Professional Documents
Culture Documents
Cromogénicos y
Fluorogenicos en el análisis
Microbiológico de Alimentos
1
La rá
rápida detecció
detección e identificació
identificación de los
microorganismos es muy importante en
diversos campos de aplicaciones e
investigació
investigación.
La incorporación de enzimas y substratos
en medios de cultivo selectivos puede
eliminar la necesidad de realizar
subcultivos y pruebas bioquímicas
adicionales para establecer la identidad
de ciertos microorganismos.
2
Aplicación de sustratos
cromogénicos y fluorogénicos
1. Detección directa de microorganismos en los
medios de cultivo.
7. Microscopía de Epifluorescencia.
8. Automatización. 3
Sustratos Fluorogénicos
Colorantes Fluorogé
Fluorogénicos
(8-
(8-anilino-
anilino-1-naphthalene-
naphthalene-sulphonic
acid,
acid, ANS)
pH-
pH-indicadores fluorescentes (acridine,
acridine,
7-hydroxycoumarin)
Indicadores Redox (azul de metileno,
verde de Janus, verde B, indigo
carmin)
Sustratos enzimaticos
4
Los sustratos La mayoría de sustratos
enzimá
enzimáticos enzimáticos fluorogénicos son
fluorogé
fluorogénicos derivados de la Coumarina, tal
como:
generalmente 4-methylumbelliferone (4-MU)
consisten de un 7-amido-4-methylcoumarin (7-
substrato especí
específico AMC)
para una enzima 4-trifluoro
especí
específica tal como methylumbelliferone (4-TMU)
una azú
azúcar o un
aminoá
aminoácido y un
fluoró
fluorógeno,
geno, siendo
capaz de convertir
la luz UV a luz
visible .
5
Ventajas de los sustratos metilumbelliferyl
(MUG)
Solubles en agua.
Estables al calor
Alta sensibilidad.
No riesgosos para la salud.
Precio rasonable .
Amplio rango de substratos
Métodos con aprobaciones (ISO, IDF, EPA)
6
Limitaciones de los sustratos Methylumbelliferyl
• Requieren luz UV
pH dependientes
Fuerte difusió
difusión
7
Sustratos Cromogénicos
8
o-, & p-nitrofenol,
p-nitroanilina (PNA),
5-bromo-4-chloro-3-indolyl (X),
5-bromo-6-chloro-3-indolyl (magenta),
6-chloro-3-indolyl (salmon), O2
Demanda de O2
9
10
MEDIOS QUE CONTIENEN SUSTRATOS
FLUOROGENICOS Y CROMOGENICOS
Alimentos
E. coli & coliformes
E. coli O157:H7
Enterobacteriaceae
Salmonella spp.
C. perfringens
L. monocytogenes
Enterococcos
11
Medios Cromogénicos de Merck
Rambach®
Rambach® Agar Standard ISO 6579
Method Salmonella
Chromocult®
Chromocult® TBX Agar Standard ISO 16649
Method E.coli
Chromocult®
Chromocult® Standard ISO 11290 and
Listeria Selectiv Agar Method FDA/BAM
L.Mono
Chromocult®
Chromocult® Standard ISO TS 22964
Enterobacter Sakazakii Agar Method E. Sakazakii
Chromocult®
Chromocult® Coliform Agar Approved EU Directiva on
Alternative Drinking Water
Method US-
US-EPA
AOAC pendiente
Chromocult®
Chromocult® Coliform Agar ES Approved AOAC pendiente
Alternative
Method
Chromocult®
Chromocult® Enterococci Agar Approved EU Directive on
12
Alternative Drinking Water
Method
Coliformes
Enterobacteriaceae
13
E.coli/Coliforms
14
Normas : ensayos fluorogénicos
Para leches y productos lácteos, helados de crema, alimentos
para bebes y niños a base de leches se basan en DIN 10
183 parte 3
• " El método de La Fluorescencia-optica para la
determinación de E. coli es la determinación paralela de
bacterias coliformes”
• Fluorocult® Lauryl Sulphate broth (Cat. No.
1.12588)
15
Producción de Gas y ácido a partir de
lactosa
Ewingella
Citrobacter Moellerella
Yersinia Leclercia
Serratia
Canella
Yokenella
Hafnia
18
Enterobacteriaceae y grupo 'coliformes'
(cepas lactosa-positivas)
Género Detectado por Origen
Enteropatogé
Enteropatogénica
'coliform test' fecal para el hombre
19
Agar Chromocult® Coliform ES
Agar cromogénico para la detección simultánea y recuento
Total de coliformes y E. coli en muestras de alimentos.
