Professional Documents
Culture Documents
2. Toxoplasmoza ............................................................................................ 8
3. Giardioza ……………………………....................................................... 15
4. Criptosporidioza……………………......................................................... 21
Bibliografie........................................................................................................................ 27
2
1. Rolul biologiei moleculare în parazitologia veterinară
c) epidemiologia parazitozelor;
d) imunitatea antiparazitară;
f) precizarea diagnosticului;
3
În 1970 s-a descoperit că bacteriile produc enzime capabile de a degrada ADN
străin ajuns intrabacterian. Activarea acestor enzime joacă un rol cheie în fenomenul
cunoscut ca ,,restricţia gazdei” (ce constă în autoprotecţia bacteriilor faţă de virusuri, prin
fragmentarea ADN-ului viral), ele sunt denumite enzime de restricţie sau enzime
restrictive. Azi sunt cunoscute sute de asemenea enzime. Aceste enzime se fixează pe
secvenţele specifice ale ADN, fenomen denumit ,,recunoaşterea secvenţelor” şi fiecare
enzimă scindează ADN într-un loc specific de clivaj, localizat de obicei în secvenţa
recunoscută. Când o enzimă de restricţie este fixată pe ADN, acesta este clivat în mai
multe locuri şi astfel ADN este fragmentat. Dacă locurile de clivaj nu sunt poziţionate la
intervale regulate, de-a lungul moleculei de ADN, fragmentele rezultate au lungimi şi
greutăţi diferite. Electroforeza pe gel a acestor fragmente evidenţiază migrarea
fragmentelor cu o rată invers proporţională cu logaritmul greutăţii lor.
Un alt mijloc prin care operează biologia moleculară este producţia unui număr
nelimitat de copii ale unui anumit segment de ADN. Această producţie de masă, a unui
segment de ADN este o condiţie necesară pentru determinarea secvenţei de bază a
segmentelor şi pentru multe alte tehnici moleculare. Obţinerea copiilor se poate realiza pe
două căi:
4
întreg genom este format numai din ARN. Deoarece ARN nu este capabil de replicare,
singura cale posibilă de replicare a acestor virusuri este ca ele să-şi propage propriul
ARN, prin reconversia lui în ADN, motiv pentru care se numesc ,,retrovirusuri”. ADN-ul
se replică şi acţionează ca un şablon pentru sinteza unei cantităţi mai mari de ARN.
Enzimele care catalizează transcripţia inversă a ARN în ADN sunt numite ,,revers
transcriptaze”. Aceste enzime sunt extrem de importante în biologia moleculară pentru că
permit izolarea rapidă a regiunilor codificate ale genelor.
Una din cele mai importante realizări ale biologiei moleculare a fost dezvoltarea
metodelor pentru o rapidă secvenţiere a fragmentelor de ADN. Această separare a fost
folosită în scop diagnostic şi s-a realizat prin două metode:
Prima este folosită mai des în practică. Pe această cale se alcătuieste genomul unei
specii. Astfel se ajunge la stabilirea genomului paraziţilor si al altor agenţi patogeni.
Genomul poate fi un nou potenţial mijloc de control al acestor organisme.
Reacţia în lanţ a polimerazei (Polymerase chain reaction - PCR) Unul din cele
mai importante instrumente de lucru în biologia moleculară este PCR, folosit larg în
prezent pentru cercetare şi diagnostic în detectarea genelor particulare (atât benefice cât şi
5
ori alte ţesuturi), sau un fragment de ADN din orice altă sursă. Prin PCR s-au creat
aproximativ un milion de copii ale unor segmente mici de ADN şablon, suficient pentru a
permite ca segmentul să fie clonat sau analizat. Cerinţa de bază este cunoaşterea
secvenţei fragmentului sau ordinea la fiecare capăt al segmentului pe care dorim să-l
amplificăm. Folosind această informaţie sunt sintetizate două lanţuri de nucleotide
(numite oligonucleotide sau oligo, prescurtat), fiecare cu o lungime de 20 de baze, unul
este complementar capătului al treilea al segmentului ce trebuie amplificat, iar altul este
complementar unui alt capăt trei al altui segment. Deoarece rolul acestor oligonucleotide
este de a amorsa sinteza de noi lanţuri (strands) de ADN, ele sunt numite ,,primeri”.
segmentului.
6
din produsele animale (carne, ouă), sau din specimenele din muzee sau arheologice.
