LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

UJI FISIOLOGIS MIKROBA

Pelaksanaan Praktikum : 24 November 2010

Dosen Pembimbing :
1. Dr. Ni’matuzahroh
2. Fatimah, S.Si, M.Kes
3. Nita Citrasari, S.Si., M. T.

Oleh :
1. Ati Maulin (080911001)
2. Febri Eko W. (080911010)
3. Zefanya Hesa S. L. (080911024)
4. Nuril Ayu A. (080911039)
5. Nazar Fahmi A.S. (080911048)

DEPARTEMEN BIOLOGI
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI LINGKUNGAN
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2010
 BAB I

1.1 TUJUAN
Mengamati secara langsung maupun tidak langsung produk kegiatan
enzimatik bakteri.

BAB II

2.1 DASAR TEORI

Mikroorganisme yang berbentuk bakteri mampu berada di berbagai tempat
baik melalui udara, bercampur dalam padatan dan berpindah tempat mengikuti
aliran air atau melekat pada benda-benda yang cocok untuk tumbuh dan
berkembang. Bakteri tumbuh dan berkembang pada lingkungan karena adanya
nutrien yang tersedia, suhu yang sesuai, keasaman atau kebasaan (pH) tempat
tumbuh, kandungan udara dan kelembaban udara.
Mikroorganisme menempel pada suatu permukaan melalui beberapa tahap,
yaitu melekat pada permukaan lalu membentuk koloni kemudian tumbuh
membentuk koloni yang lebih besar. Jenis mikroorganisme selain bakteri juga
terdapat jamur/kapang dan khamir, yang tersebar di lingkungan. Untuk
mengetahui spesies suatu biakan mikroorganisme, perlu dilakukan identifikasi.
Tahap pertama melakukan identifikasi adalah pengenalan ciri-ciri morfologi
mikroorganisme tersebut. Pengamatan morfologi dilakukan secara makrokosmis
maupun mikrokosmis.
Mikroba di lingkungan pada umumnya berada dalam populasi campuran
yang sulit ditemukan , dimana mikroba dijumpai sebagai spesies tunggal. Untuk
itu dibutuhkan metode isolasi agar dapat mencirikan dan mengidentifikasi suatu
mikroorganisme tertentu. Pertama kali harus dapat dipisahkan dari
mikroorganisme lainnya yang dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan
menjadi biakan murni. Terdapat dua metode untuk memperoleh biakan murni
yaitu teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua teknik ini berdasarkan pada
pengenceran organisme sehingga dapat dipisahkan hanya spesies tertentu berada
sebagai sel tunggal. Dengan demikian dapat diperoleh ciri-ciri kultural,
morfologis, fisiologis, maupun serologis.
Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak
serupa. Karena itu, ciri fisiologis atau biokimia merupakan kriteria yang sangat
penting dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan
fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan
spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Sehingga mengenal beberapa macam uji
fisiologis sehingga dapat dipergunakan untuk mengidentifikasi organisme tak
dikenal dalam kegiatan berikutnya.
Enam dari 13 uji yang akan dilakukan merupakan reaksi biooksidasi, yaitu
reaksi-reaksi enzimatik yang berkaitan dengan respirasi dan fermentasi. Keenam
uji tersebut adalah fermentasi gula dalam tabung Durham, fermentasi asam
campuran (uji metal merah), fermentasi butanadiol (uji voges proskauer),
produksi katalase, reduksi nitrat, dan uji oksidase. Tiga uji berikutnya yaitu
hidrolisis triptofan (uji indol), hidrolisis urea, dan hidrolisis pati, merupakan