Coliforms
E.coli
21
E. coli
ß-D-glucuronidasa
Presente en el 94-97% de cepas de E. coli
Sólo pocas cepas de Salmonella, Shigella
and Yersinia producen la enzima también.
Otras especies de Escherichia spp. no
producen esta enzima
22
coli)) es
La actividad ß-D-glucuronidasa (E. coli
medida usando diferentes sustratos
cromogé
cromogénicos y fluorogé
fluorogénicos tales como
p-nitrophenol-
nitrophenol-ß-D-glucuronide (PNPG)
5-bromo-
bromo-4-chloro-
chloro-3-indolyl-
indolyl-ß-D-glucuronide (BCIG)
phenolphtalein-
phenolphtalein-mono-
mono-β-D-glucuronide
4-methylumbelliferyl-
methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (MUG)
8-hydroxyquinoline-
hydroxyquinoline-ß-D-glucuronide (HQG)
6-Chloro-
Chloro-3-indoxyl-
indoxyl- ß-D-glucuronide (Salmon-
Salmon-glu),
glu),
5-bromo-
bromo-6-chloro-
chloro-3-indoxyl-
indoxyl- ß-D-glucuronide
(magenta-
(magenta-glu)
glu)
23
Medios cromogé
cromogénicos
sólo para E.
E. coli
Agar TBX
TBX es una modificació
modificación de Agar Tryptone Bilis al
cual se le adicionado el substrato 5-bromo- bromo-4-
chloro-
chloro-3-indolyl-
indolyl-ß-D-glucuronido (X-
(X-GLUC or BCIG)
GUD liga el sustrato cromogé
cromogénico BCIG y libera
color originando colonias azul-
azul-verdosas fáilmente
distinguibles y fácil de leer de E.coli.
E.coli.
Medio Fluorocult
24
Agar Chromocult TBX E.Coli
acc. ISO 16649
25
Antecedentes
26
Normas
Identificación Enzimática
E. coli (ß-D-glucoronidasa)
Sustrato
FLUOROGENO
FLUOROGENO oEnzima
o
Cromógeno Azul-verdoso
CROMOGENO
CROMOGENOSUSTRATO
ENZIMA
ENZIMA SUSTRATO
X- ß-D-Glucoronidasa
Gluc
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucoronic Acid (X-GLUC)
29
Procedimiento Chromocult TBX E.coli
Recuento en placa .
1 ml Muestra + 15 ml
Pesar 36.6 gr/L de A
Cromocult TBX Cromocult TBX.
45-50°C - Placa
E.Coli subletalmente Alimentos frescos
injuriada. o materias primas
Incubar 37 0 30°C
Incubar 44°C
por 4 horas
por 18-24 horas
luego 44°C x 18-20 horas
1 Día
Cambio de Color
Negativo Positivo
Cambio de Color
Negativo Positivo
Literature
•Draft International Standard ISO/DIS 16649-2: Microbiology of food and animal
feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of presumptive Escherichia
coli; Part 2: Colony-count technique at 44 °C using 5-bro mo-4-chloro-3-indolyl-ß-
D-glucoronic acid (1999).
32
Agar Chromocult® TBX E.Coli.
Metódos de sustrato definido.
•Reacción sustrato
Enzima muy
Selectivo
Selectivo específica
•Detección E.coli
en 24 horas para
Rápido
Rápido bacterias
enjuriadas o no..
•Simple detección
por cambio de
Item Descripción Envase
Fácil
Fácil lectura
lectura color
1.16122.0500 Agar Chromocult® TBX 500 Gr
E.Coli
1.10687.0500 Caldo glutaminato DEV 500 Gr
•Reducción de
1.01614.1000 Agar-Agar 1 Kgr Económico
Económico tiempo y material.
33
Agar Chromocult® TBX E.Coli.
Costo Prueba 2008-2009
RENDIMIENTO Y COSTO PRUEBA : EVALUACIÓN DE E.COLI en ALIMENTOS CON el MEDIO CROMOGÉNICO TBX
COSTO PRUEBA TOTAL EN SOLES INCLUIDO 02 diluciones (1/10, 1/100 ó 1/100 , 1/1000)
1.86 Nuevos Soles
34
E. coli/coliforms media
35
E. coli O157:H7
Medio Composición Referencias
Comparative evaluation of different chromogenic/fluorogenic media for detecting Escherichia coli O157:H7 in food.
37
Int J Food Microbiol 2001 Dec 30;71(2-3):257-62.
Fluorocult® Caldo LMX Coliformes
modificado por MANAFI and OSSMER .