Probele pot fi la fel de mici ca un spermatozoid, sau un folicul pilos. Produşii PCR pot fi
obţinuţi chiar din lapte, deoarece laptele conţine celule somatice.
Există mai multe variaţii ale PCR de bază. De exemplu, câteva perechi de primeri
pot fi incluşi într-o reacţie PCR multiplex. O altă variantă este cea care dă naştere la
ADN polimorfic amplificat la întâmplare (RAPD) (polimorfic se referă la existenţa a mai
mult decât un tip de formă). La câteva specii RAPD sunt o sursă utilă de markeri ADN
pentru hărţile genetice sau (în cazul paraziţilor) pentru identificarea speciilor.
O altă variantă implică transcripţia inversă a unei probe de ARN, pentru a produce
cADN, care este apoi amplificată prin PCR, metodă cunoscută ca transcripţia inversă a
PCR (reverse transcription PCR) (RT-PCR). Este un eficace mijloc de identificare şi
studiu al genelor, fără a recurge la procesul de clonare.
7
3. compararea speciilor din acelaşi gen, sau suselor din aceeaşi specie;
Cel mai simplu test de diagnostic implică amplificarea unui anumit segment de
ADN, urmată de electroforeză pe gel şi colorarea gelului în bromură de etidium
2. Toxoplasmoza
8
Boala este produsă de Toxoplasma gondii, încadrat în familia Sarcocystidae,
subfamilia Toxoplasminae, genul Toxoplasma.
Numărul de specii afectate este foarte mare. Cu toate acestea, boala cu manifestări
clinice este rară, predominînd infecţiile subclinice. Toxoplasma gondii având o
specificitate strânsă pentru gazda afectează peste 200 de specii de vertebrate homeoterme
şi chiar heteroterme. Cele mai receptive sunt: şoarecele, iepurele, cobaiul, apoi oaia,
carnivorele, mai rezistente fiind bovinele şi cabalinele.
În cadrul speciilor, animalele tinere sunt cele mai receptive, acestea prezentând
manifestări clinice (toxoplasmoză), în timp ce adulţii realizează infecţii subclinice. De
asemenea, sunt mai receptive animalele cu rezistenţă scăzută, mai ales cele
imunosupresate.
9
Forma acută - se constată: pneumonie fibrinoasă; focare necrotice miliare,
albicioase şi granuloame diseminate în ficat, encefal, limfonoduli; uneori se poate găsi
degenerescentă hepatică, miocardică şi splenomegalie; enterită, ulcere gastro-intestinale,
ulcerele având marginile regulate şi centrul granular; sub membrana bazală a epiteliului
vilozităţilor se găsesc chisturi toxoplasmice, înconjurate de o reacţie limfohistiocitară;
ulcere gingivale, pe buze şi pe marginile limbii la câine; echimoze cutanate şi musculare,
coroidită, glioame în creier, pericardită, miocardită, hepatită şi splenomegalie;
10
Dintre testele clasice, în laboratoarele de diagnostic se utilizează:
11
Fig. 1 Fig. 2
Preparate fixate în formalină, coloraţie imunofluorescentă (IFA): fig. 1 – reacţie pozitivă IFA pentru
tachizoiţi de T. gondii (anticorpi anti-IgG marcaţi fluorescent legaţi de anticorpii cuplaţi cu tachizoiţi); fig.
12
aminosalicilic sau de paranitrofenilfosfat. Pentru fiecare ser de cercetat se efectuează
două teste la aceeaşi diluţie.
Azi, pentru a uşura munca şi pentru a cîştiga timp se folosesc kiturile. Un astfel de
exemplu este ImmunoComb. Acesta este un test ELISA calitativ şi este un card de plastic
de forma unui pieptene, alcătuit din 12 dinţi, pe care sunt ataşate antigene purificate de T.
gondii şi Clamydia, fiecare dinte corespunzând unei singure probe. Acesta se introduce
succesiv în cuvele unei plăci multicompartimentate, care conţin: ser de cercetat, soluţie
de spălare, anticorpi anti- IgG cuplaţi cu enzimă şi substrat.
13
codificatoare a antigenului major de suprafaţa P30 prezentă într-o singură copie pe
organism, sau gena B1 înalt repetitivă (o genă specifică T.gondii care codifică o proteină
reactivă necunoscută din serul sanguin). Aproximativ 35 de copii a genei B1 sunt
prezente în genomul T. gondii , dar această genă este absentă în celulele de mamifere.