reaksi hidrolisis yang disebabkan oleh enzim-enzim ekstraseluler. Sedangkan uji-
uji lainnya merupakan uji yang secara rutin juga seringkali diperlukan untuk
membantu usaha identifikasi.
Pada uji fermentasi asam campuran (uji metal merah), jika berwarna merah
menghasilkan positif (+) dan biasanya terjadi pada E.coli. Sedangkan jika
berwarna kuning atau orange menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada
E. aerogenes. Uji fermentasi ini menggunakan media dan reagen MR/VP broth
dan memproduksi asam laktat, asam asetat dan asam formiat (formic acid).
Pada uji fermentasi butanadiol (uji Voges-Proskauer), jika berwarna merah
menghasilkan positif (+) dan biasanya terjadi pada Klebsiella, Enterobacter,
Hafnia, Serratia. Sedangkan jika berwarna kuning menghasilkan negatif (-) dan
biasanya terjadi pada E. coli. Uji fermentasi ini menggunakan media dan reagen
MR/VP broth, α-naftol 5%, etil alkohol absolute serta KOH 40% dan
memproduksi asetoin (asetil-metil-karboniol).
Pada uji hidrolisis triptofan (uji indol), jika terbentuk cincin merah
menghasilkan positif (+) dan biasanya terjadi pada E.coli. Sedangkan jika tidak
ada cincin merah menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada K.
pneumoniae. Uji fermentasi ini mempunyai enzim triptofanase (untuk hidrolisis
dan deaminasi triptofan) serta menggunakan media dan reagen Tryptophan broth,
reagen Kovac, dan reagen Ehrlich. Uji ini memproduksi indol, asam piruvat dan
amonia.
Pada uji penggunaan sitrat, jika berwarna biru menghasilkan positif (+) dan
biasanya terjadi pada E.aerogenes. Sedangkan jika berwarna hijau menghasilkan
negatif (-) dan biasanya terjadi pada E. coli. Biasanya pada uji ini mampu
memakai natrium sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan garam
ammonium anorganis sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Uji ini menggunakan
media dan reagen Medium Sitrat Simmons. Uji ini memproduksi indol, asam
piruvat dan amonia.
Pada uji hidrolisis hidrolisis urea, jika berwarna merah menghasilkan positif
(+) dan biasanya terjadi pada Proteus. Sedangkan jika berwarna kuning
menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada E. coli. Uji fermentasi ini
mempunyai enzim urease serta menggunakan media dan reagen Stuart’s urea
broth dan Christensen’s urea agar. Uji ini memproduksi indol, asam piruvat dan
amonia.
Pada uji fermentasi karbohidrat, jika berwarna kuning menghasilkan positif
(+), hal ini karena memfermentasi karbohidrat yang diuji. Sedangkan jika
berwarna merah menghasilkan negatif (-) dan hal ini tidak memfermentasi
karbohidrat yang diuji. Uji fermentasi ini menggunakan media dan reagen
Buffered Carbohydrate Broth media dan indikator phenol red. Memiliki
mekanisme dari fermentasi karbohidrat memproduksi asam dan terjadi
perubahan indikator phenol red dari merah menjadi kuning.
Pada uji reduksi nitrat, jika berwarna merah dalam waktu ≤ 30 detik
menghasilkan positif (+) karena mereduksi nitrat menjadi nitrit, biasanya terjadi
pada E.coli. Sedangkan jika berwarna warna selain merah (misalnya kuning)
menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada Acinetobacter baumannii. Uji
ini menggunakan media dan reagen nitrate broth atau nitrate agar (slant), reagen
A, dan reagen B. Uji ini memproduksi indol, asam piruvat dan amonia.
 BAB III

