ, Sonia. (2010). Los Biofilms y su repercusión en la Industria

Alimentaria. Disponible en:
http://www.vigilanciasanitaria.es/es/articulos/biofilms-
repercusion-industria-alimentaria.php
[Consultado el 19 de julio de 2013]

CHAVARRÍA, Marta. (2009). Los BIOFILMS EN SEGURIDAD

ALIMENTARIA. Disponible en:
http://www.adiveter.com/ftp/articles/A1130309.pdf
[Consultado el 19 de julio de 2013]
GLOSARIO

Biofilms: son biopelículas microbianas, comunidades complejas de

microorganismos que se agrupan y forman finas capas sobre diversos
tipos de superficies para obtener beneficios como resistencia a
desinfectantes, pH y stress nutricional.

NMP: Numero Más Probable, método estadístico para detectar la

cantidad de microorganismos coliformes totales y fecales en un mililitro o
gramo de muestra

Protocolo: Conjunto de instrucciones para la realización de una técnica

Shock térmico: Técnica empleada para inducir la esporulación de

microorganismos capaces de hacerlo, consiste en elevar la temperatura
entre 65 o 75oC por cinco minutos y provocar luego un descenso de la
misma de manera abrupta hasta 4-8oC.

Stomaker: es un equipo que se utiliza para homogenizar la muestra de

alimentos y realizar las diluciones para su posterior siembra en los
medios de cultivo

U.F.C: Unidades formadoras de colonias. Cada una de las células

capaces de dar origen a una colonia dentro de un medio de cultivo.
BIBLIOGRAFÍA
ICONTEC. (1999). Norma Técnica Colombiana 4666. Microbiología de
alimentos y productos para alimentación animal. Método horizontal para
la deteccion de Listeria monocytogenes. Parte 1. Método de deteccion

ICONTEC. (2000). Norma Técnica Colombiana 4834. Microbiología de

alimentos y productos para alimentación animal. Método horizontal para
el recuento de Clostridium sulfito reductor e identificación de Clostridium
perfringens. Técnica de recuento de colonias utilizando medios
fluorogénicos o cromogénicos

ICONTEC. (2006). Norma Técnica Colombiana 4679. Método horizontal

para el recuento de Bacillus cereus. Técnica de recuento de colonias

ICONTEC. (2007). Norma Técnica Colombiana 4779. Microbiología de

alimentos y productos para alimentación animal. Método horizontal para
el recuento de Estafilococos coagulasa positiva (Staphylococcus aureus
y otras especies)

ICONTEC. (2007). Norma Técnica Colombiana 4458. Microbiología de

alimentos y productos para alimentación animal. Método horizontal para
el recuento de coliformes o Escherichia coli o ambos. Técnica de
recuento de colonias utilizando medios fluorogénicos o cromogénicos

ICONTEC. (2007). Norma Técnica Colombiana 4574. Microbiología de

alimentos y productos para alimentación animal. Método horizontal para
la deteccion de Salmonella spp

ICONTEC. (2009). Norma Técnica Colombiana 4092. Microbiología de

alimentos y productos para alimentación animal. Requisitos generales y
directrices para análisis microbiológicos.

OROZCO, Víctor. (2012). La evolución del diagnostico microbiológico en

la industria. Disponible en:
http://www.revistaialimentos.com.co/ediciones/ediciones-2012/edicion-
31/inocuidad-2.htm
[Consultado el 23 de julio de 2013]