Tehnica PCR este o metodă de detecţie rapidă si de acurateţe pentru T.gondii din
ţesuturile animale, în special atunci cînd doar o mică cantitate de ţesut este disponibilă.
Metoda a fost folosită cu succes pe sânge periferic, lichid cefalorahidian, lichid amniotic,
ţesut cerebral, corp vitros, umoare apoasă, lavaj bronhoalveolar şi urină.
Tehnica PCR este cea mai utilă, mai ales în stabilirea diagnosticului de infecţie
acută. Diagnosticul toxoplasmozei acute nu trebuie făcut numai pe baza unui test PCR
pozitiv, el trebuie coroborat cu prezentarea clinică şi alte metode.
Testul RIF (Remington) care decelează anticorpii IgM, este folosit pentru
diagnosticul infecţiei acute. Anticorpii IgM apar în primele 5 zile de la infecţie şi dispar
precoce. Reacţii fals pozitive pot fi date de factorul reumatoid, de IgG anti-toxoplasma
care pot bloca detectarea anticorpilor IgM. Unii bolnavi cu imunodepresie, cu
toxoplasmoză acută şi majoritatea celor cu toxoplasmoză oculară activă, pot să nu aibă
anticorpi IgM, evidenţiaţi prin RIF.
Testul de aviditate
Măsurarea avidităţii IgG specifice pentru T. gondii, s-a dovedit a fi foarte utilă în
diferenţierea infestaţiilor recente de cele vechi. Definită ca fiind puterea cu care se leagă
IgG de antigen, aviditatea IgG se maturează cu odată cu timpul scurs de la infecţia
primară. Astfel, IgG produse în primele luni după infecţia primară au o aviditate scăzută,
faţă de IgG produse după mai multe luni sau chiar ani, care au o aviditate mult mai mare.
O serie de cercetători au arătat că detectarea IgG specifice T. gondii avînd aviditate mică,
reprezintă un indicator de încredere pentru o infecţie nu mai veche de 8 luni. Însă,
detectarea IgG specifice pentru T. gondii cu aviditate mare, este mai mult informativ
14
pentru stadiul clinic, astfel prezenţa lor nu indică vechimea exactă a bolii, ci faptul că
boala este mai veche de 5 luni.
3.Giardioza
Este o zoonoză digestivă cu tabloul clinic polimorf la om, dar puţin cunoscută la
animale. În ultimii ani sunt semnalate îmbolnăviri la tineret (căţel, pisică, iezi, miei) cu
sindrom diareic.
Etiologie. Sunt mai multe specii din genul Giardia (din fam. Hexamitidae) însă
datele recente de literatură pun sub semnul incertitudinii specificitatea parazitismului,
considerând posibilă transmisibilitatea interspecifică. Astfel, prin analize comparative de
ADN la Giardia provenite de la specii de animale, s-au stabilit că unele au afinitate,
evidenţiind trei genotipuri. Unul, cu speciile de la cal, porc şi rumegătoare,
nediferenţiabile de Giardia intestinalis, parazit la om. Acest tip are spectru larg de
specificitate de gazdă, cu risc zoonotic pentru om. Alte izolări de Giardia de la şoarece,
cal şi oaie au slabă afinitate de genotipul de G. intestinalis. Al treilea genotip, semnalat la
rumegătoare, purcel, alpaka, diferă distinct de G. Intestinalis. Giardiile se prezintă ca
trofozoiţi, în faza endogenă şi chisturi, formele de rezistenţă, exogene.
- G. psittaci- la papagal.
15
Chistul oval, cu dublă membrană transarentă, conţine 2-4 nuclei şi falgelii dispuşi
în diagonală cu aspect sinuos. Chisturile măsoară 10-15/7-10 µm. Există chisturi atipice,
cu contur neregulat, considerate degenerate.
16
Imunitate. Giardiile elimină antigene de secreţie şi excreţie ce induc reacţii
mediate velular şi umoral, ca imunoglobuline: locale IgA, serice IgG şi IgM. Au şi efect
hipersensibilizant datorită IgE.
La viţei, în ferme de vaci infectate (circa 10%), boala se manifestă la vârsta de 1-5
luni, prin diaree şi slăbire.
Mulţi dintre copiii sau adulţii infectaţi cu Giardia lamblia nu prezintă simptome
de giardioză, chiar dacă sunt infectaţi şi parazitul este prezent în materiile fecale. Aceste
persoane pot transmite boala.