3.1 ALAT DAN BAHAN

Alat :
1. Alkohol
2. Kertas plumbun asetat
3. Jarum oseloop dan tusuk
4. Bunsen
5. Korek api
6. Tabung Durham

Bahan :
1. Media Simon Sitrat
2. Media Laktosa Broth dengan tabung durham
3. Kertas Bactident oksidase kit
4. Media TSIA
5. Media SIM
6. Cawan agar petri
7. Air akuades
8. Bakteri Bacillus subtilis

3.2 PROSEDUR KERJA

1) Pada semua tabung dan cawan yang akan diinokulasi, dibubuhkan dengan
nama praktikan, nomor kegiatan, tanggal, serta nama organisme yang
digunakan sebagai inokulum.
2) Mengambil Bacillus subtilis dengan menggunakan jarum inokulasi kemudian
mencampurkannya dengan air akuades sambil diaduk.
3) Menginokulasikan bakteri Bacillus subtilis yang sudah dicampurkan dengan air
akuades pada media yang telah disiapkan seperti media TSIA, media SIM,
cawan agar petri, media sitrat agar, dan biakan kaldu glukosa dalam tabung
Durham dan pada kertas Bactident oksidase kit.
4) Pada media TSIA dengan cara jarum oseloop dimasukkan ke dalam campuran
bakteri dan air akuades kemudian melakukan inokulasi streak (gores) di atas
permukaan media.
5) Pada media sitrat agar dengan cara jarum tusuk dimasukkan ke dalam
campuran bakteri dan air akuades kemudian ditusuk sekali secara tegak lurus
ke dalam sitrat agar, setelah itu melakukan inokulasi streak (gores) di atas
permukaan media (jarum oseloop sudah dimasukkan ke dalam campuran
bakteri dan air akuades).
6) Pada media SIM dengan cara jarum tusuk dimasukkan ke dalam campuran
bakteri dan air akuades kemudian ditusuk sekali secara tegak lurus ke dalam
media.
7) Pada cawan agar petri dengan cara menentukan tiga titik tertentu untuk
meletekkan bakteri
8) Pada biakan kaldu glukosa dalam tabung Durham dengan cara jarum oseloop
dimasukkan ke dalam campuran bakteri dan air akuades kemudian diaduk
hingga rata dalam biakan tersebut.
9) Setelah itu mengisolasi dan menginkubasi media-media tersebut selama ± 24
jam dan mengamati apa yang telah terjadi.
 BAB IV

4.1 DATA HASIL PENGAMATAN

Uji Fisiologis Menurut Jenis Media

Mikroba yang diuji

SIM Simmon’s Lactose
TSIA Pati Oksidase
agar Citrate Agar Broth
Candida albicans
- + - + - -

Saccharomyces
+ - - - - -
cereviceae
Pseudomonas putida - - - + + -
Bacillus subtilis - + - + - -
Acinetobacter + - - + + -
Sthapylococcus
+ - - - - -
aureus
E.coli + + + + + +

4.2 PEMBAHASAN

1. Fermentasi Campuran Gula

Uji ini menggunakan media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) zat yang
diujikan yaitu sukrosa, dekstrosa dan laktosa. Uji positif pada uji ini ditandai
dengan perubahan warna yang terjadi menjadi berwarna kuning karena fermentasi
sukrosa, dekstrosa dan laktosa menurunkan pH sehingga media menjadi berwarna
kuning.
Pada hasil TSIA yang menunjukkan hasil positif yaitu pada
Saccharomyces cereviceae, Acinetobacter, Sthapylococcus aureus, dan E.coli.
Mikroba inilah yang dapat memfermentasikan sukrosa, dekstrosa dan laktosa.
Mikroba tersebut memfermentasikan gula yang ada sehingga menyebabkan
penurunan pada pH media yang ditandai dengan perubahan warna menjadi
kuning.
 Pada hasil TSIA yang menunjukkan hasil negatif yaitu pada Candida
albicans, Pseudomonas putida, dan Bacillus subtilis . Mikroba – mikroba ini
tidak dapat memfermentasi media TSIA.

2. Uji Motilitas
Uji motilitas ini digunakan untuk megetahui apakah mikroba tersebut
dapat bergerak atau tidak. Dalam uji ini digunakan media SIM (Sulfite Indole
Motility). Bergeraknya mikroba dikarenakan adanya flagella yang dapat
digunakan untuk bergerak. Pergerakan mikroba dapat diamati pada hasil tusukan
yang ada pada tabung berisi media SIM. Jika tusukan lebih keruh dan terdapat
garis – garis seperti akar dapat diduga bahwa mikroba tersebut motil/ dapat
bergerak.
Selain itu terjadinya perubahan warna hitam juga menjadi indicator bahwa
mikroba yang ada pada media bersifat motil. Warna hitam tersebut menunjukkan
bahwa mikroba menghasilkan hidogen sulfida (H2S) hasil hidrolisis asam amino
yang mengandung unsure S.
Hasil pengamatan dari media SIM yang ada uji positif didapatkan pada
tabung yang berisi mikroba : Candida albicans, Bacillus subtilis, dan E.coli. Pada
tabung yang berisi Candida albicans terdapat garis yang melebar dari tempat
penusukan, pada Bacillus subtilis terjadi kekeruhan disekitar tempat penusukan
dan pada E.coli terjadi perubahan warna media menjadi hitam.

