Micropropagaci�n

es el conjunto de t�cnicas y m�todos de cultivo de tejidos utilizados para

multiplicar plantas asexualmente de forma r�pida, eficiente y en grandes
cantidades.1? La micropropagaci�n se utiliza para multiplicar o propagar plantas
nuevas, tales como aquellas creadas por ingenier�a gen�tica, mutag�nesis o mejora
gen�tica. Se utiliza tambi�n la micropropagacion para obtener plantas libres de
enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se
propagan eficientemente.
Generalidades sobre los m�todos
En la micropropagaci�n, a partir de un fragmento (explanto) de una planta
seleccionada (llamada planta madre), se obtiene una descendencia uniforme, con
plantas gen�ticamente id�nticas, denominadas clones. El explanto m�s usado para los
procesos de propagaci�n in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los
frascos que contienen las plantas se ubican en estanter�as con luz artificial
dentro de la c�mara de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que
oscilan entre los 21 y 23 �C, adem�s de controlar la cantidad de horas de luz. Por
su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales,
vitaminas y reguladores de crecimiento, az�car, agua y agar. La composici�n del
medio depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagaci�n.

Fases del proceso de micropropagaci�n

Dentro del proceso de micropropagaci�n se pueden diferenciar varias fases o etapas:

1: Desinfecci�n de las yemas de la planta y/o desinfecci�n de semillas

2: Introducci�n del material seleccionado in vitro
3: Multiplicaci�n de brotes
4: Enraizamiento
5: Aclimataci�n
Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicaci�n de plantas
in vitro y puede ser aplicada a diferentes especies vegetales.

Preparaci�n de la planta madre

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener
explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener
estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta
donante de yemas, durante un per�odo que puede oscilar entre unas semanas o varios
meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la
planta en condiciones sanitarias �ptimas y con un control de la nutrici�n y riego
adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.2?

Desinfecci�n del material vegetal

Una vez elegida la planta madre, se extraer�n los fragmentos a partir de los cuales
se obtendr�n los explantos. Los explantos pueden ser yemas, trozos de hojas,
porciones de ra�ces o semillas. Antes de extraer los explantos se har� una
desinfecci�n de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes
externos. Los contaminantes m�s comunes son los hongos y las bacterias que habitan
en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe
mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener tales condiciones, se
trabaja en cabinas de flujo laminar para extraer los explantos a partir del
material vegetal. Estos explantes se introducir�n en un tubo de cultivo conteniendo
medio de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar
la desinfecci�n del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial),
pura o diluida durante un per�odo de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en
agua esterilizada.

Introducci�n del material in vitro

Luego de la desinfecci�n superficial, las semillas o las yemas dependiendo del
material seleccionado, se ponen en medio de cultivo est�ril. En un per�odo de una
semana o quince d�as, comienza el proceso de germinaci�n o regeneraci�n de nuevos
tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Multiplicaci�n de los brotes

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases
anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas.
En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollar� luego de ser puesta en
contacto con el medio de cultivo. Peri�dicamente estos nuevos brotes se deben
subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo
u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la bolsa de flujo
laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia.
De esta forma aumenta el n�mero de plantas en cada repique o divisi�n de las
plantas. El n�mero de plantas que se obtiene depender� de la especie vegetal y de
las condiciones del medio de cultivo. El n�mero de plantas que se obtiene por la
v�a de la micropropagaci�n permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando
que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

Elecci�n de un medio de enraizamiento de los explantos

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un
tama�o aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicaci�n
se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga
hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar
por esta etapa y emiten sus ra�ces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan
yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicaci�n y enraizamiento transcurren
en forma simult�nea.
Aclimataci�n de los explantos enraizados
Los explantos reci�n enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el �xito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimataci�n. En
esta etapa las plantas sufrir�n cambios de diferente tipo que permitir�n la
adaptaci�n de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se
extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, est�n poco adaptados a
crecer en un invern�culo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en
ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas
(estructuras responsables de regular la transpiraci�n y p�rdida de agua en la
planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad
relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecaci�n del explante.
Por otra parte, crecer en ambientes tan h�medos tambi�n suele implicar la falta de
una cut�cula con cera bien desarrollada, que representa la barrera f�sica para
evitar la p�rdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los
plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del
invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando
progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantar�n en contenedores
(almacigueras) cubiertos por un pl�stico, para mantener la humedad relativa
elevada. La elecci�n de un sustrato con buenas caracter�sticas f�sicas, es clave
para el �xito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto,
poroso, con mezcla de arena turba, c�scara de arroz quemado , para permitir un
desarrollo y crecimiento de ra�ces muy r�pido. Las mezclas son diferentes y muy
variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar
cuidadosamente el agar de las ra�ces para evitar da�arlas, los plantines se
enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y
cubiertos con nylon. Todos los d�as se debe controlar el nivel de humedad en las
almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual,
para mantener un ambiente h�medo a nivel del sustrato. A los 15 d�as del
trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de
menor calor( temprano en la ma�ana o en la �ltima hora de la tarde). Al comienzo
las plantas se dejan media hora por d�a destapadas. A la semana siguiente se dejan
destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la
noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer
destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos
aspectos anat�micos y fisiol�gicos de las plantas, por esta causa, durante la
aclimataci�n, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estr�s y tener
mayor tasa de sobrevivencia.