17
este un semn că grăsimile nu sunt digerate corespunzator şi sunt transferate din organism
în scaun
- fatigabilitate.
De cele mai multe ori, persoanele infectate nu caută un tratament pentru aceste
simptome. De cele mai multe ori simptomele se amelioreaza de la sine. Dar dacă
giardioza nu este tratată de la apariţia primelor simptome, boala poate dura o perioadă
lungă de timp şi se poate croniciza. Persoanele cu giardioza cronică prezintă atacuri
diareice care apar şi dispar însoţite de simptomele descrise. Aceste episoade alternează cu
perioade de constipaţie sau un tranzit intestinal normal şi durează doar câteva zile când
apar.
Din aceste motive, aceştia nu se adresează la medic pentru tratament. Simptomele
de giardioza cronică sunt:
• scaune moi, grase, nelegate (nu mereu lichide sau apoase), uneori scaunele pot fi
urât mirositoare sau spumoase şi de cele mai multe ori în cantitate mică
• disconfort abdominal sau iritaţii gastrice care sunt mai frecvente după mese
• flatulenţă
• scăderi în greutate
Simptome la copil
18
Dacă sunt prezente simptome, acestea sunt:
Simptomele de giardioza apar de obicei la 7-10 zile după infectare, deşi uneori pot
dura 35 de zile sau mai mult. Odată ce au apărut, simptomele durează cel puţin 7
săptămâni:
Nou născuţii şi sugarii care fac giardioza pot refuza alimentele şi se pot opri din
creştere până în momentul în care se vindecă boala. Creşterea normală şi dezvoltarea
19
organismului nu se produc imediat dar pot să reînceapă în câteva săptămâni sau luni.
Studiile au arătat că este posibil ca o persoană care a fost infectată cu giardioză să
dezvolte o imunitate pe termen scurt faţă de parazit.
• cei ce lucrează în centre de îngrijire pentru copii, mai ales dacă majoritatea nu ştiu
să folosească toaleta
• cei care înnoată în ape de agrement cum ar fi râuri, lacuri, ape curgătoare, mai
ales în timpul verii sau toamnei când există riscul cel mai mare de expunere.
Riscul apare în momentul înghiţirii apei în timpul înotului
• cei care consumă apă netratată sau tratată insuficient, mai ales din apele
curgătoare, râuri, lacuri
• cei care locuiesc sau lucrează în diferite amplasamente sau centre de îngrijire sau
sunt rude cu unul dintre aceşti angajaţi
• existenţa unei scăderi a imunităţii. Există două afecţiuni, care sunt considerate că
produc modificări ale sistemului imun şi cresc în special riscul de apariţie a
simptomelor de giardioza, numite imunodeficienţă comună variabilă şi
agamaglobulinemia X- linkata
• existenţa unor boli care afectează tranzitul intestinal şi fac intestinul mai
susceptibil la infecţie cum ar fi boala Crohn sau fibroza chistică existenţa
malnutriţiei înainte de infectare tratamentul chirurgical pentru stomac cu o
perioadă scurtă înaintea infectării sau tratamentul medicamentos cu antiacide
gastrice. Acest lucru constituie o problemă întrucât stomacul secretă o cantitate
20
mai mică decât normalul de acid (aciditatea gastrică omoară unele
microorganisme).
- anamneza istoricului medical sau examen obiectiv. Dacă acestea sugerează simptome de
giardioză, unii doctori prescriu un singur tip de tratament până a recomanda alte
investigaţii
-analizele scaunului (examen coproparazitologic)
-teste antigenice care detectează proteine (antigene) de Giardia
-recoltarea directă din intestin, care se face dacă examenul coproparazitologic este
neconcludent. Acest test recoltează o probă din intestinul subţire astfel încât poate fi
examinat pentru a se observa parazitul. Acest test se face foarte rar.
Lichidele din partea superioară a intestinului subţire (lichidul duodenal) poate fi
de asemenea examinat la microscop pentru a se vizualiza parazitul sau se face un test de
identificare a antigenelor parazitare. Lichidul duodenal este colectat prin endoscopie.
Alte investigaţii care determină giardioza sau alte boli asemănatoare se vor face dacă
persistă simptomele pe o perioadă lungă de timp, mai ales dacă apar probleme în urma
malabsorbţiei. Aceste teste se fac pentru a se examina intestinul subţire (partea superioară
gastrointestinală) sau pentru a se preleva o probă (biopsie) din partea superioară a
intestinului subţire pentru a se izola microorganismul care produce infecţia.