Candida albicans Bacillus subtilis E.coli

 Sedangkan pada mikroba yang lain tidak terjadi perubahan pada media
SIM sehingga dapat diduga bahwa tidak adanya aktifitas motil dai mikroba.

3. Uji Penggunaan Sitrat

Uji penggunaan sitrat merupakan satu pengujian kelompok tes IMViC.
Pengujian ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
menggunakan sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon dan energi. Sitrat
merupakam molekul organik yang dapat digunakan mikroba yang memproduksi
enzim sitrase.
Media yang digunakan yaitu Simmons sitrat agar yang mengandung sitrat
sebagai sumber karbon satu – satunya dan indicator pH bromtimol biru yang
menunjukkan warna hijau pada pH 6,9 dan warna biru pada pH 7,6. Mekanisme
yang terjadi seperti berikut :

Citrat permease
Natrium sitrat Asam piruvat + Asam oksaloasetat + CO2
Citratase

Na+ + CO2 + H2O Na2CO3

Karena Na2CO3 bersifat alkali maka dapat meningkatkan pH sehingga

menunjukkan warna biru pada media.
Hasil pengamatan mennunjukkan hanya pada E.coli yang menunjukkan
adanya uji positif berwarna biru.

E.coli
 Hal tersebut sangat bertentangan dengan literatur yang ada, seharusnya
E.coli tidak dapat menghasilkan enzim sitrase yang dapat memanfaatkan sumber
carbon dari sitrat. Perbedaan ini diduga adanya mikroba penghasil enzim sittase
seperti (Enterobacter aerogenes) yang tercampur pada saat melakukan percobaan
uji sitrat, kondisi tidak steril dapat menyebabkan peubahan warna pada media
sitrat.
Sedangkan pada pengujian mikroba yang lainnya hasil uji sitrat negative.
Media sitrat tidak menunjukkan perubahan warna apapun tetap berwarna hijau.
Dibawah ini hasil uji mikroba yang lainnya.

Sthapylococcus aureus Bacillus subtilis Candida albicans Acinetobacter

Pseudomonas putida
4. Uji Hidrolisis Pati
Uji hidrolisis pati bertujuan untuk mengetahui kemampuan mikroba
menghidrolisis pati. Uji positif yang bisa dilihat yaitu berubahnya warna menjadi
bening disekitar koloni mikroba yang ditumbuhkan. Dengan warna bening
tersebut menunjukan bahwa pati telah terhidrolisis menjadi sakarida yang lebih
sederhana seperti maltose dan glukosa sehingga larutan iodium tidak berwarna.
Reaksi yang terjadi yaitu:

Pati glukosa + maltosa

Larutan iod tidak berwarna

Sedangkan uji negatif ditandai dengan terbentuknya warna hitam atau kebiru-
biruan disekitar daerah pertumbuhan bakteri setelah penambahan larutan iod, yang
menunjukkan keberadaan amilum/pati yang belum terhidrolisis.
Hasil pengamatan yang menunjukkan hasil positif hasil uji hidrolisis pati
yaitu pada Candida albicans, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis,
Acinetobacter, dan E.coli. Mikroba – mikroba tersebut menunjukkan hasil positif
yaitu warna bening pada daerah sekitar tumbuhnya koloni yang berarti bahwa
mikroba tersebut mampu menghidrolisis pati menjadi sakarida yang lebih
sederhana karena dapat menghasilkan enzim amilase.
Hail pada E.coli terdapat perbedaaan dengan literature. Seharusnya E.coli
tidak dapat menghidrolisis pati karena E.coli tidak dapat menghasilkan enzim
amilase. Hal tersebut dapat diduga karena kurang sterilnya pada saat
menginokulasikan biakan mikroba ke cawan petri sehingga ikut adanya mikroba
lain yang dapat menghidrolisis pati.