Identificación Enzimática
Coliformes Totales (ß-D-galactosidasa)
Sustrato
FLUOROGENO Enzima
oo
Cromógeno Verde
FLUOROGENO
CROMOGENO
ENZIMA
ENZIMA SUSTRATO
CROMOGENOSUSTRATO
Coliformes (Positivo ß-D-galactosidasa)
ß-D-
X-Gal Galactosidasa
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside (X-GAL)
39
Fluorocult® Caldo LMX Coliformes
modificado por MANAFI and OSSMER .
Identificación Enzimática
E. Coli (ß-D-glucoronidasa)
Substrato
FLUOROGENO Enzima
oo
FLUOROGENO
Fluorógeno : Fluorescencia
ENZIMA
ENZIMACROMOGENO
CROMOGENO SUSTRATO
SUSTRATO
ß-D-Glucoronidasa
MUGa UV: 365 nm
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucopyranoside (MUG)
40
Fluorocult® Caldo LMX Coliformes
modificado por MANAFI and OSSMER .
NMP
Pesar 17 gr/L de
Tubos multiples con 10 ml Fluorocult Fluorocult Caldo
caldo LMX a simple concentración LMX a simple
1, 0.1, 0.01 ml muestra 35°C concentración.
Alto Gram + : 30 mg
Novobiocina en 1
Litro de medio antes
de autoclavar)
1 Día
PH medio para ver
Fluorescencia: 9-10.
Literature
• HAHN, G., a. WITTROCK, E.: Comparison of chromogenic and fluorogenic substances for differentiation of Coliforms and Escherichia coli in soft
cheeses. - Acta Microbiologic Hungarica 38 (3-4); 265-271 (1991).
• MANAFI, M., a. KNEIFEL, W.: Ein kombiniertes Chromogen-Fluorogen-Medium zurm simultanen Nachweis der Coliformengruppe und von E. coli in
Wasser. - Zbl. Hygiene und Umweltmedizin 189; 225-234 (1989). MANAFI, M.: Schnellnachweis von Bakterien mittels fluorogener und
chromogener Substrate. - Forum Städte-Hygiene 41; 181-184 (1990).
• MANAFI, M.: Diagnostik von Mikroorganismen mittels fluorogener und chromogener Substrate. - Ernährung/Nutrition 15, Nr. 10 (1991) MANAFI,
M., a. KNEIFEL, W.: Fluorogenic and chromogenic substrates. - A promising tool in Microbiology. - Acta Microbiologica Hungarica 38 (3-4); 293-304
(1991).
• MANAFI, M., KNEIFEL, F., a. BASCON, S.: Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnosis. - Microbiol. Rev. 55; 335-34842
(1991).
• OSSMER, R.: Simultaneous Detection of Total Coliforms and E. coli-Fluorocult LMX-Broth. - 15th international Symposium/FOOD MICRO 1993.
Fluorocult® Caldo LMX Coliformes
modificado por MANAFI and OSSMER .
•Reacción sustrato
Enzima muy
Selectivo
Selectivo específica
•Detección
simultanea de
Rápido
Rápido Coliformes y
E.coli en 24h.
•Simple detección
por cambio de
Item Descripción Envase Fácil
Fácil lectura
lectura color diferencia
1.110620.0500 Fluorocult Caldo LMX 500 Gr
Coliformes los Coliformes y
1.09293.0100 Reactivo de Kovac’s 100 ml E.Coli
•Requiere solo un
B491207 Novobiocina 1 gr, Económico
Económico medio.
10 gr •Reducción de
1.13203.0001 Lampara UV 365 nm 1 UN
tiempo y material -
No usa tubos 43
Durhan.
Los medios convencionales
convencionales para la
dtección de Salmonella han tenido pobre
dtecció
especificidad ocasionando una alta tasa
de falsos positivos (así
así como con
Citrobacter,, Proteus) .
Citrobacter
44
Salmonella
RAMBACH
45
Agar Rambach®
Métodos Tradicionales Desventaja:
para Salmonella se basan
en la reacción del H2S : Citrobacter y Proteus: parecidos
a Salmonella
Alto número de falsos - positivos
47
AISLAMIENTO DE Salmonella EN ALIMENTOS
BISMUTH
XLD HEKTOEN SULFITE RAMBACH
48
Composición de los Medios de Cultivo
XLD BISMUTO SULFITO XLT 4 Hektoen Rambach
25 g/ml de muestra
en caldo SALMOSYST® por 6 h a 35 - 37°C
Agar RAMBACH®
Día por 24 h a 35 - 37°C
2
50
52