4.Criptoporidioza.
21
medicilor în ultimele decenii, de când este mai des diagnosticată la copii şi animale cu
imunodeficit.
Merozoiţii eliberaţi din schizont sunt alungiţi, ovali, semilunari şi măsoară între 2-
3/0.7 µm.
22
1 µm şi un corpuscul rezidual. Sunt ataşaţi marginal în formă de U. Unele oochisturi nu
conţin sporozoiţi, interiorul lor este vacuolar, cunoscute “oochisturi fantomă” .
23
Epidermiologie. Se cunoaşte că infecţiile criptosporidiene sunt foarte răspândite
pe tot globul, afectând diverse grupe de vertebrate, cu contagiozitate accentuată. Sursele
de contaminare le constituie tineretul animal de fermă şi de apartament, precum şi copiii.
Animalele adulte şi omul sunt mai rar infectate, când este vorba de cazuri
imunodeficitare. Forma de contaminare o constituie oochistul care se transmite pe cale
bucală, dar este posibilă şi autoinfecţia enterală.
24
intestinale producând procese atrofice, de necrobioză, cu dispariţia enterocitelor fuzionale
şi hipertrofia celor limitrofe. Dezvoltarea criptosporidiilor pe segmentele intestinului
subţire şi gros induce sindrom de diaree care se caracterizează prin fenomene de
hipermotilitate, hipersecreţie, hiperpermeabilitate şi malabsotbţie.
25
general tabloul clinic este mai grav când criptosporidioza se manifestă imultan cu
colibaciloza, eneteroviroze sau alte parazitoze digestive.
Morbiditatea, variabilă, cuprinde 5% sau alteori depăşeşte 50% din efectiv, mai
ales la viţei, purcei şi miei. Mortalitatea poate cuprinde 5-60%.
Clinic, apariţia sindromului diareic neonatal până în jurul vârstei de 35-40 de zile
este comună şi altor afecţiuni. Pentru certitudine se recurge la examenul microscopic al
fecalelor, prin metode selective. Din probele de fecale se fac frotiuri şi se colorează prin
metodele: Ziehl-Nielsen modificată (Henricksen) – oochisturile apar roşii pe fundal
albastru; Gunther – oochisturile sunt roşii-violete pe fond albastru; carbol-fuxină.
La cadavre frotiurile se fac din raclat de mucoasă lezionată, însă în sezonul cald
trebuie avut grijă a le efectua în primele ore de la moarte, deoarece procesele de
putrefacţie lizează în circa 5-6 oochisturile. Examenul microscopic se face cu obiectivul
de 40x. Histologic, pe probe din segmente intestinale, bursa Fabriciu sau pulmonare,
recoltate imediat după maorte şi colorate cu H.E., PAS Giemsa, albastru de toluidină,
Masson, se evidenţiază pe suprafaţa eneterocitelor forme evolutive ale crisposporidiilor.
Din metode selective, cea mai eficientă este metoda Henricksen.
26
evoluţie mai gravă; eimerioze – debutul clinic este mai tardiv, după 1-21 zile de la
naşterea animalelor, diareea adesea hemoragică, mortalitate mai ridicată. În cazul
evoluţiei criptospordiozei asociate cu alte maladii se impun investigaţii paraclinice
suplimentare.
Bibliografie:
1. Hyman A. Jennifer, Johnson K. Linda, Tsai M.M., OʼLeary J.T., 1995, Specificity of
Polymerase Chain Reaction identification of Taxoplasma gondii infection in paraffin-
embedded animal tissues, J Vet Diagn Invest 7:275–278;
3. Şuteu I., Cozma V., 2004, Parazitologie Clinică Veterinară, Vol. 1, Ed. Risoprint,
Cluj-Napoca;
5. United States Animal Health Association, ed. 2008, Foreighn Animal Disease, Ed.
Boca Publications Group Inc., Canada;
6. World Organisation for Animal Health, 2008, Manual of Diagnostic Tests and Animal
Vaccins for Terrestrial Animals, ed. a 6-a, vol. 2, Paris, Franţa;
27
8. Dulceanu N. 2002, Rolul biologiei moleculare în parazitologia veterinară, Scienţia
Parasitologica 1, 35-42, Facultatea de Medicină Veterinară Iaşi;
9. www.3vet.ro;
10. www.wikipedia/criptosporidioza.com;
11. www.giardia.org.
28