5. Uji Oksidase
Uji oksidase digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya enzim
sitokrom oksidase. Dengan menggunakan kertas bactident oksidase kit pengujian
oksidase dapat dilakukan dengan mengambil mikroba yang akan di uji dan
meletakkan pada kertas bactident kit. Uji positif ditandai dengan adanya
perubahan warna menjadi warna ungu gelap, sedangkan uji negative tidak akan
menampakkan warna apapun/ tidak ada perubahan warna pada kertas.
 Hasil positif ditunjukkan oleh biakan mikroba Pseudomonas putida,
Acinetobacter, dan E.coli. Pada uji oksidase ini terjadi perbedaan pada E.coli,
seharusnya E.coli tidak memberikan uji positif pada kertas uji karena E.coli tidak
mempunyai enzim sitokrom oksidase. Kemungkinan yang bisa diduga yaitu
biakan E.coli bukan merupakan kultur murni dari E.coli sehingga memberikan uji
positif pada kertas uji.

Uji positif ditunjukan kertas bagian atas yang berwarna ungu sedangkan uji
negative ditunjukkan pada kertas bagian bawah.
Reaksi yang terjadi pada uji oksidasi positif yaitu:
Cytochrome oksidase

Cytochrome c (reduced) + O2 Cytochrome c (oxidized) + H2O

Cytochrome c (oxidized) + oxidase reagent (reduced) Cytochrome c (reduced) + oxidase
reagent (oxidized) [ungu]

6. Uji Fermentasi Laktosa

Uji fermentasi laktosa digunakan untuk mengetahui mikroba yang dapat
memfermentasikan laktosa sehingga dapat membedakan antara mikroba yang
dapat memfermentasi laktosa dan tidak. Media yang digunakan dalam uji ini yaitu
laktosa broth yang berwarna kuning dengan tabung durham didalam media.
Tabung durham digunakan untuk mengetahui adanya gas hasil fermentasi dari
laktosa.
Uji fermentsi laktosa mendapatkan hasil uji positif hanya pada E.coli yang
ditandai dengan adanya gelembung udara pada tabung durham sedangkan pada
tabung yang lain tidak terdapat gelembung udara.
 Gelembung udara

E.coli
Hal tersebut menunjukkan bahwa E.coli dapat memfermentasikan laktosa yang
terdapat pada media menjadi asam dan menghasilkan gas. Pada tabung yang berisi
mikroba lain tidak terjadi hasil uji yang positif. Hal tersebut dapat dikaranakan
mikroba yang dipakai tidak dapat memfermentasikan mikroba, atau terjadi
kesalahan dalam prosedur.
 BAB V

KESIMPULAN
Uji fisiologis digunakan untuk mengetahiu kegiatan enzimatik mikroba baik
secara langsung maupun tidak langsung seperti:
1. Fermentasi laktosa, sukrosa, dan dextrose
Uji positif : Saccharomyces cereviceae, Acinetobacter, Sthapylococcus
aureus, dan E.coli
2. Penggunaan sitrat sebagai sumber carbon
Uji positif : E.coli
Literatur: E.coli (negative)
3. Hidrolisis Pati
Uji positif : Candida albicans, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, dan
Acinetobacter,
4. Oksidase
Uji positif : Pseudomonas putida dan Acinetobacter
5. Motilitas mikroba
Uji positif : Candida albicans, Bacillus subtilis, dan E.coli

Kesalahan dalam percobaan diduga karena kesalahan prosedur dan kurang

sterilnya dalam percobaan ataupun biakan.
 Daftar Pustaka

Anonim. 2009. Uji-Uji Biokimiawi Enterobacteriaceae.

Anonim, 2006. SNI 01-2332.1-2006, Cara uji mikrobiologi – Bagian 1:

Penentuan coliform dan Eschericia coli pada produk perikanan. Standar
nasional Indonesia, Jakarta.

Alexander, Steve K. 2001. Microbiology a Photographic Atlas for the

Laborabory. Canada: Daryl Fox

Dwijoeseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang

Karliana, Itjeu. 2009. Identifikasi Mikroba Air Laut Di Ujung Grenggengan

Semenanjung Muria. Batan: Pusat Teknologi Reaktor dan Keselamatan
Nuklir.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang:

Malang