Universidad de Concepción

Facultad de Ciencias Biológicas

Departamento de Microbiología

LABORATORIO N° 6: DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD BACTERIOLOGICA DEL AGUA.

Margarita Isabel Torres Cañete.
1 de junio de 2011

INTRODUCCIÓN.

La monitorización y detección de los microorganismos indicadores y causantes de

enfermedades son parte importante de la microbiología sanitaria. Las bacterias alóctonas constituyen
uno de los contaminantes biológicos más importantes de los sistemas acuáticos (Willey, J. 2009).
Debido a la contaminación del agua con residuos fecales humanos y de otros animales ha
aparecido un amplio rango de enfermedades víricas, bacterias y de protozoos. Aunque muchos de estos
patógenos se pueden detectar directamente, los microbiólogos ambientales han utilizado generalmente
los organismos indicadores como un índice de posible contaminación del agua por patógenos humanos.
Entre éstos, Escherichia coli y Enterococcus son utilizados convencionalmente como
indicadores de riesgo potencial de la presencia de bacterias patógenas como salmonella sp. y de otros
patógenos intestinales.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Muestra de agua, serie de 3 tubos con caldo LST, serie de 3 tubos con caldo bilis verde brillante, serie
de 3 tubos con caldo EC, pipeta Pasteur, pipetas graduadas, mechero.
Método de tubos múltiples.

Se siembra una series de 3 tubos con 10 ml de la muestra de agua, luego una serie de 3 tubos
con 1 ml y por último una serie de 3 tubos con 0.1 ml. Los tubos contenían campana de Duran y caldo
Lauril Sulfato Triptosa (LST). Este medio es recomendado por A.P.H.A. para detección y recuento
de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos (www.britanialab.com).

Este medio es rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los microorganismos
fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos. Contiene triptosa que es la fuente de
nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales
de fosfato proveen un sistema buffer y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Es un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante.
Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las
campanas Durham. (members.fortunecity.es).

Los tubos fueron incubados a 37ºC por 48 horas.

Prueba Confirmativa.

Después de incubar en caldo LST, se transfirieron todos los tubos gas positivo (se tomaron 2
gotas de cada cultivo) a caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB) y a caldo EC.

El caldo LBVB esta compuesto por peptona (aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano), bilis, verde brillante (ambos son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo
de bacterias Gram (+) y Gram (-) a excepción de coliformes) y lactosa que es el hidrato de carbono
fermentable. (www.britanialab.com). Este medio esta recomendado para el recuento de coliformes
totales y fecales, por la técnica del número mas probable.

El caldo EC contiene tristona o tripticasa, sal biliar nº3, lactosa, fosfato dipotásico hidrogenado, fosfato
de potasio dihidrogenado, cloruro de sodio

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 Se considera positivo para el grupo de coliformes totales, a los organismos que pueden crecer y
producir gas dentro de las 48±2 hr. a 35±0.5ºC cuando se incuban en este caldo.

3.2 Lectura de los resultados

Registre el número de tubos gas positivo de cada dilución. De la tabla NMP (Anexo
1), determine el valor NMP para el test.

4. Determinación de Eschetichia coli.

4.1 Al mismo tiempo que se utiliza como procedimiento presuntivo el caldo Lauril
Sulfato Triptosa (LST), se transfiere una asada de cada suspensión a tubos de caldo
E.C. con campana, (conjuntamente con la siembra de los tubos de confirmación).
Incubar en baño maría termorregulado a 44.5±0.2ºC durante 24±2 hr. El agua debe
tener un nivel más alto que el nivel del caldo del cultivo en los tubos.

La producción de gas, se interpreta como una reacción positiva que indica coliformes
de origen fecal.

RESULTADOS.

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CONCLUSIÓN.

Para poder determinar el número más probable de microorganismos debemos considerar que
tipo de población vamos a estimar y cuál es el objetivo del recuento para así escoger el medio de
crecimiento adecuado, ya que este método se basa en la presencia o ausencia de microorganismos en
los cultivos replicados. (Madigan, M. et al. 2006). Por este motivo en el laboratorio se utilizo agar R 2A,
nuestra muestra era ambiental, y el sustrato es el ideal para estas bacterias por su baja concentración de
nutrientes.
El método de recuento en placa por diseminación en superficie es más costoso y tedioso; se
utilizan ocho placas, las cuales hay que contarlas y sacar un promedio. En cambio el método de
recuento en placa por siembra de microgota es mas practico para el investigador y con menos costo al
solo utilizarse una placa.
El método por siembra de microgotas fue mucho más sencillo contar y en menos tiempo, las
colonias crecen en menor cantidad pero igualmente representativas de la muestra, la ventaja principal
de este método es mayor cantidad de replicas y a la vez se ahorra en material.
La determinación de la densidad óptica con espectrofotometría es mucho más exacta en cuanto
a cantidad de bacterias ya que con los métodos anteriores el conteo es al ojo, es una aproximación
según el criterio del observador. La densidad de la población bacteriana es directamente proporcional a
la absorbancia, a mayor concertación de la muestra mayor su capacidad de absorber la luz emitida por
el espectrofotómetro, en este caso las concentraciones más elevadas contenían mayor número de
bacterias y se observa en la turbidez de los tubos. El único defecto de este método es que se debe
conocer la curva de crecimiento de la bacteria en estudio.

REFERENCIAS.

-Willey J., Sherwood L., Woolverton C., - 2009 – Microbiología de Prescott, Harley y Klein – Editorial
Mc Graw Hill – Madrid, España - 1088 páginas.
-http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/lauril.htm.
-http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebribilis.htm
-http://members.fortunecity.es/reop999/DETERMINACI%C3%93N.Y.CUANTIFICACI%C3%93N.
DE.COLIFORMES.Y.ESCHERICHIA.COLI.htm